Информация

Ин витро сглобяване на вируси

Ин витро сглобяване на вируси


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Способни ли са изследователите да събират вируси инвитро?

Например, аз си представям, че библиотека за фагов дисплей може да бъде генерирана чрез хвърляне в епруветка на капсидните протеини (или каквото имате) заедно със съответната ДНК, която ще се сглоби самостоятелно. Това правено ли е? Ако е така, дали това е техника, лесно приложима за широк спектър от вируси?


Да, и едно бързо търсене на вирусно in-vitro сглобяване ще доведе до много резултати. - това е малко по-сложно от това! - но обикновено не се прави като такова, което ще обясня. По принцип има четири неща, които може да искате да направите:

  1. Искате да създадете големи количества вирус и да го изучите. Ако е така, тогава всичко, което трябва да направите, е да заразите вашата клетъчна култура с вашия вирус и да го оставите да се репликира. Някои очевидно са по-лесни от други - от моя собствен опит, ХИВ е доста лесно, но хепатит С е истински PITA - но по същество това е всичко. Това очевидно предполага, че вече имате на разположение някакъв вирусен запас за инфекция. Можете също така да трансфектирате културата с вирусни плазмиди с пълна дължина, което ме води до...
  2. Искате да проучите някои специфични аспекти на вируса. Това е яко! Повечето хора не просто измислят вируси. Като цяло, за вируси, които хората могат да получат, обикновено се препоръчва/силно насърчавано да използвате само това, което ви е необходимо от съображения за безопасност. Така например можете да трансфектирате протеина, който смятате за важен, за да видите какво прави сам. След това можете да трансфектирате клетъчната култура с пълния вирус, но с един важен ген, нокаутиран. Преди правех един кръгов ХИВ, като използвах плазмид за ХИВ с пълна дължина без функциониращ ген на обвивката и друг плазмид за VSV обвивка; новите частици на ХИВ биха станали инфекциозни поради VSV гена, но след заразяването те вече нямаха този ген. По принцип, ограничена версия на вируса, което ме води до...
  3. Искате да направите вирусоподобни частици. Това са едни от най-добре наречените неща в науката и са точно това, което звучат – частици, които много приличат на вирус, но не са. Като цяло те са празни черупки. Можем да ги използваме за всякакви неща, от изследвания на ваксини до други гени и заболявания. Техниките могат да варират, но като цяло е подобно на горното.
  4. Искате да представите някои други ген към система от клетъчна култура, като се използва вирусен гръбнак за трансдукция; помислете "Искам да поправя тези клетки... завинаги." Обикновено тези вируси обикновено се основават на аденовирус или лентивирус (известен още като ХИВ), тъй като те ще вмъкнат своите гени в генома на клетката, така че генът ще продължи да съществува.

Точка 4 вероятно е най-близо до това, което конкретно имате предвид. Ето безплатен преглед за употребата и безопасността на ретровирусните вектори при хората, а ето и един чудесен при рибите. Що се отнася до кои вируси е приложимо, добре, това варира много в зависимост от вируса, хоста, културната система и т.н.


Ин витро сборка на ретровируси

Сглобяването, част от късните етапи на жизнения цикъл на ретровируса, започва, когато структурният полипротеин Gag се асоциира с вирусната геномна РНК. В крайна сметка повече от хиляда Gag молекули образуват сферичен незрял вирион. Узряването става скоро след или едновременно с пъпкуването на вируса и се инициира, когато Gag се разцепва от ретровирусната протеаза в съставните му протеинови домени. Смята се, че незрялото ядро ​​се разглобява и освободените СА протеини се сглобяват отново в морфологично различен зрял капсид. In vitro сглобяването с производни на Gag и CA се използва за изследване на ретровируси в продължение на повече от две десетилетия. В този преглед ние разглеждаме откриването и разработването на три основни моделни системи [вирус на човешкия имунодефицит тип 1 (HIV-1), вирус на саркома на Роус (RSV) и вирус на маймуна Мейсън-Пфайзер (MPMV)] и обсъждаме структурните характеристики и аспекти на пътя на ретровирусното сглобяване, които са били разкрити с помощта на in vitro сглобяване. Ние също така предлагаме два основни нерешени въпроса в областта и предлагаме бъдещи пътища за изследване.


