Информация

Функция и характеристика на поли(T) и (AT)

Функция и характеристика на поли(T) и (AT)


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Попаднах на три термина; "poly(T)45", "poly(A)45" и "(AT)15". Някой може ли да обясни какви са те? Знам, че числото се отнася до дължината на веригата, вероятно поли-Т е верига от тиминови мономери и че ss(AT)15 се отнася до 30-база (dAdT). Предполагам, че това се отнася до сингъл, който изглежда така; dAdT-dAdT-dAdT… повторено 15 пъти. В такъв случай какво е d?


Поли(Т) е олигонуклеотид само с повтарящи се остатъци от тимин. Те обикновено се използват като праймери в PCR с обратна транскрипция, тъй като зрелите еукариотни иРНК имат Поли(А) [аденозин] опашка, добавена към тях като посттранскрипционна модификация, за да се предпази от разграждане на иРНК. Също така понякога ще видите това, наричано олиго dT. Това може също да бъде праймерът за някои сдвоени крайни адаптери, използвани при секвениране от следващо поколение (NGS)

45 обикновено показва броя на остатъците в олигонуклеотида.

Poly(A) може да бъде пример за сдвоен краен адаптер за NGS, но ще трябва да видя контекста на това къде сте видели термините, за да съм сигурен.

d = Дезоксирибонуклеотид, с други думи имате работа с ДНК олигонуклеотид (въпреки че тиминът също е индикация). Технически d се отнася до 2' въглерод върху рибозата, който има водород вместо хидроксил, прикрепен към него, което го прави дезоксирибоза.

Без d това е рибонуклеотид, което показва, че гледате молекула на РНК и че 2' въглеродът върху рибозата има хидроксилна група.

Понякога ще виждате и ddN (N за всяка база). Това показва дидеоксинуклеотид, завършващ веригата, който има водород както на 2', така и на 3' въглерод вместо хидроксилни групи. Причината, поради която тази молекула завършва веригата, е, че имате нужда от 3' хидроксил, за да се свържете с 5' фосфатна група, за да образувате фосфодиестерна връзка, която е необходима за продължаване на удължаването на молекулата на нуклеинова киселина.

Що се отнася до ss(AT)15, мисля, че сте прав, като казвате, че това е 15 двойки повторение на AT, така че 30 нуклеотиден олигонуклеотид. Въпреки че не пише dAdT, вероятно сте прави, че те са дезоксирибонуклеотиди, тъй като използват тимин вместо урацил като основа.

За всеки случай, ss означава едноверижни, което често е случаят за олигонуклеотидни праймери за PCR реакции.


Едноклетъчен RNA-seq транскриптомен анализ на линейни и кръгови РНК в миши предимплантационни ембриони

Кръговите РНК (circRNAs) са нов клас неполиаденилирани некодиращи РНК, които могат да играят важна роля в много биологични процеси. Тук ние разработваме едноклетъчен универсален поли(А)-независим метод за секвениране на РНК (SUPeR-seq) за секвениране както на полиаденилирани, така и на неполиаденилирани РНК от отделни клетки. Този метод показва стабилна чувствителност, прецизност и точност. Откриваме 2891 circRNAs и 913 нови линейни транскрипта в ембриони преди имплантация на мишки и допълнително анализираме изобилието от circRNAs по време на развитието, функцията на обогатените гени и характеристиките на последователността на circRNAs. Нашата работа е ключова за дешифрирането на механизмите за регулиране на circRNAs по време на ранното ембрионално развитие на бозайници.


Международно списание за биологични макромолекули

Международно списание за биологични макромолекули е утвърдено международно списание за изследвания в химически и биологичен аспекти на всички естествени макромолекули.Представя най-новите открития от изследвания върху молекулярната структура и свойствата на протеините, макромолекулните въглехидрати, гликопротеините.

Международно списание за биологични макромолекули е утвърдено международно списание за изследвания в химически и биологичен аспекти на всички естествени макромолекули.Представя най-новите открития от изследвания върху молекулярната структура и свойствата на протеини, макромолекулни въглехидрати, гликопротеини, протеогликани, лигнини, биологични поликиселини и нуклеинови киселини. Тези констатации трябва да са нови и нови, а не да повтарят по-ранна или аналогична публикувана работа. Обхватът включва биологични дейности и взаимодействия, молекулярни асоциации, химични и биологични модификации и функционални свойства. Доклади за свързани моделни системи, структурни конформационни изследвания, теоретични разработки и нови аналитични техники също са добре дошли. Всички документи трябва да се фокусират предимно върху поне един наименуван биологична макромолекула. Това име трябва да се появи в заглавието, резюмето и текста на доклада.


Резултати

MKRN1 взаимодейства с PABPC1 и други RBP

За да научим за потенциалните функции, ние характеризирахме профила на протеиново взаимодействие на MKRN1 в HEK293T клетки. За тази цел използвахме афинитетно пречистване (AP), съчетано със стабилно изотопно маркиране с аминокиселини в базирана на клетъчна култура (SILAC) количествена мас спектрометрия (MS), използвайки GFP-MKRN1 wt или GFP като стръв. Идентифицирахме 53 протеина, които бяха значително обогатени с GFP-MKRN1 wt в сравнение с контролните AP (процент на фалшиво откриване [FDR] < 5%, комбинирани съотношения от три независими експеримента). Почти всички идентифицирани интерактори бяха открити преди това във връзка с полиаденилирани транскрипти (термин на генната онтология [GO] „свързване на поли(А) РНК“, Допълнителен файл 1: Фигура S2A).

В съответствие с предишни доклади [18, 19, 21], ние открихме, че MKRN1 силно взаимодейства с цитоплазмените поли(А)-свързващи протеини PABPC1 и PABPC4 (фиг. 1а, допълнителен файл 1: фигура S2B, допълнителен файл 2: таблица S1 ). В допълнение, ние открихме 14 рибозомни протеина, както и четири протеина, за които преди беше показано, че се пречистват заедно с рибозоми [20], включително IGF2BP1, LARP1, UPF1 и ELAVL1 (фиг. 1а). Ние потвърдихме резултатите от MS в реципрочни AP експерименти с GFP-маркирани PABPC1, ELAVL1 и IGF2BP1 като примамки, последвани от Western blot за ендогенен MKRN1 (Допълнителен файл 1: Фигура S2C и Допълнителен файл 3: Фигура S10). Всички открити взаимодействия продължават да съществуват в присъствието на РНКази (RNase A и T1), което показва, че MKRN1 взаимодейства с тези протеини по РНК-независим начин (Допълнителен файл 1: Фигура S2C). Асоциацията е допълнително подкрепена от проучване върху ортолога Mkrn1 в Drosophila melanogaster, който идентифицира pAbp, Larp, Upf1 и Imp (IGF2BP при бозайници) като партньори за взаимодействие (Dold et al., bioRxiv, https://doi.org/10.1101/501643).