Абстрактно

Вирусите са силно подредени супрамолекулни комплекси, които са еволюирали, за да се размножават чрез отвличане на машината на клетката гостоприемник. Въпреки че вирусите са много разнообразни, разпространявайки се през клетките на всички царства на живота, те споделят общи функции и свойства. Наред с общия интерес към вирусологията, фундаменталните вирусни механизми са от нарастващо значение в други дисциплини като биомедицината и (био)нанотехнологиите. Въпреки това, за да се използват оптимално вирусите и вирусоподобните частици, например като средство за насочено доставяне на лекарства или като градивни елементи в електрониката, е важно да се разберат техните основни химични и физични свойства и характеристики. В този контекст броят на проучванията, насочени към механизмите, управляващи вирусните свойства и процеси, наскоро нарасна драстично. Този преглед обобщава специфична част от тези научни постижения, по-специално насочени към физическите вирусологични подходи, насочени към разбиране на самосглобяването на вирусите и механичните свойства на вирусните частици. Използвайки физикохимична гледна точка, ние се фокусирахме върху фундаментални изследвания, предоставящи преглед на молекулярната основа, управляваща тези ключови аспекти на вирусните системи.

  • Вдъхновени от биология наноматериали & gt протеинови и вирусни структури
  • Нанотехнологични подходи към биологията & gt наномащабни системи в биологията

Ин витро сглобяване на вируси - Биология

Всички статии, публикувани от MDPI, са незабавно достъпни по целия свят под лиценз за отворен достъп. Не се изисква специално разрешение за повторно използване на цялата или част от статията, публикувана от MDPI, включително фигури и таблици. За статии, публикувани под лиценз Creative Common CC BY с отворен достъп, всяка част от статията може да бъде използвана повторно без разрешение, при условие че оригиналната статия е ясно цитирана.

Характерни документи представляват най-напредналите изследвания със значителен потенциал за голямо въздействие в областта. Основните доклади се изпращат по индивидуална покана или препоръка от научните редактори и се подлагат на партньорска проверка преди публикуване.

Характеристиката може да бъде или оригинална изследователска статия, съществено ново изследователско изследване, което често включва няколко техники или подхода, или изчерпателен обзорен документ с кратки и точни актуализации на най-новия напредък в областта, който систематично прави преглед на най-вълнуващите постижения в областта на науката. литература. Този тип хартия предоставя перспектива за бъдещи посоки на изследване или възможни приложения.

Статиите по избор на редактора се основават на препоръки от научните редактори на списания MDPI от цял ​​свят. Редакторите избират малък брой статии, публикувани наскоро в списанието, които смятат, че ще бъдат особено интересни за авторите или важни в тази област. Целта е да се предостави моментна снимка на някои от най-вълнуващите работи, публикувани в различните изследователски области на списанието.


Четива

По време на първата сесия инструкторите и студентите ще се представят. Инструкторите ще представят курса и ще разгледат изискванията и очакванията, посочени в учебната програма. След това инструкторите ще представят кратка лекция, очертаваща предисторията и основите на структурата и сглобяването на вируса. Накрая ще бъде представена темата за седмица 2.

Принципи на вирусната симетрия

Уотсън и Крик забелязаха, че вирусната нуклеинова киселина не може да кодира нито един протеин, достатъчно голям, за да затвори вирус, и предположиха, че множество идентични субединици се полимеризират в структура за съхраняване на вирусна нуклеинова киселина. Каспар и Клуг предложиха геометричен формализъм, наречен квазиеквивалентност, за да обяснят как 1) сферичен капсид може да бъде изграден от пентамери и хексамери и 2) протеин може да участва в нееквивалентни взаимодействия.

Каспар, Д. Л. и А. Клуг. „Физически принципи при конструирането на обикновени вируси.“ Cold Spring Harb Symp Quant Biol 27 (1962): 1-24.

Liddington, R. C., Y. Yan, J. Moulai, R. Sahli, T. L. Benjamin и S. C. Harrison. „Структура на маймунски вирус 40 с резолюция 3.8-A.“ природата 354 (1991): 278-84.

Вирусна кристалография и Cryo-EM

Кристалографията и напоследък криоелектронната микроскопия са техники, използвани за определяне на структурите на вирусите. По времето, когато Wikoff и колегите му решават структурата на цял вирус, HK97, това е най-голямата структура, решавана някога чрез кристалография. Cryo-EM, макар и с не толкова висока разделителна способност, предоставя информация от замразени хидратирани проби без нужда от кристали. Wu et al. определя структурата на херпес вирус и показва местоположението на субединиците в структурата.

Wikoff, W. R., L. Liljas, R. L. Duda, H. Tsuruta, R. W. Hendrix и J. E. Johnson. "Топологично свързани протеинови пръстени в капсида на бактериофага HK97." наука 289 (2000): 2129-33.

Wu, L., P. Lo, X. Yu, J. K. Stoops, B. Forghani и Z. H. Zhou. "Триизмерна структура на човешкия херпесвирус 8 капсид." J Вирол 74 (2000): 9646-54.

Капсидите трябва да бъдат изградени от съставните им части. Те се образуват без никаква външна помощ или енергия в процес, често наричан "самосъбиране". Prevelige и King разработиха една от най-ранните ин витро системи за сглобяване на икосаедричен вирус. Конуей и колегите използваха крио-ем за изследване на конформациите на вирусните капсиди, докато узряват с времето, процес, който води до разширяване и повишена твърдост на вирусната обвивка.

Конуей, Дж. Ф., Р. Л. Дуда, Н. Ченг, Р. В. Хендрикс и А. С. Стивън. "Протеолитичен и конформационен контрол на узряването на вирусния капсид: системата на бактериофага HK97." J Mol Biol 253 (1995): 86-99.

Prevelige, P. E., Jr., D. Thomas и J. A. King. "Фази на нуклеация и растеж в полимеризацията на обвивката и подединиците на скелето в икосаедрични прокапсидни черупки." Биофиз Дж 64, бр. 3 (1993): 824-35.

Разширявайки принципите, описани от Caspar и Klug, Ganser et al. предлагат модел на фулеренов конус за HIV ядрото. По-късно те доказват своя модел, използвайки усъвършенствана крио-ЕМ техника, наречена криотомография.

Ganser, B.K., S. Li, V. Y. Klishko, J. T. Finch и W. I. Sundquist. "Сглобяване и анализ на конични модели за ядрото на HIV-1." наука 283 (1999): 80-3.

Бенджамин, J., B.K. Ganser-Pornillos, W.F. Tivol, W.I. Sundquist и G.J. Jensen. "Триизмерна структура на вирусоподобни частици на HIV-1 чрез електронна криотомография." J Mol Biol 346 (2005): 577-88.

Вирусите са развили различни стратегии за вкарване на своите нуклеинови киселини в черупки. Бактериофагите обикновено използват предварително оформена протеинова обвивка, наречена прокапсид, в която ДНК геномът се изпомпва от комплекс от протеини, наречени портал и терминаза. Използвайки оптични пинсети, Smith et al. показват, че един такъв опаковъчен мотор е невероятно силен. Ретровирусите имат напълно различни механизми, базирани на взаимодействията между вторичната структура на РНК и протеините, които изграждат заобикалящата ги обвивка. Тези взаимодействия протеин-нуклеинова киселина са основен компонент от едновременното сглобяване и опаковане на ретровирус и неговия геном.

Д'Суза, В. и М. Ф. Съмърс. "Структурна основа за опаковане на димерния геном на вируса на миша левкемия Moloney." природата 431, бр. 7008 (2004): 586-90.

Smith, D. E., S. J. Tans, S. B. Smith, S. Grimes, D. L. Anderson и C. Bustamante. „Порталният двигател на бактериофаг с права phi29 може да пакетира ДНК срещу голяма вътрешна сила.“ природата 413 (2001): 748-52.

Разпознаване и прикачване на вируси

Първата стъпка при вирусна инфекция е разпознаването и прикрепването към клетката гостоприемник. Бактериофагът P22 използва tailspike протеин, който специфично разпознава и разцепва липополизахарид на повърхността на своя гостоприемник, Salmonella typhimurium, което му позволява да се "зарови" до клетъчната повърхност. Steinbacher и колеги определят структурата на протеина в комплекс с неговия субстрат, разкривайки молекулярната основа за специфичността. Прикрепването от вирусите на денга е по също толкова елегантен метод. За разлика от tailspike, протеините, които изпълняват тази задача, претърпяват голямо структурно пренареждане при взаимодействие с гостоприемника. Това преструктуриране на протеина задейства мембранно сливане, критична стъпка в процеса на инфекция.

Modis, Y., S. Ogata, D. Clements и S. C. Harrison. „Структура на белтъка на обвивката на вируса на денга след мембранно сливане“. природата 427, бр. 6972 (2004): 313-9.