MKRN1 взаимодейства с PABPC1 и други регулатори на транслацията и стабилността на РНК. а Протеинов интерактом на GFP-MKRN1 wt в HEK293T клетки, анализиран чрез количествена протеомика, базирана на MS. Комбинирани съотношения SILAC (н = 3 повторения) след z-нормализирането на резултата се начертава спрямо log10- трансформирани интензитети. 1100 протеинови групи бяха количествено определени в поне два от три повторни експеримента. MKRN1 и значимите интерактори са подчертани (FDR < 5%). б MKRN1 и PABPC1 се свързват с полизоми. 10-50% градиент на захароза от третирани с циклохексимид клетъчни екстракти HEK293T. Показани са Western blot анализи на отделни градиентни фракции с антитела срещу MKRN1 и PABPC1/3 (н = 3 повторения плюс едно техническо копие). UV абсорбцията беше измерена при λ = 254 nm. Репликати и неизрязани гел изображения са показани в Допълнителен файл 3: Фигура S10A-C. ° С PAM2 мотив, подобен на докладвания по-рано консенсус (показан отгоре Допълнителен файл 1: Фигура S1B) [22] присъства в MKRN1 (първата аминокиселинна позиция, посочена вляво). Въведените мутации в MKRN1 PAM2mut са посочени в бензина по-долу. Съответните позиции са подчертани (Допълнителен файл 1: Фигура S1B). д Ендогенният PABPC1 взаимодейства силно с MKRN1 wt и MKRN1 RINGmut, но само в по-малка степен с MKRN1 PAM2mut. Western блотове за ендогенни PABPC1 и GFP след AP на GFP-MKRN1 (wt и мутанти). Съотношенията на сигнала PABPC1 (нормализиран към входа) в GFP-MKRN1 APs спрямо контрола (GFP празен вектор, EV) са показани по-долу. Репликати 2, 3 и неизрязани гел изображения са показани в Допълнителен файл 3: Фигура S10D-F. д Количественото сравнение на интерактомите на GFP-MKRN1 wt и GFP-MKRN1 PAM2mut показва, че PABPC1 и няколко други интерактори се губят при мутация на PAM2. Комбинираните съотношения на три повторения са показани в диаграма на разсейване. Показани са само протеини, открити в поне две от три повторения. MKRN1 wt значими интерактори (от а) са подчертани като в а (FDR < 5% в MKRN1 wt). е MKRN1 WT и MKRN1 PAM2mut, но не и MKRN1 RINGmut, ефективно автоубиквитилират. In vitro анализи за убиквитилиране с рекомбинантни His-маркирани MKRN1 wt и мутантни протеини, които бяха инкубирани със или без ензима E2 UBC5a, ензима E1 UBA1 и убиквитин. Реакция с UBC5a служи само като контрола. Автоубиквитилирането се анализира чрез Western blot. Репликати 2, 3 и неизрязани гел изображения са показани в Допълнителен файл 3: Фигура S10G,H

Нашите резултати предполагат, че MKRN1 е част от по-голяма иРНК рибонуклеопротеинова частица (mRNP) заедно с PABPC1 и други RBP, които участват в транслационната регулация. „Глупавият медииран разпад“ и „преводът“ бяха най-значително обогатените GO термини за партньорите за взаимодействие на MKRN1 (Биологичен процес, Допълнителен файл 1: Фигура S2A). Освен това, MKRN1 ясно присъства в полизомни фракции, както е определено в експерименти за центрофугиране с градиент на захароза. Тук той се съвместно седиментира с PABPC1 (фиг. 1b), което показва, че заедно с PABPC1, MKRN1 е свързан с транслиращи рибозоми. Няколко протеина взаимодействат с PABPC1 чрез PABP-взаимодействащ мотив 2 (PAM2) мотив, който специфично се свързва с MLLE домейна, присъстващ почти изключително в PABP протеините [23, 24]. Съответно, предишно проучване показа, че MKRN1 се свързва с PABP чрез PAM2 мотив на аминокиселинни позиции 161–193 [19]. В подкрепа на предполагаемата функционална значимост, филогенетичен анализ илюстрира, че присъствието и позиционирането на PAM2 мотива са запазени в MKRN1 ортолози в метазоите (Допълнителен файл 1: Фигура S1A, B). Точковите мутации в PAM2 мотива на MKRN1 (GFP-MKRN1 PAM2mut) [25] силно компрометират взаимодействието му с PABPC1 и PABPC4 в AP експерименти, последвани от MS или Western блот (фиг. 1c-e и допълнителен файл 2: таблица S1). Изненадващо, MKRN1 PAM2mut загуби взаимодействие не само с PABPC1 и PABPC4, но и с няколко други идентифицирани протеини (Фиг. 1e), което предполага, че мутантът вече не се намира в mRNPs. За сравнение, ние също тествахме по-рано описана точкова мутация в RING домейна, която премахва функцията на E3 убиквитин лигаза (лигаза-мъртва, GFP-MKRN1 RINGmut) [14]. Този мутант показва стабилни взаимодействия с PABPC1 и други интерактори в AP-MS данните. При Western blot експерименти, ние отбелязахме намалено взаимодействие на MKRN1 RINGmut с PABPC1. Възможно обяснение може да бъде значително повишените нива на MKRN1 RINGmut в клетките, които могат да изкривят нормализирането в Western blot експерименти (Фиг. 1d, Допълнителен файл 1: Фигура S3 и Допълнителен файл 2: Таблица S1).

За да изключим, че общата загуба на целостта на протеина на MKRN1 PAM2mut, например поради неправилно нагъване, е отговорна за наблюдаваната загуба на взаимодействието на PABPC1, тествахме активността на рекомбинантни варианти на протеин MKRN1 в in vitro анализи за убиквитилиране. Както се очакваше, рекомбинантният MKRN1 RINGmut беше ензимно неактивен, както е отразено в пълното отсъствие на автоубиквитилация (Фиг. 1f, Допълнителен файл 1: Фигура S1E). Обратно, както MKRN1 wt, така и MKRN1 PAM2mut могат да се автоубиквитилират със същата ефективност, което показва, че E3 убиквитин лигазният домейн на MKRN1 PAM2mut все още е функционален. Освен това, конфокалната микроскопия на GFP-MKRN1 wt и GFP-MKRN1 PAM2mut потвърди, че мутацията на PAM2 не е довела до агрегация или по друг начин нарушена локализация на протеина (Допълнителен файл 1: Фигура S1D). Заедно това предоставя убедителни доказателства, че MKRN1 PAM2mut като цяло не е повреден.

Като цяло, нашите резултати потвърждават, че MKRN1 взаимодейства с PABPC1 и предполагат, че и двата протеина се свързват с транслиращи рибозоми. Загубата на взаимодействието MKRN1-PABPC1 влошава образуването на mRNP, което показва, че PABPC1 може да участва в набирането на MKRN1 към mRNP.

MKRN1 се свързва с поли(А) опашки и богати на А разтягания в 3′ UTRs

За да характеризираме поведението на свързване на РНК на човешки MKRN1 in vivo, ние извършихме UV омрежване и имунопреципитация с индивидуална нуклеотидна разделителна способност (iCLIP) [26] в комбинация с 4-тиоуридин (4SU) маркиране за подобряване на UV омрежването [27]. В три повторни експеримента с GFP-маркиран MKRN1 (GFP-MKRN1 wt), експресиран в клетки HEK293T, ние идентифицирахме повече от 4,6 милиона уникални събития на кръстосано свързване, натрупани в 7331 MKRN1 свързващи места (вижте раздела „Материали и методи“ Допълнителен файл 1: Фигура S4A и таблица S2). Те бяха допълнително класирани според силата на свързването на MKRN1, което беше оценено от обогатяването на събитията на кръстосано свързване в рамките на мястото на свързване спрямо неговата локална среда като прокси за изобилието на транскрипти („сигнал над фона“, SOB вижте „Материали и методи” раздел) [28]. Стойностите на SOB бяха силно възпроизводими между повторенията (коефициенти на корелация на Pearson r > 0,72, Допълнителен файл 1: Фигура S4B-G).

В целия транскриптом, MKRN1 почти изключително се свързва с протеин-кодиращи иРНК със силна тенденция да се локализира в 3′ UTRs (фиг. 2а, б). Местата на свързване обикновено съдържат богати на уридин тетрамери (Допълнителен файл 1: Фигура S5A), вероятно отразяващи UV омрежване на базата на 4SU [27]. Поразително е, че горните 20% MKRN1 свързващи места бяха масово обогатени с AAAA тетрамери (A, аденозин) в рамките на 5-50 нуклеотида (nt) надолу по веригата от местата на свързване (фиг. 2c и допълнителен файл 1: фигура S5A). Обогатяването с AAAA отразява наличието на богати на A участъци, които варират от 8 до 30 nt на дължина (Допълнителен файл 1: Фигура S5B вижте раздела „Материали и методи“). В рамките на 3′ UTRs, 30% (1848 от 6165) от местата на свързване на MKRN1 се намират непосредствено преди участък, богат на A (фиг. 2a, d) и по-дълги участъци, богати на A, свързани с по-силно свързване на MKRN1 (Допълнителен файл 1: Фигура S5C, D). Интригуващо е, че открихме изискване за изпълнение от най-малко 8 непрекъснати A за придаване на силно свързване на MKRN1 (фиг. 2e), което точно съответства на РНК отпечатъка на един домен на РНК разпознаващ мотив (RRM) на PABP [29]. Тъй като по-рано беше съобщено, че PABPC1 се свързва не само с поли(А) опашки, но и в рамките на 3′ UTRs [30,31,32], тези наблюдения предполагат, че MKRN1 се свързва заедно с PABPC1 към иРНК.

MKRN1 се свързва нагоре от богатите на A участъци в 3′ UTRs. а MKRN1 се свързва нагоре от богатите на A участъци в 3′ UTR на LARP1 ген. Изглед на браузъра на генома на GFP-MKRN1 iCLIP данни, показващ събития на кръстосано свързване на nt (обединени реплики) заедно със места на свързване (люляк) и свързани участъци, богати на A (тъмнозелени). б MKRN1 се свързва предимно в 3′ UTR на протеин-кодиращи гени. Кругови диаграми, обобщаващи разпределението на местата на свързване на MKRN1 към различни биотипове на РНК (7331 места на свързване, отгоре) и различни региони в протеин-кодиращите транскрипти (6913 места на свързване, отдолу). ° С MKRN1 свързващите места показват обогатяване надолу по веригата на AAAA хомополимери. Честота на нуклеотид (nt) за четири хомополимерни 4-мера в прозорец от 101-nt около средните точки на най-добрите 20% MKRN1 свързващи места (според сигнала над фона вижте раздела „Материали и методи“). д MKRN1 събитията на кръстосано свързване се натрупват нагоре по веригата на богатите на A участъци. Метапрофилът (отгоре) показва средните събития на кръстосано свързване на nt в 201-nt прозорец около началната позиция на 1412 MKRN1-свързани A-богати участъци в 3′ UTR. Визуализацията на топлинната карта (отдолу) показва събития на кръстосано свързване на nt (вижте цветовата скала) в прозорец от 101 nt около свързаните с MKRN1 участъци, богати на A. д Силата на мястото на свързване на MKRN1 (сигнал над фон, SOB) се увеличава с броя на непрекъснатите A в рамките на богатото на A участък. Средно и стандартно отклонение на силата на свързващия сайт на MKRN1, свързана с богати на A участъци, съдържащи непрекъснати A серии с нарастваща дължина (х-ос). MKRN1 свързващите места без свързани A-богати участъци са показани за сравнение вляво. Брой места за обвързване във всяка категория, посочени като стълбовидна диаграма по-горе

Подтикнати от тази идея, ние изследвахме необичайно високата част от несъпоставените четения на iCLIP в набора от данни MKRN1 за нешаблирани крайни A, за да тестваме хипотезата, че MKRN1 може също да се свърже с poly (A) опашки (Допълнителен файл 1: Таблица S2). Некартографираните показания обикновено показват повишено A-съдържание (фиг. 3a), в сравнение с несвързан контролен RBP [33], а 6% от показанията завършват с най-малко десет терминала A (фиг. 3a, вмъкване). В допълнение, картографираните събития на GFP-MKRN1 wt омрежване бяха обогатени нагоре по веригата от анотирани места на полиаденилиране, както е показано в SRSF4 ген (фиг. 3b, c). Ние сравнихме този модел на свързване с други RBP, използвайки публично достъпни eCLIP данни от проекта ENCODE [34]. Свързването на TIAL1, PUM1, QKI, UPF1 и HNRNPK, за които е известно, че изпълняват различни функции в 3′ UTR [35,36,37,38], се разпределя в 3′ UTR тела (фиг. 3b). Обратно, PABPC4, както и CPSF6, компонент на машината за разцепване и полиаденилиране, достигат връх заедно с MKRN1 към местата на полиаденилиране. Заедно тези резултати подкрепят, че MKRN1, но не и други 3′ UTR-свързващи протеини, се свързва с поли(А) опашки, където съвпада с поли(А)-свързващия протеин.

MKRN1 се свързва с поли(А) опашки. а Некартираните четения на MKRN1 iCLIP показват повишено A-съдържание (повече от половината от всички прочетени нуклеотиди), което свидетелства за свързване на поли(A) опашката. Кумулативна част от показанията iCLIP (г-ос, обединени реплики), които не могат да бъдат картографирани с човешкия геном (вижте раздела „Материали и методи“) и показват поне дадено A-съдържание (х-ос). Данните на iCLIP за несвързания RBP HNRNPH [33] са показани за сравнение. Кумулативният процент четения с минимален брой терминали А се показва като вмъкнат. б Събитията на MKRN1 омрежа се увеличават към 3′ UTR краища. Метапрофилът на MKRN1 събития на кръстосано свързване и седем допълнителни RBPs показва нормализираната сума от събития на кръстосано свързване на nt в прозорец от 2001-nt около анотирани полиаденилиращи места на транскрипти с > 1 kb 3' UTRs. Сивите ленти показват прозорци в 3′ UTR тяло (− 750 до − 650) и близо до поли(A) сайта (− 150 до − 50), които са били използвани за изчисляване на коефициентите на обогатяване. ° С MKRN1 се свързва близо до мястото на полиаденилиране на SRSF4 ген. Изглед на браузъра на генома, както е на фиг. 2а. д Цялостното RNA свързване на MKRN1 е силно намалено при отмяна на взаимодействието на PABPC1. Авторадиография (вляво) на експерименти с UV омрежване (репликация 1, с 4SU и UV омрежване при 365 nm реплики 2 и 3 в Допълнителен файл 1: Фигура S6A,B), сравняване на GFP-MKRN1 PAM2mut с GFP-MKRN1 wt при различни стъпки на разреждане за calibr . Количествено определяне на радиоактивен сигнал на протеин-РНК комплекси и съответния Western блот, показан вдясно. Неизрязаните гел изображения са показани в Допълнителен файл 3: Фигура S11A,B. д MKRN1 се набира към поли(А) РНК с помощта на PABPC1. SDS-PAGE (Coomassie оцветяване) показва възстановяване на рекомбинантни His-MKRN1 wt и/или His-PABPC1 (маркирани съответно с бензин и сиви стрелки) от изтегляне на биотинилиран РНК олигонуклеотиди, съдържащи последните 22 nt от SRSF4 3′ UTR, последвано от 20 A (A20 РНК) или 20 V нуклеотиди (А или С или G контролна РНК). Зърната без РНК служат като контроли. Репликати и неизрязани гел изображения са показани в Допълнителен файл 1: Фигура S6C,D и Допълнителен файл 3: S11C-E, съответно

За да проверим дали взаимодействието с PABPC1 влияе върху свързването на MKRN1 РНК, проведохме UV експерименти за омрежване с GFP-MKRN1 PAM2mut , който вече не взаимодейства с PABPC1 (фиг. 1d, e). Поразително е, че РНК свързването на този мутант беше глобално намалено в сравнение с GFP-MKRN1 wt (фиг. 3d, Допълнителен файл 1: Фигура S6A, B и Допълнителен файл 3: Фигура S11), което показва, че PABPC1 може да набере MKRN1 към РНК. За да докажем това откритие, ние проведохме in vitro анализи за изтегляне на РНК с рекомбинантен His-PABPC1 и/или His-MKRN1 и биотинилирани РНК. По-специално, добавянето на His-PABPC1 силно увеличи изтеглянето на His-MKRN1 с A20-съдържаща РНК, но не и контролната РНК (Фиг. 3д и Допълнителен файл 1: Фигура S6C, D), което показва, че PABPC1 стабилизира MKRN1 в поли(А) последователности.

В обобщение, тези резултати силно предполагат, че MKRN1 се свързва нагоре от богатите на A участъци в 3′ UTRs и поли (A) опашки. Предполагаме, че този модел на свързване се дефинира чрез взаимодействието на MKRN1 с PABPC1, тъй като (i) свързването на MKRN1 се засилва, когато свързаното A-богато участък достигне достатъчна дължина, за да побере един RRM домейн на PABPC1, (ii) премахване на взаимодействието MKRN1-PABPC1 води до загуба на свързване на MKRN1 РНК и (iii) PABPC1 засилва връзката на MKRN1 с РНК in vitro. При съгласуван сценарий беше установено, че дрозофила Mkrn1 се свързва преди удължен участък, богат на A в 3′ UTR на Оскар иРНК и че това свързване е значително намалено при изчерпване на pAbp (Dold et al., bioRxiv, https://doi.org/10.1101/501643).