Steinbacher, S., U. Baxa, S. Miller, A. Weintraub, R. Seckler и R. Huber. "Кристална структура на протеин на фаг Р22 tailspike, комплексиран с Salmonella sp. O-антигенни рецептори." Proc Natl Acad Sci U S A 93, бр. 20 (1996): 10584-8.

След като вирусите се прикрепят към своите гостоприемници, те трябва да получат своята нуклеинова киселина вътре в клетката. Отново вирусите са разработили много разнообразни решения на този проблем. Полиовирусът, пикорнавирусът, използва пептид, който се свързва с мембраните и индуцира клетката да интернализира частицата през ендоцитотичния път. Бактериофаг Т4 вместо това създава канал през мембраните на гостоприемника си и освобождава своята ДНК в клетката. Петр Лейман и колеги използваха крио-ЕМ, за да разкрият забележителните структурни промени, които придружават протеиновите комплекси на опашката на Т4, които постигат този подвиг.

Bubeck, D., D. J. Filman, N. Cheng, A. C. Steven, J. M. Hogle и D. M. Belnap. „Структурата на междинния продукт за влизане в клетката на полиовирус 135S при 10-ангстрьомна разделителна способност разкрива местоположението на външен полипептид, който се свързва с мембраните.“ J Вирол 79, бр. 12 (2005): 7745-55.

Лейман, П. Г., П. Р. Чипман, В. А. Костюченко, В. В. Месянжинов и М. Г. Росман. "Триизмерно пренареждане на протеини в опашката на бактериофаг Т4 при инфекция на неговия гостоприемник." клетка 118, бр. 4 (2004): 419-29.

Вирусни структури в клетката

Вирусите са молекулярни свободни носители и ще използват всякакви клетъчни пътища, които могат. T4 капсидният протеин изисква шаперон за сгъване, но шаперонът гостоприемник е твърде малък. Как T4 се справя с този проблем? Той има ген, кодиращ капачка на шаперона, която взаимодейства с гостоприемника шаперон, създавайки по-голямо пространство, в което да се побере T4 капсидният протеин за сгъване. Вирусът на африканската чума по свинете използва слабо разбран клетъчен механизъм, за да подпомогне сгъването и сглобяването на своите капсиди: агресомът. Смята се, че са клетъчен механизъм за справяне с неправилно нагънати протеини, тези вътреклетъчни структури се индуцират по време на инфекция с ASFV и са местата на сглобяване на капсид.

Bakkes, P. J., B. W. Faber, H. van Heerikhuizen и S. M. van der Vies. "Т4-кодираният кохаперонин, gp31, има уникални свойства, които обясняват изискването му за сгъването на главния капсиден протеин Т4." Proc Natl Acad Sci U S A 102, бр. 23 (2005): 8144-9.

Хийт, К. М., М. Уиндзор и Т. Уайлман. „Агресомите приличат на сайтове, специализирани за сглобяване на вируси.“ J Cell Biol 153, бр. 3 (2001): 449-55.

След като вирусът се събере вътре в клетката, той трябва да излезе. Бактериофагите имат проста, но здрава система за лизиране на своите гостоприемници, което буквално ги кара да експлодират. Тази система има вграден контролен механизъм, позволяващ ефективно време на лизис. Изглежда, че ХИВ използва по-рано слабо разбран клетъчен път за пъпкуване от клетките. Von Schwedler et al. използвайте генетиката, за да идентифицирате над двадесет протеинови играчи в този много сложен път.

Grundling, A., D. L. Smith, U. Blasi и R. Young. "Димеризация между холин и холин инхибитор на фаг ламбда." J Бактериол 182, бр. 21 (2000): 6075-81.

фон Шведлер, UK, M. Stuchell, B. Muller, DM Ward, HY Chung, E. Morita, HE Wang, T. Davis, GP He, DM Cimbora, A. Scott, HG Krausslich, J. Kaplan, SG Morham, и WI Sundquist. "Протеиновата мрежа на зараждането на ХИВ." клетка 114, бр. 6 (2003): 701-13.

Вирус на човешкия имунодефицит

Събирайки заедно това, което научихме за структурата и сглобяването на вируса, ще обсъдим антивирусните съединения на ХИВ в светлината на техните механизми. Инхибиторите на сливане на вируси някога са били обещаваща анти-ХИВ терапия. Но ХИВ бързо развива резистентност и основата на тази резистентност се разбира от гледна точка на структурата на протеина, който мутира, gp41. Sticht et al. съобщават за обещаващ антивирусен пептид, който инхибира сглобяването на ХИВ капсида.