MKRN1 насърчава спирането на рибозомите при поли(А) последователности

Както беше посочено по-горе, нашите iCLIP данни показват, че MKRN1 бележи началото на poly (A) опашки. Следователно е възможно MKRN1 също да се свърже нагоре по течението на преждевременните събития на полиаденилиране в отворени рамки за четене. Въз основа на модела на свързване на MKRN1, неговите партньори за взаимодействие и връзката му с рибозомите, ние предположихме, че MKRN1 може да участва в изчистването на такива транскрипти чрез контрол на качеството, свързан с рибозоми (RQC). В този процес рибозомите, които се транслират в поли(А) последователност, например при разчитане на стоп кодон или преждевременно полиаденилиране, се спират и в крайна сметка се рециклират [4, 5]. За да тестваме тази хипотеза, ние използвахме наскоро въведен анализ, базиран на поточна цитометрия, който следи спирането на рибозомите в репортер с двойна флуоресценция [8, 10]. В този репортер гените, кодиращи зеления и червения флуоресцентен протеин (GFP и RFP, съответно) са разделени от линкерна област с поли(А) разтягане като предполагаема спираща последователност на рибозомата (фиг. 4а). Линкерът е фланкиран от две вирусни P2A сайтове, които насърчават транслационното удължаване в отделни протеинови продукти, като по този начин изключват транслацията на линкерния регион от фланкиращите GFP и RFP транслационни продукти [39]. Като следствие, пълният превод на репортера води до равни количества от три самостоятелни протеина (GFP, линкерен пептид и RFP), докато абортът на транслацията в линкерната последователност влошава RFP, но не и производството на GFP. Това води до намалено съотношение RFP:GFP [8], което се измерва с помощта на базирана на флуоресценция поточна цитометрия.

MKRN1 спира рибозомите в поли(А) последователности. а Двойният флуоресцентен репортер съдържа N-терминален GFP, последван от FLAG-SR-X линкер и C-терминал RFP, които са разделени от P2A места, за да се осигури транслация в три отделни протеина [8]. Полученото съотношение GFP:RFP се определя с помощта на поточна цитометрия. Вмъкнатият фрагмент K(AAA)20 кодира 20 лизина чрез повтаряне на кодона ААА. Началният вектор без вмъкване (K0) служи за контрол. Схематичните рибозоми илюстрират транслацията на съответните репортерни сегменти. б Рибозомите не успяват да спрат в отсъствието на MKRN1. HEK293T клетките бяха трансфектирани с контролна siRNA или siRNAs таргетиране MKRN1 (KD1 и KD2) или ZNF598 за 24 часа, последвано от трансфекция на репортерните плазмиди за 48 часа. Western блотове за KDs са показани в Допълнителен файл 1: Фигура S8A. RFP и GFP сигналите бяха анализирани чрез поточна цитометрия. Средни RFP:GFP съотношения, нормализирани към K0 в контрол, са показани. Лентите за грешки представляват s.d.m. П стойности, посочени по-горе (сдвоени двустранни Student’s T тест, корекция на Бенджамини-Хохберг, н ≥ 6 повторения ns, незначително). Анализи за вложки, кодиращи 12 лизина (K(AAA)12) и десет аргинина (R(CGA)10) в двойния флуоресцентен репортер са показани в Допълнителен файл 1: Фигура S7A. ° С Експресията на MKRN1 wt може да спаси забавянето на рибозомата. HEK293T клетъчни линии със стабилни интеграции на siRNA2-нечувствителни MKRN1 диви тип и мутантни конструкции, или празен вектор, бяха трансфектирани с MKRN1 siRNA2 за 24 часа, последвано от трансфекция на репортерните плазмиди за 48 часа. RFP и GFP сигналите бяха анализирани чрез поточна цитометрия. Средни RFP:GFP съотношения, нормализирани към K0 в WT клетки, са показани. Лентите за грешки представляват s.d.m. П стойности, посочени по-горе (сдвоени двустранни Student’s T тест, корекция на Бенджамини-Хохберг, н = 6 повторения ns, незначително). Анализи за репортерни плазмиди с вложки, кодиращи K(AAA)12 или R(CGA)10 са показани в Допълнителен файл 1: Фигура S7B. д MKRN1 нокаут (MKRN1 KO) и дивия тип (WT) HEK293T клетки бяха трансфектирани с репортерните плазмиди за 48 часа. Измервания, анализи и визуализация, както в ° С (н = 4 повторения). Анализи за репортерни плазмиди с вложки, кодиращи K(AAA)12 или R(CGA)10 са показани в Допълнителен файл 1: Фигура S7C (д)

Както беше съобщено по-рано, вмъкването на K(AAA)20 линкер (кодиращ 20 лизинови остатъка) в репортера доведе до преобладаващо спиране на рибозомите в сравнение с изходния вектор (K0, Фиг. 4b и Допълнителен файл 1: Фигура S7). Важното е, MKRN1 изчерпването с две независими siRNA доведе до възпроизводимо възстановяване на експресията на RFP след K(AAA)20, което предполага, че много рибозоми не са успели да спрат при K(AAA)20 (MKRN1 KD1 и KD2 Фиг. 4b, Допълнителен файл 1: Фигура S7A, S8A, B и Допълнителен файл 3: Фигура S12). MKRN1 KD2 изглеждаше малко по-ефективен, вероятно защото тази siRNA едновременно намалява нивата на транскрипта на близкия паралог MKRN2 (Допълнителен файл 1: Фигура S8B). Специфичното въздействие на MKRN1 върху задържането на рибозомите беше допълнително подкрепено чрез допълване на MKRN1 KD със стабилна интеграция на MKRN1 конструкции. Само MKRN1 wt беше в състояние частично да върне ефекта на KD, така че задържането на рибозомата беше частично възстановено, докато нито един от MKRN1 мутантите не беше функционален в този анализ (Фиг. 4c и Допълнителен файл 1: Фигура S7B). Освен това открихме, че MKRN1 KD2 не повлия на изобилието на основната репортерна РНК (Допълнителен файл 1: Фигура S7D), което показва, че RQC за този репортер не е свързан със значителна дестабилизация на иРНК в клетките HEK293T, в съответствие с предишно проучване [8].

За да свържем ефекта на MKRN1 с други играчи от пътя на RQC, ние съборихме ZNF598, E3 убиквитин лигазата, за която наскоро беше съобщено, че спира рибозомите по време на RQC [8,9,10]. Важното е, MKRN1 KD2 нарушава забавянето на рибозомата в подобна степен като KD на ZNF598. Едновременно изчерпване на MKRN1 и ZNF598 не беше адитивен, което показва, че и двата протеина работят по един и същи път (Фиг. 4b и Допълнителен файл 1: Фигура S7A). Не можахме да открием взаимодействие между MKRN1 и ZNF598 в падащи експерименти (фиг. 1d). Въпреки това, ние отбелязахме известно ниво на кръстосано регулиране, като например ZNF598 експресията е намалена в MKRN1 KD1 (но не в MKRN1 KD2), докато ZNF598 намалена свръхекспресия MKRN1 израз (Допълнителен файл 1: Фигура S8). Като цяло, тези резултати предполагат, че MKRN1 изпълнява специфична функция в RQC, допълваща ZNF598.

За независимо валидиране на резултатите от KD, ние генерирахме стабилна MKRN1 нокаут (KO) клетъчна линия, използвайки CRISPR/Cas9 редактиране на генома (Допълнителен файл 1: Фигура S8C,D). Анализите на репортерите показаха, че пълна загуба на MKRN1 нарушено задържане на рибозома при K(AAA)20, макар и с по-малък размер на ефекта в сравнение с медиираната от siRNA KD (фиг. 4d и допълнителен файл 1: фигура S7C). qPCR показва компенсаторно регулиране на паралога MKRN2 в MKRN1 КО, но не и в MKRN1 KD (Допълнителен файл 1: Фигура S8B,D), което може да обясни намаления размер на ефекта на MKRN1 КО в репортерските анализи. В съответствие с частично излишната роля на MKRN2, откриваме, че едновременното изчерпване на MKRN1 и MKRN2, както се наблюдава при KD с siRNA2 (Допълнителен файл 1: Фигура S8B), показва по-голям ефект от KD с siRNA1, който не се променя MKRN2 нива.