Болдуин, C. E., R. W. Sanders, Y. Deng, S. Jurriaans, J. M. Lange, M. Lu и B. Berkhout. „Появата на лекарствено-зависим вариант на човешки имунодефицитен вирус тип 1 по време на терапия с инхибитора на сливането Т20.“ J Вирол 78, бр. 22 (2004): 12428-37.

Sticht, J., M. Humbert, S. Findlow, J. Bodem, B. Muller, U. Dietrich, J. Werner и H. G. Krausslich. "Пептиден инхибитор на сглобяването на HIV-1 in vitro." Nat Struct Mol Biol 12, бр. 8 (2005): 671-7.

Ден на проекта: Разглеждане на вирусни структури в 3D

Визуалната манипулация на биомакромолекулите в 3D е важен инструмент за структурните биолози. Ще прекараме този учебен период в запознаване със софтуера на изследователско ниво, който ни позволява да въртим, манипулираме и разглеждаме молекули в 3 измерения, и ще разгледаме на молекулярно ниво някои от вирусните протеини, обсъждани през семестъра.

Вирусите по същество са биологични машини. Генетичният контрол на техните структури, съчетан с вярността, с която тези структури се самосглобяват, правят вирусите идеални платформи за разработване на наномащабни материали и повърхности.

Mao, C., D. J. Solis, B. D. Reiss, S. T. Kottmann, R. Y. Sweeney, A. Hayhurst, G. Georgiou, B. Iverson и A. M. Belcher. „Базиран на вируси инструментариум за насочен синтез на магнитни и полупроводникови нанопроводници.“ наука 303, бр. 5655 (2004): 213-7.

Meunier, S., E. Strable, and M. G. Finn. "Кръстосано свързване и свързване с вирусни капсидни протеини чрез окисление на тирозин." Chem Biol 11, бр. 3 (2004): 319-26.


Методи

Протеини и рекомбинантна ДНК

Клонирането, свръхекспресията и пречистването на протеина на обвивката PP7 са описани подробно на друго място. За конструиране на едноверижен PP7 димер, последователността на покритието се амплифицира от pP7CT с Pfu ДНК полимераза и 3'-праймер, комплементарен на плазмидни векторни последователности и 5'-праймер, имащ последователността: 5'-CCCCCGCCGTTATGGGCAAAACCATCGTTCTTTCGGTC-3'. Това въведе a Bgl I място близо до 5'-края на това, което би било копие надолу по веригата на последователността, кодираща протеина на обвивката. Това впоследствие беше присъединено към естествено срещащо се Bgl I място близо до 3'-края на копието нагоре по веригата в pP7CT, за да се създаде съединителната последователност, показана на Фигура 3. Сега дублираната последователност беше клонирана между Xba аз и Бам HI в pET3d за свръхекспресия в Е. coli. Тези манипулации доведоха до дублиране и транслационно сливане на двете последователности, като последната аминокиселина на копието нагоре (аргинин) се присъедини към втората аминокиселина (серин) на копието надолу по веригата чрез линкер от две аминокиселини (tyr-gly) .

Анализ за термична стабилност

Термичната стабилност на вирусоподобните частици при различни условия се определя по два метода. В първия се получава "профил на топене" чрез нагряване на 25 ul проби от PP7 вирусоподобни частици при концентрация от 1,0 mg/ml в 50 mM Tris-HCl, рН 8,5, 100 mM NaCl за 2 минути. при специфични температури. Когато реакцията съдържа DTT, той присъства в концентрация от 10 mM. В края на инкубационния период пробите се охлаждат върху лед и след това се подлагат на центрофугиране при 13 000 rpm в IEC MicroMax микроцентрофуга за 5 минути. Супернатантите на тези проби, съдържащи частта от протеина, която остава разтворима след топлинна обработка, се отстраняват в нова епруветка. Неразтворимите протеини в пелетата се разтварят повторно в 6 М урея. Измерванията на относителните количества на разтворим и неразтворим протеин бяха извършени чрез Bradford анализ [24]. Стандартните криви се получават при използване на кокоши лизозим като стандарт и са линейни в обхвата на анализа. За измерване на количеството капсиди, оставащи след топлинна обработка, разтворим протеин се прилага върху 1% агарозен гел в 40 mM трис-ацетат, рН 8.0, 2 mM EDTA и се подлага на електрофореза. След това гелът се оцветява с етидиев бромид и се снима под UV осветление, за да се визуализират РНК-съдържащите VLP. Протеинът беше оцветен с coomassie brilliant blue R250. Гелът се сканира с денситометър и количеството протеин в отделните ленти се определя чрез сравнение със стандартна крива, получена чрез прилагане на разреждания на известно количество PP7 вирусоподобни частици към същия гел. Стандартната крива беше линейна в обхвата, използван в анализа.

Скоростите на денатурация се определят чрез инкубиране на протеини в 50 mM Tris-HCl, рН 8,5, 100 mM NaCl, със или без DTT при 10 mM при определени температури. В моменти от време реакциите се гасят върху лед и след това се анализират за съдържанието им на капсиди и на разтворим и неразтворим протеин, както е описано по-горе.

Пречистване на димери

Десет милиграма PP7 или 2PP7 VLPs, пречистени, както е описано по-горе, се инкубират за 60 минути в 1 ml 50 mM Tris-HCl, рН 8,5, 6 М урея, 10 mM DTT върху лед. Полученият протеин се диализира срещу 10 mM оцетна киселина, 50 mM NaCl (около pH 4) и след това се прилага към колона 0,9 × 45 cm Sephadex G75 и се елуира в същия буфер. Събират се фракции от 0,7 ml. В хроматограмата се появяват два пика. Електрофорезата с агарозен гел показва, че първият пик е съставен от VLP, които не са успели да се разглобят. Другият, елуиран при фракция 20, очевидно представлява димери на протеин на обвивката. В отделен експеримент говежди серумен албумин (MW = 68,000), овалбумин (MW = 45,000), химотрипсиноген (MW = 25,700) и лизозим (MW = 14,400) бяха приложени към колоната като стандарти за молекулно тегло. Стандартните протеини дават линейна графика на позицията на елуиране спрямо log молекулното тегло. Обърнете внимание, че BSA е пропуснат от този анализ, тъй като елуира в или близо до празния обем. Сравнението с поведението на елуиране на стандартите показва, че пикът на протеина на второто покритие има молекулно тегло от около 32 000, размер, приблизително съответстващ на предвиденото молекулно тегло от около 28 000 за димера на протеина на обвивката. Протеин от пиковите фракции беше използван в инвитро реакции на сглобяване.

Инвитро VLP монтаж

Пречистен димерен PP7 протеин на обвивката (0,1 nmol) беше добавен към реакции, съдържащи 50 mM Tris-HCl, pH 8,5 и дрождева tRNA, MS2 транслационен оператор или PP7 транслационен оператор RNA в количества, вариращи чрез двукратно серийно разреждане от 0,1 nmol до 6,3 pmol . След 30 минути се добавят глицерол и бромофенол синьо и реакциите се подлагат на електрофореза в 1% агарозен гел. РНК се визуализира чрез оцветяване на геловете с етидиев бромид, последвано от фотография върху UV трансилюминатор. MS2 и PP7 транслационни операторни РНК се произвеждат чрез транскрипция инвитро както е описано по-рано [26]. В някои случаи РНК се синтезират в присъствието на 32 Р-белязан нуклеотид и могат да бъдат визуализирани и количествено определени след излагане на гела на Packard Cyclone phosphorimager екран. За да се визуализират протеини, геловете бяха оцветени с coomassie брилянтно синьо R250.


Инвитро Свойства на сглобяване на пречистени бактериално експресирани капсидни протеини на вируса на човешкия имунодефицит

Полипротеинът Gag на ретровирусите е достатъчен за сглобяване и пъпкуване на вирусоподобни частици от клетката гостоприемник. В случай на човешки имунодефицитен вирус (HIV), Gag съдържа доменната матрица, капсид (CA), нуклеокапсид (NC) и p6, които са разделени от вирусната протеиназа вътре в зараждащия се вирион, което води до морфологично съзряване, за да се получи инфекциозен вирус. В зрелия вирус СА образува капсидна обвивка, обграждаща рибонуклеопротеиновото ядро, състояща се от NC и геномната РНК. За да определим изискванията за сглобяване на частици и функционален принос на отделните домейни, ние изразихме домейни на HIV Gag в Ешерихия коли и пречистват продуктите до почти хомогенност. Инвитро сглобяването на СА, със или без С-терминално съседния спейсер пептид, дава тръбни структури с диаметър приблизително 55 nm и хетерогенна дължина. Ефективното образуване на частици изисква висока концентрация на протеин, високо съдържание на сол и неутрално до алкално pH. За разлика, инвитро сглобяването на CA-NC се случва при 20 пъти по-ниска концентрация на протеин и в ниско съдържание на сол, но изисква добавяне на РНК. Тези резултати предполагат, че хидрофобните взаимодействия на капсидните протеини са достатъчни за образуването на частици, докато РНК-свързващият нуклеокапсиден домен може да се концентрира и подравнява структурните протеини върху вирусния геном.