Въз основа на тези резултати, ние предлагаме MKRN1 като нов играч в RQC, който допринася за ефективно спиране на рибозомите при poly (A) последователности. Нашите експерименти предполагат, че тази функция вероятно зависи от взаимодействието на MKRN1 с PABPC1, както и от неговата E3 убиквитин лигазна активност.

MKRN1 медиира убиквитилирането на RPS10 и PABPC1

RQC се основава на серия от събития на убиквитилиране от множество E3 убиквитин лигази, включително Listerin и ZNF598 [5]. За да идентифицираме предполагаемите убиквитилиращи субстрати на MKRN1, направихме профилиране на остатъците от убиквитин, за да сравним относителното изобилие на ди-глицин-модифицирани лизини в MKRN1 KD и контролни клетки. Определихме количествено 2324 места за убиквитилиране (в 1264 протеина), които бяха открити във всичките четири повторни експеримента (Допълнителен файл 4: Таблица S3). По-специално, MKRN1 изчерпването доведе до значително намалено изобилие от 29 места за убиквитилиране на 21 протеина (FDR < 10%, Фиг. 5а). Сравняването на относителното изобилие от предполагаеми субстрати в общите екстракти показа, че нито един от тях не се е променил значително в MKRN1 KD клетки, което предполага, че убиквитилирането не предизвиква значително разграждане на тези протеини (Допълнителен файл 1: Фигура S9A и Допълнителен файл 5: Таблица S4). Този резултат беше допълнително потвърден от Western blot за няколко протеина, които бяха идентифицирани като предполагаеми MKRN1 субстрати (Допълнителен файл 1: Фигура S9B).

MKRN1 убиквитилира рибозомния протеин RPS10 и транслационни регулатори. а Профилиране на остатъците от убиквитин, за да се сравни относителното изобилие от места за убиквитилиране в MKRN1 KD2 и контролни клетки HEK293T. Остатъчните пептиди на убиквитин бяха обогатени и анализирани чрез количествена масспектрометрия, като се определят количествено общо 15 528 места за убиквитилиране върху 4790 протеина. 29 предполагаеми целеви места за MKRN1 със значително намалена убиквитилация MKRN1 KD2 (FDR < 10%, н = 4 повторения) са маркирани и етикетирани със съответното име на протеин. Имайте предвид, че много протеини съдържат няколко диференциално регулирани места за убиквитилиране. б Мрежа за взаимодействие на протеини от 21 протеина с предполагаеми целеви места за убиквитилация на MKRN1 (значително намалена, показано на а). Функционалните взаимодействия са получени от базите данни STRING и BioGrid и нашето проучване. Визуализация от Cytoscape. ° С Резултати от профилирането на остатъка от убиквитин за значително регулирани места за убиквитилиране (FDR < 10%) в протеини от мрежа в б. Средната стойност и стандартното отклонение на средната стойност (s.d.m., ленти за грешки) са дадени заедно с всички точки от данни. д Сравнение на интерактома на GFP-MKRN1 wt (WT над GFP, виж Фиг. 1а) с предполагаеми субстрати за убиквитилиране на MKRN1 от профилиране на остатъците от убиквитин (UB, вж. а). Наименованията на протеини са дадени за всички субстрати за убиквитилиране. д Резултати от профилиране на остатък от убиквитин за седем количествено определени места за убиквитилиране в RPS10 и RPS20. Значителните промени са показани в черно (FDR < 10%), а незначителните промени в сиво. Представителство като в ° С. е Сравнение на местата за убиквитилиране в целевите протеини RPS10 (UniProt ID P46783), RPS20 (P60866), PABPC1 (P11940), PABPC4 (B1ANRO), IGF2BP1 (Q9NZI8), IGF2BP2 (F8WIGF2P), които са модифицирани от Z3WIGF2P2 (F8WIGF2P) и Z5W9F20, които са модифицирани от Z3WIGF2P, и MKRN1 по време на RQC. ж MKRN1 убиквитилира RPS10 и PABPC1 in vitro. His-RPS10 (left) or His-PABPC1 (right) were incubated with or without His-MKRN1. Ubiquitylation of the target proteins was assessed by Western blot. Replicates 2, 3, and uncropped gel images are shown in Additional file 3: Figure S12I,J for RPS10 and Additional file 3: Figure S12K,L for PABPC1

The majority of the ubiquitylation targets formed a functional cluster of translational regulators based on our own interactome data, previously reported protein-protein interactions, and functional annotations (Fig. 5b and Additional file 1: Figure S9C). Intriguingly, we identified a MKRN1-dependent ubiquitylation site on RPS10, a 40S ribosomal protein that was previously reported to be modified by ZNF598 during RQC [8,9,10]. Тук, MKRN1 KD led to a significant decrease in ubiquitylation at lysine 107 of RPS10 (K107 Fig. 5c–f). В допълнение, MKRN1 KD decreased ubiquitylation of a number of interaction partners including PABPC1/4, IGF2BP1/2/3, LARP1, MOV10, and ELAVL1 (Fig. 5d). In order to test whether MKRN1 can directly modify RPS10 and PABPC1, we performed in vitro ubiquitylation assays with recombinant proteins. Western blot experiments detected the appearance of multiple mono- and poly-ubiquitylated variants of RPS10 and PABPC1, illustrating that MKRN1 efficiently ubiquitylated both proteins (Fig. 5g). We therefore propose that rather than recruiting ZNF598 or another E3 ubiquitin ligase, MKRN1 plays an active role in RQC by regulatory ubiquitylation of RPS10.


Biological characterization of various forms of elongation factor 1 from rabbit reticulocytes

Two forms of elongation factor 1 (EF-1) have been tested for a variety of biological functions. One form, EF-1H, is a high-molecular-weight aggregate (Mr greater than 500,000) containing four distinct polypeptides (alpha, beta, gamma, delta). The other form, EF-1 alpha, consists of a single polypeptide which is the same as the alpha subunit of EF-1H. Both EF-1 alpha and EF-1H function catalytically in binding Phe-tRNA to ribosomes, and in poly(U)-directed polyphenylalanine synthesis. The activity of EF-1 alpha is enhanced in polyphenylalanine synthesis by a complementary component, EF-1 beta delta. It is also shown that EF-1 beta delta can facilitate an exchange of EF-1 alpha-bound GDP for GTP. The EF-1 alpha dissociation constants for GDP and GTP were 0.47 and 0.55 microM respectively, while the EF-1H dissociation constants for GDP and GTP were 2.0 and 1.6 microM, respectively. Thus, while EF-1 alpha and EF-1H had approximately the same affinities for GDP and GTP, the EF-1 alpha dissociation constants were about fourfold lower than the EF-1H dissociation constants. Attempts to isolate complexes of EF-1 alpha or EF-1H with GTP and Phe-tRNA or with GTP, Phe-tRNA, and ribosomes were unsuccessful using either Millipore filters, gel filtration, or sucrose density gradients. The results presented in this report, along with studies from other laboratories, strengthen the hypothesis that the general mechanism of the elongation cycle is similar in eucaryotes and procaryotes.


Абстрактно

Significant effort has been devoted to fabricating various biomaterials to satisfy specific clinical requirements. In this study, we developed a new type of guided tissue regeneration (GTR) membrane by electrospinning a suspension consisting of poly( l -lactic acid), multiwalled carbon nanotubes, and hydroxyapatite (PLLA/MWNTs/HA). MWNTs/HA nanoparticles were uniformly dispersed in the membranes, and the degradation characteristics were far improved. Cytologic research revealed that the PLLA/MWNTs/HA membrane enhanced the adhesion and proliferation of periodontal ligament cells (PDLCs) by 30% and inhibited the adhesion and proliferation of gingival epithelial cells by 30% also, compared with the control group. After PDLCs were seeded into the PLLA/MWNTs/HA membrane, cell/membrane composites were implanted into the leg muscle pouches of immunodeficient mice. Histologic examinations showed that PDLCs attached on the membranes functioned well in vivo. This new type of membrane shows excellent dual biological functions and satisfied the requirement of the GTR technique successfully in spite of a monolayer structure. Compared with other GTR membranes on sale or in research, the membrane can simplify the manufacturing process, reduce the fabrication cost, and avoid possible mistakes in clinical application. Moreover, it does not need to be taken out after surgery. PLLA/MWNTs/HA membranes have shown great potential for GTR and tissue engineering.


Абстрактно

Two different series of polyethylenimine (PEI) block copolymers grafted with linear poly(ethylene glycol) (PEG) were investigated as delivery systems for oligodeoxynucleotides (ODN) and ribozymes. The resulting interpolyelectrolyte complexes were characterized with respect to their physicochemical properties, protection efficiency against enzymatic degradation, complement activation, and biological activity under in vitro conditions. The effect of PEG molecular weight and the graft density of PEG blocks on complex characteristics was studied with two different series of block copolymers. The resulting ODN complexes were characterized by photon correlation spectroscopy (PCS) and laser Doppler anemometry (LDA) to determine complex size and zeta potential. Electrophoresis was performed to study the protective effects of the different block copolymers against enzymatic degradation of ODN. Intact ODN was quantified via densitometric analysis. Ribozymes, a particularly unstable type of oligonucleotides, were used to examine the influence of block copolymer structure on biological activity. The stabilization of ribozymes was also characterized in a cell culture model. Within the first series of block copolymers, the grafted PEG chains (5 kDa) had marginal influence on the complex size. Two grafted PEG chains were sufficient to achieve a neutral zeta potential. Within the second series, size and zeta potential increased with an increasing number of PEG chains. A high number of short PEG chains resulted in a decrease in complex size to values comparable to that of the homopolymer PEI 25 kDa and a neutral zeta potential, indicating a complete shielding of the charges. Complement activation decreased with an increasing number of short PEG 550 Da chains. Ribozyme complexes with PEG-PEI block copolymers achieved a 50% down-regulation of the target mRNA. This effect demonstrated an efficient stabilization and biological activity of the ribozyme, which was comparable to that of PEI 25 kDa. PEGylated PEI block copolymers represent a promising new class of drug delivery systems for ODN and ribozymes with increased biocompatibility and physical stability.


Принадлежности

School of Chemistry, University of Birmingham, Edgbaston, Birmingham, UK

Thomas Leigh & Paco Fernandez-Trillo

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Вноски

T.L. and P.F.-T. reviewed the literature, organized the Review and designed the figures. P.F.-T. wrote the manuscript, with both authors contributing to the final version of the Review.

Corresponding author


3 STRUCTURE AND FUNCTION OF NATURAL RNA TRIPLE HELICES

Experimental techniques to detect major-groove triple helices in nucleic acids include circular dichroism spectroscopy, oligonucleotide binding assays (e.g., isothermal titration calorimetry, native gel-shift assay, surface plasmon resonance), fluorescence resonance energy transfer, infrared spectroscopy, structure mapping (chemical or nuclease), UV thermal denaturation assay, and compensatory base triple mutations (e.g., stepwise substitution of putative U•A-U with C + •G-C base triple) coupled with functional assay appropriate for triple helix-of-interest. These techniques generate results that would be consistent with the formation of a triple helix. Importantly, direct evidence comes from solving 3D structures using X-ray crystallography, nuclear magnetic resonance (NMR), or single-particle cryogenic-electron microscopy (cryo-EM) methodologies. Because simplified in vitro systems for structural studies can artificially induce the formation of a triple helix, it is ideal to have a cell-based assay in which the parent RNA harboring the triple helix, either endogenous or exogenous, can be studied in its true physiological environment. To validate an RNA triple helix, experimental evidence from two or more orthogonal approaches is desired, preferably direct evidence coupled with a cell-based assay examining compensatory base triple mutants. The structure and function of natural RNA triple helices, defined herein as two consecutive base triples along helical axis, that have been visualized using X-ray crystallography, NMR and/or cryo-EM are described below. Thus far, three major biological functions have been determined: Catalysis, ligand binding, and stability element.

3.1 RNA triple helix is required for telomerase catalytic activity

150 to >3,000 nucleotides) and sequence, their structures from various eukaryotic organisms, such as budding yeast, ciliates, and vertebrates, have a conserved H-type pseudoknot (Figures 1c and 3) that includes a major-groove triple helix (Cash et al., 2013 J. L. Chen, Blasco, & Greider, 2000 Shefer et al., 2007 Theimer et al., 2005 Tzfati, Knight, Roy, & Blackburn, 2003 Ulyanov, Shefer, James, & Tzfati, 2007 ).

Human TR was the first naturally occurring U•A-U major-groove RNA triple helix to have its 3D structure solved, which was almost 50 years after poly(U•A-U) triple helices had been reconstituted in a test tube by Felsenfeld and co-workers (Felsenfeld et al., 1957 Theimer et al., 2005 ). Since then, solution NMR structures have been solved for human TR (Figure 3), Kluyveromyces lactis TR and Tetrahymena thermophila TER (Table 1 Cash et al., 2013 Cash & Feigon, 2017 Kim et al., 2008 Theimer et al., 2005 ). These structures show that the major-groove triple helix is composed of two to five U•A-U base triples along with a protonated C + •G-C base triple in K. lactis and a protonated A + •G-C base triple in T. thermophila (Table 1 Cash et al., 2013 Cash & Feigon, 2017 Kim et al., 2008 Theimer et al., 2005 ). These major-groove triple helices are extended by nearby minor-groove base triples, forming a nearly continuous triple helix that may form cooperatively (Cash & Feigon, 2017 Chen, Chang, Chou, Bustamante, & Tinoco Jr., 2009 Kim et al., 2008 Theimer et al., 2005 ). Importantly, the presence of a major-groove triple helix in TR is further supported by mutating individual U•A-U base triples to the isosteric C•G-C base triple (Cash et al., 2013 Cash & Feigon, 2017 G. Chen et al., 2009 Qiao & Cech, 2008 Shefer et al., 2007 Theimer et al., 2005 ). For human TR, this compensatory mutational analysis showed that the C•G-C-containing mutant is thermodynamically more stable at pH 5 than pH 7 based on UV thermal denaturation assays and that the complete triple mutation is necessary to recover telomerase activity in an in vitro TRAP (telomeric repeat amplification protocol) assay, demonstrating that the triple helix is essential for catalysis (Theimer et al., 2005 ). A similar base triple compensatory mutational analysis was performed and similar outcomes were observed for K. lactis, Saccharomyces cerevisiae (TLC1) and T. thermophila TRs using various in vitro and cell-based assays to monitor telomerase activity (Cash et al., 2013 Cash & Feigon, 2017 Qiao & Cech, 2008 Shefer et al., 2007 ). Collectively, these studies demonstrate that the triple helix structure, not sequence, is conserved and is required for telomerase activity.

Originally, it was thought that the 2′-hydroxyl of A176, which participates in a U•A-U base triple, played a direct role in catalysis (Qiao & Cech, 2008 ). However, cryo-EM structures of the human and Тетрахимена telomerase holoenzyme both show the pseudoknot forming an arc-like structure that partially encircles TERT, positioning the triple helix on the opposite side of TERT's active site (Jiang et al., 2015 Nguyen et al., 2018 ). In light of these recent structural findings, it appears that the triple helix contributes to the proper folding of the pseudoknot, whose structure is essential for a fully assembled and catalytically active RNP (Cash et al., 2013 Cash & Feigon, 2017 Liu & Theimer, 2012 Mihalusova, Wu, & Zhuang, 2011 Qiao & Cech, 2008 Shefer et al., 2007 Theimer et al., 2005 Tzfati et al., 2003 ). Thus, the dynamics of a distal tertiary structural element are coupled to catalysis.

3.2 RNA triple helix coordinates catalytic magnesium ions during splicing

Introns are intervening noncoding RNA sequences that are removed from precursor RNAs (e.g., mRNA, rRNA, and tRNA) in a process known as splicing. RNA splicing proceeds in two sequential phosphotransesterification reactions: First 5′ splice site cleavage and then 3′ splice site cleavage so that the two RNA segments can be ligated together. Interestingly, this splicing reaction occurs at a single catalytic center and requires a “catalytic triplex” for both group II introns and the eukaryotic spliceosome. High-resolution 3D structural studies of group II introns and the spliceosome have shown that their active site architectures are highly conserved, supporting the hypothesis that these RNA catalysts share a common molecular ancestor (see [Galej et al. ( 2018 )] for review).