Абстрактно

Синтезът на малко количество от 42S РНК в допълнение към VSV специфичните иРНК видове се наблюдава в свързана транскрипционно-транслационна система, съдържаща рибонуклеопротеинови частици от L клетка, заразена с вирус на везикуларен стоматит и третиран с нуклеаза рибозомен екстракт, получен от неинфектирани HeLa клетки. Анализът на градиент на плътност на CsCl показа, че синтезираната 42S РНК е свързана с новосинтезиран N протеин като нуклеопротеин с плътност на силата от 1,3 g/ml. 42S РНК и N протеинът, присъстващи в нуклеопротеина, са устойчиви съответно на нуклеаза и протеаза. Около 35% от синтезираната 42S РНК имаха същата полярност като VSV геномната РНК, а останалите 65% имаха допълнителна полярност. Представените тук доказателства показват, че както геномната с пълна дължина, така и комплементарната РНК са свързани с N протеин в процеса на репликация in vitro. Предполага се и шаблонна роля за комплементарната 42S РНК за репликация на геномната РНК.


Въведение

В инвитро изграждането на рибозоми е тема на бързо нарастващ интерес към системите и синтетичната биология. Тези интереси имат за цел да изяснят широките принципи, които са в основата на работата и сглобяването на апарата за превод (Nierhaus, 1990 Erlacher et al, 2011 Polacek, 2011), проектиране и изграждане на минимални клетки, за да се разбере произходът на живота (Forster and Church, 2006 Jewett and Forster, 2010), и да се даде възможност инвитро еволюция за избор на рибозоми, които имат подобрени функции или променени химични свойства (Cochella and Green, 2004 Wang et al, 2007 Нойман et al, 2010 г.). За реализиране на тези цели, методи за инвитро е необходим рибозомен синтез.

Инвитро сглобяване или възстановяване на Ешерихия коли рибозоми от пречистени нативни рибозомни компоненти във функционално активни малки (30S) и големи (50S) рибозомни субединици за първи път е постигнато в пионерски работи преди ~40 години. Конвенционалният протокол за възстановяване на субединицата 30S включва едноетапна инкубация при 20 mM Mg 2+ и 40°C (Traub and Nomura, 1968) и може да бъде улеснена при по-ниски температури от придружители (Maki and Culver, 2005). Конвенционалният протокол за възстановяване на субединицата 50S включва нефизиологична двуетапна високотемпературна инкубация, първо при 4 mM Mg 2+ и 44°C, след това при 20 mM Mg 2+ и 50°C (Nierhaus and Dohme, 1974).

Докато проучванията, използващи конвенционалния подход за възстановяване, разкриха много важни прозрения за сглобяването на рибозоми (Nierhaus, 1990), неефективността при възстановяването затруднява изграждането и анализа на проектирани варианти (Semrad and Green, 2002). Например, конвенционално възстановени 50S субединици, направени с инвитро-транскрибираната 23S рРНК (без естествено срещащите се посттранскрипционни модификации) е до 10 000 пъти по-малко ефективни при реконституиране от тези, използващи зряла 23S рРНК, измерена чрез фрагментната реакция, при която единични пептидни връзки се образуват върху изолирани 50S субединици (Semrad и Зелен, 2002 г.). Освен това, нефизиологичните двуетапни условия за сглобяване на 50S изключват свързването на рибозомния синтез и сглобяване в единна интегрирана система.