Group II introns are self-splicing ribozymes found in all three domains of life. Based on RNA secondary structures, group II introns are classified as IIA to IIF and are generally 400–800 nucleotides in length (see [Smathers and Robart ( 2019 )] for a review). Group II introns form a six-domain structure (I–VI), with the catalytic triplex residing in domain V. A fully formed catalytic triplex consists of three consecutive base triples, which includes the so-called “catalytic triad” (Table 1 Chan et al., 2018 Haack et al., 2019 Marcia & Pyle, 2012 Toor et al., 2008 ). The catalytic triad is the most highly conserved region across group IIA–C introns. Two common catalytic triads are AGC and CGC, which refer to the nucleotides in the purine-rich strand of the catalytic triplex. For example, the AGC catalytic triad from the Pylaiella littoralis group IIB intron corresponds to the U• A -U/G• G -U/A• C -G catalytic triplex, where the underlined nucleotides denote the catalytic triad (Table 1 Chan et al., 2018 ). A combination of mutational, phosphorothioate substitution, and metal rescue analyses have shown that the catalytic triplex of the ai5γ group II intron from S. cerevisiae is essential for splicing because the phosphate backbone interacts with at least two divalent magnesium ions (Boulanger et al., 1995 Gordon, Fong, & Piccirilli, 2007 Gordon & Piccirilli, 2001 Sontheimer, Gordon, & Piccirilli, 1999 ). These two metal ions activate the nucleophile in the second step of splicing (i.e., exon-ligation) and stabilize the leaving groups during both splicing steps (Gordon et al., 2007 Gordon & Piccirilli, 2001 Sontheimer et al., 1999 ). 3D structural studies have subsequently confirmed that the negatively charged phosphate backbones of the catalytic triplex coordinate two magnesium ions with high affinity, consistent with a two metal-ion mechanism (Figure 4a Chan et al., 2018 Haack et al., 2019 Marcia & Pyle, 2012 , 2014 Robart, Chan, Peters, Rajashankar, & Toor, 2014 Steitz & Steitz, 1993 Toor et al., 2008 ). Along with metal binding, the triple helix is thought to mediate the transition between the two steps of splicing, for RNA structural probing studies and comparative analyses of crystallographic structures during the splicing reaction cycle have observed the catalytic triplex undergoing dynamic conformational transitions (Chan et al., 2018 Marcia & Pyle, 2012 ). Although group II introns require a maturase protein for activity in vivo, it appears that the maturase protein does not interact with the catalytic triplex, for the maturase protein is more than 10 Å from the catalytic triplex in a cryo-EM structure of the Lactococcus lactis group IIA intron-LtrA maturase complex (Qu et al., 2016 ). Altogether, most structural and mechanistic observations for the group II intron, including the catalytic triplex, apply to the eukaryotic spliceosome.

The eukaryotic spliceosome is an RNP complex whose composition is dynamic throughout the splicing cycle: Five small nuclear RNPs (i.e., U1, U2, U4, U5, and U6 snRNPs) and numerous proteins to form a multi-megadalton complex. This RNP is responsible for pre-mRNA splicing in eukaryotes (see [Wilkinson, Charenton, & Nagai, 2019 ] for review). Like group II introns, the active site of the spliceosome has a catalytic triplex that (a) includes a catalytic triad and (b) uses its phosphate backbone to coordinate two catalytic magnesium ions, which stabilize the leaving groups of each step in the splicing reaction (Figure 4a and Table 1 Fica, Mefford, Piccirilli, & Staley, 2014 Fica et al., 2013 Gordon, Sontheimer, & Piccirilli, 2000 Sontheimer, Sun, & Piccirilli, 1997 Yean, Wuenschell, Termini, & Lin, 2000 ). The intermolecular catalytic triplex forms via Watson–Crick base pairing between the U2 and U6 snRNAs, and the Hoogsteen strand nucleotides in U6 snRNA includes two nucleotides (underlined GA) from the ACAGA GA sequence that recognizes the 5′-splice site of intron (Bertram et al., 2017 Fica et al., 2014 Hang et al., 2015 Mefford & Staley, 2009 Wan et al., 2016 Yan et al., 2015 Yan, Wan, Bai, Huang, & Shi, 2016 ). These interactions bring together the 5′-splice site and the metal-bound catalytic triplex at the active site. Thus far, cryo-EM structures of the spliceosome have predicted a relatively rigid catalytic center, including the catalytic triplex, once the activated spliceosome forms (L. Zhang, Vielle, Espinosa, & Zhao, 2019 ). In contrast, yeast genetic studies suggest the catalytic core undergoes conformational rearrangements, toggling between catalytically active and inactive conformations (Eysmont, Matylla-Kulinska, Jaskulska, Magnus, & Konarska, 2019 ). Most nucleobases in the U2–U6 catalytic triplex appear to be dispensable for splicing in S. cerevisiae whole-cell extract, suggesting that proteins play an important role in stabilizing the U2–U6 snRNAs (Bao, Boon, Will, Hartmuth, & Luhrmann, 2018 ). Unlike group II introns, the catalytic triplex of the spliceosome is embedded in a protein cavity therefore, most RNA–protein contacts are established between the sugar-phosphate backbone of the catalytic triplex and the side chains of arginine, lysine, glutamine, and serine. However, a cryo-EM structure of the S. cerevisiae spliceosome C complex suggests that the side chain of His5 from CWC2P has the potential to mediate two hydrogen bonds: One with N2 of the Hoogsteen G in the G •G-C base triple and one with O6 of G in the U•C-G base triple (Figure 4b and Table 1 Wan et al., 2016 ). This putative arrangement illustrates a novel way in which proteins may recognize two stacked base triples. Finally, it should be mentioned that the minor spliceosome is predicted to form a similar catalytic triplex by the U6atac and U12 snRNAs based on sequence conservation and biochemical studies. The catalytic triplex in group II self-splicing introns and the spliceosome demonstrates how triple helices can mediate essential biological functions and likely more examples remain to be discovered.

3.3 RNA triple helix as a ligand-binding site

Riboswitches are highly conserved RNA structural elements (or aptamers) used primarily by bacteria to control gene expression in response to intracellular ligand binding. Като цис-regulatory element typically in the 5′ untranslated region of mRNAs, riboswitches can sense ligands, usually a metabolite or ion, and subsequently adopt a ligand-bound structure that will accordingly turn transcription or translation ON/OFF (see [Breaker, 2018 ] for a review). Over 100,000 riboswitches have been discovered among

47 riboswitch classes, which are classified by ligand identity (P. J. McCown, Corbino, Stav, Sherlock & Breaker, 2017 ).

Thus far, 3D structures have been solved for

30 different riboswitch classes and six of them revealed a major-groove triple helix in their ligand-bound states: Cyclic-dimeric-guanosine monophosphate (c-di-GMP)-II, guanidine-III, prequeosine (PreQ1)-II, PreQ1-III, С-adenosylmethionine (SAM)-II, and SAM-V (Table 1 Gilbert et al., 2008 L. Huang & Lilley, 2018 L. Huang et al., 2017 Kang et al., 2014 Liberman et al., 2013 Liberman et al., 2015 Smith et al., 2011 ). In general, riboswitch triple helices are composed of two canonical U•A-U base triples and one to four noncanonical base triples that are arranged together in a classic H-type pseudoknot or a related variant (Figures 1c and 5). Importantly, the ligand in all six riboswitches is recognized by the triple helix. For the five RNA-derived ligands, their nucleobases participate in a noncanonical base triple or quadruplet (Figure 5 and Table 1). For example, the adenine moiety of SAM is engaged in an ASAM•U reverse Hoogsteen base pair of an ASAM•U•U triple and PreQ1 is recognized by cytidine via транс-Watson–Crick interactions in an A•U•PreQ1•C quadruplet (Figure 5a,b Gilbert et al., 2008 L. Huang & Lilley, 2018 Kang et al., 2014 Liberman et al., 2013 Liberman et al., 2015 ). In the c-di-GMP-II riboswitch crystal structure, the two guanine bases of c-di-GMP are differentially recognized: One guanine engages in a minor-groove c-di-GMP•A-U base triple whereas the other guanine forms hydrogen bonds with nearby nucleotides and a hydrated magnesium ion (Figure 5c Smith et al., 2011 ). Interestingly, ligands that lack a nucleobase moiety can also be recognized by a triple helix. The one lone example, the guanidinium ion, is coordinated by a guanine in a noncanonical A•C-G base triple and another guanine in a G•A-U•C quadruplet (Figure 5d L. Huang et al., 2017 ). Because several hundred “undiscovered” riboswitch classes are predicted (P. J. McCown, Corbino, Stav, Sherlock, & Breaker, 2017 ), it will be interesting to learn if these riboswitches use triple helices to capture ligands, particularly ligands that do not have chemical moieties mimicking nucleotides.