За разлика от предишните схеми, ние имахме за цел да разработим интегриран метод за физиологично сглобяване на Е. coli рибозоми, в които се събират рибозоми инвитро-транскрибира rRNA и след това провежда протеинов синтез в същото отделение (Каре 1). Този подход имитира ко-транскрипция на сглобяването на рРНК и рибозома, когато се случва in vivo (Талкингтън et al, 2005 Мълдър et al, 2010 г.). Освен това, той е в съответствие с общ ръководен принцип в безклетъчната синтетична биология, а именно, че цитоплазмената мимикрия предоставя предимства за възпроизвеждане на клетъчно подобно поведение (Jewett et al, 2008 Hodgman and Jewett, 2012). Тук демонстрираме нашия нов метод за интегриран синтез на рРНК, сглобяване на рибозоми и транслация, наречен iSAT (Каре 1). В допълнение, ние показваме как iSAT може да се използва за ефективно създаване на модифицирана рибозома, която е силно устойчива на антибиотика клиндамицин в една стъпка. Макар че Bacillus stearothermophilus (Грийн и Нолер, 1999) и Thermus aquaticus (Хайтович et al, 1999 Ерлахер et al, 2011) имат доста активни рибозоми, възстановени от инвитро-транскрибирана 23S rRNA без модификации, ние се фокусираме върху Е. coli рибозоми, тъй като транслационният апарат на Е. coli е най-добре разбраната и най-охарактеризирана както биохимично, така и генетично (Forster and Church, 2006 Jewett and Forster, 2010).


Ин витро сглобяване на вируси - Биология

Моментна снимка на експериментални данни

  • Метод: ЕЛЕКТРОННА МИКРОСКОПИЯ
  • Резолюция: 3.30 Å
  • Състояние на агрегиране: СПИРАЛЕН МАССИВ 
  • Метод на реконструкция: ХЕЛИКАЛЕН 

wwPDB валидиране   3D отчет Пълен отчет

Сглобяването и крио-ЕМ структури на РНК-специфични нуклеокапсиди на вируса на морбили осигуряват механистичен поглед върху парамиксовирусната репликация.

(2019) Proc Natl Acad Sci U S A 116: 4256-4264

  • PubMed: 30787192  Търсене в PubMedSearch в PubMed Central
  • DOI: 10.1073/pnas.1816417116
  • Основно цитиране на свързани структури:  
    6H5Q, 6H5S
  • PubMed Резюме: 

Сглобяването на парамиксовирусни нуклеокапсиди върху генома на РНК е съществена стъпка във вирусния цикъл. Структурната основа на този процес остава неясна поради невъзможността да се контролира капсулирането. Използвахме наскоро разработен подход за сглобяване на нуклеокапсидни частици на вируса на морбили върху специфични последователности от РНК хексамери (поли-аденин и вирусен геномен 5') in vitro и определихме техните криоелектронни микроскопски карти до 3 .

Сглобяването на парамиксовирусни нуклеокапсиди върху генома на РНК е съществена стъпка във вирусния цикъл. Структурната основа на този процес остава неясна поради невъзможността да се контролира инкапсидирането. Ние използвахме наскоро разработен подход за сглобяване на нуклеокапсидни частици на вируса на морбили върху специфични последователности от РНК хексамери (поли-аденин и вирусен геномен 5') in vitro и определихме техните криоелектронни микроскопски карти до 3,3-Å резолюция. Структурите недвусмислено определят 5' и 3' местата на свързване и по този начин свързващия регистър на вирусната геномна РНК в нуклеокапсидите. Това наблюдение разкрива, че 3' краят на генома е до голяма степен изложен в напълно сглобени нуклеокапсиди на морбили. По-специално, последните три нуклеотида на генома се правят достъпни за РНК-зависимия РНК полимеразен комплекс, което вероятно позволява ефективна обработка на РНК. Структурите също така разкриват локални и глобални конформационни промени в нуклеопротеина при сглобяване, по-специално включващи спирала α6 и спирала α13, които образуват ръбове на канала за свързване на РНК. Наблюдава се нарушение в свързаната РНК, локализирана в едно от двете гръбначни конформационни превключващи места. Структурата с висока разделителна способност ни позволи да идентифицираме предполагаеми места за взаимодействие на нуклеобаза в РНК-свързващия жлеб, чието въздействие върху кинетиката на сглобяване беше измерено с помощта на ЯМР в реално време. По този начин се показва, че мутацията на едно от тези места, R195, чиято странична верига стабилизира както гръбнака, така и основата на свързаната нуклеинова киселина, е от съществено значение за сглобяването на подобни на нуклеокапсид частици.


Гледай видеото: Анализы на коронавирус. и когда закончится пандемия. Лаборатория Инвитро Сибирь Евгений Печковский (Декември 2022).