With various binding modes of ligands and base triples being observed, it is not surprising that a broad range of equilibrium dissociation constants have been measured for the six riboswitch-ligand complexes: 200 pM to 2 nM for c-di-GMP-II, 60 μM for guanidine-III, 17.9 nM–6.6 μM for PreQ1-II, 6.5–900 nM for PreQ1-III, 670 nM for SAM-II, and 0.5–150 μM for SAM-V (Gilbert et al., 2008 L. Huang & Lilley, 2018 Kang et al., 2014 Lee, Baker, Weinberg, Sudarsan, & Breaker, 2010 Liberman et al., 2013 Liberman et al., 2015 P. J. McCown, Liang, Weinberg, & Breaker, 2014 Meyer, Roth, Chervin, Garcia, & Breaker, 2008 Poiata, Meyer, Ames, & Breaker, 2009 Sherlock & Breaker, 2017 ). Importantly, divalent ions can strengthen ligand-binding affinity up to 85-fold for the пневмокок PreQ1-II riboswitch (Kang et al., 2014 ), a finding that prompts the question: To what extent is the triple helix (or pseudoknot) formed in the absence of ligand (see [Jones & Ferre-D'Amare, 2017 ] for review on ligand-binding pocket conformations)? Having three electronegative strands, triple helices are more stable in the presence of magnesium ions (Felsenfeld et al., 1957 ). Thus, it is difficult to parse whether ligands bind to a preformed triple helix or if ligand binding induces the formation of a triple helix. At least for the metX SAM-II riboswitch, both magnesium and ligand-binding seem to be required for the fully-folded ligand-bound conformation, although magnesium plays a critical role in pre-organizing the riboswitch toward a binding-competent state but it still lacks the triple helix in the absence of SAM (B. Chen, Zuo, Wang, & Dayie, 2012 Haller, Rieder, Aigner, Blanchard, & Micura, 2011 Roy et al., 2017 ). Similarly, two U•A-U base triples in the Lactobacillus rhamnosus PreQ1-II riboswitch include A nucleotides from the ribosome-binding site therefore, the triple helix forms after ligand binding (Aytenfisu, Liberman, Wedekind, & Mathews, 2015 Liberman et al., 2013 Souliere et al., 2013 Warnasooriya et al., 2019 ). Another consideration is that proteins could participate in the folding and conformational states of some riboswitches, although proteins are not required for ligand binding to the current experimentally validated riboswitches (Breaker, 2012 ). Importantly, the RNA triple helix can mediate both ligand binding and expression output for select riboswitches and the functional coupling is only beginning to be understood (Dutta & Wedekind, 2019 ).

Finally, it should be noted that riboswitches using a triple helix as a ligand-binding site are not coupled to a single mechanism for controlling gene expression. The ligand-bound forms of the c-di-GMP-II (Lee et al., 2010 ) and guanidine-III (Sherlock & Breaker, 2017 ) riboswitches turn ON translation while PreQ1-II (Dutta, Belashov, & Wedekind, 2018 Meyer et al., 2008 Neuner, Frener, Lusser, & Micura, 2018 Van Vlack, Topp, & Seeliger, 2017 ), PreQ1-III (Liberman et al., 2015 Van Vlack et al., 2017 ), metX SAM-II (Gilbert et al., 2008 ), and SAM-V riboswitches (L. Huang & Lilley, 2018 Poiata et al., 2009 ) turn OFF translation. Thus, there are instances where ligand binding leads to sequestration of the ribosome-binding site into a triple helix to turn OFF translation and other instances where the ribosome-binding site is released upon ligand binding, thereby turning ON translation. Proteins are involved in these processes to turn translation ON/OFF. Ribosomal protein S1 interacts with various conformations of the Thermoanaerobacter tengcongensis PreQ1-I riboswitch, a structure whose ligand-binding site resides in a minor-groove triple helix (Jenkins, Krucinska, McCarty, Bandarian, & Wedekind, 2011 Lund, Chatterjee, Daher, & Walter, 2019 ). Likewise, it will be interesting to learn if proteins can recognize riboswitches that possess a major-groove triple helix. Overall, riboswitches show how triple helices play an important role in sensing ligands and in regulating expression of prokaryotic genes.

3.4 RNA triple helix as a stability element

RNA triple helices have been cleverly co-opted by viruses to stabilize RNA. The first example was a triple helix found in the polyadenylated nuclear (PAN) RNA, which is a highly abundant nuclear lncRNA expressed by the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) during the lytic phase of infection and plays various roles in gene expression (Conrad, 2016 Mitton-Fry et al., 2010 Sun, Lin, Gradoville, & Miller, 1996 Zhong, Wang, Herndier, & Ganem, 1996 ). The KSHV PAN RNA triple helix resides at the 3′ end and consists of two цис-acting RNA elements: A stem-loop structure containing a U-rich internal loop and a 3′-poly(A) tail (Figure 6a). An X-ray crystal structure of the KSHV PAN RNA triple helix shows the U-rich internal loop engaged with oligo A9, forming five U•A-U major-groove base triples and three A-minor base triples (Figure 6a Mitton-Fry et al., 2010 ). This extensive network of tertiary interactions protects the poly(A) tail and inhibits rapid nuclear RNA decay, establishing one mechanism by which PAN RNA accumulates to high levels in KSHV-infected cells (Conrad, 2016 Conrad, Mili, Marshall, Shu, & Steitz, 2006 Conrad, Shu, Uyhazi, & Steitz, 2007 Conrad & Steitz, 2005 Mitton-Fry et al., 2010 Sun et al., 1996 Zhong et al., 1996 ). Notably, the triple-helical structure itself, without any protein cofactors, is necessary and sufficient to inhibit deadenylation catalyzed by purified recombinant PARN (poly(A)-specific ribonuclease) in an in vitro system (Conrad et al., 2006 ). Collectively, the KSHV PAN RNA triple helix revealed a novel mechanism by which a viral lncRNA counteracted nuclear RNA decay. Because the mechanism was originally found in a viral lncRNA, this work prompted the question: Do other viral and host RNAs harbor triple-helical RNA stability elements?

Indeed, similar stability elements abound in nature, for more than 200 have been computationally identified in (a) lncRNAs expressed by dsDNA viruses, the MALAT1 lncRNA in vertebrates and likely the MENβ lncRNA in mammals (b) genomic ssRNA(+) from dicistroviruses and (c) transposable elements, including those that are transposase mRNAs from plants, fungi, slime mold, and stickleback fish retroviruses (Brown et al., 2012 Tycowski, Shu, Borah, Shi, & Steitz, 2012 Tycowski, Shu, & Steitz, 2016 Wilusz et al., 2012 B. Zhang et al., 2017 ). Among the 200+ stability elements predicted to date, the functionality of about 10 has been confirmed by their ability to stabilize heterologous intronless β-globin or GFP reporter mRNAs, a function that is likely mediated by formation of a triple helix (Brown et al., 2012 Tycowski et al., 2012 , 2016 Wilusz et al., 2012 ). More interestingly, structural analyses revealed that the stability elements can be classified as single or double domain, whereby each U-rich internal loop represents a domain (Figure 6a,b Tycowski et al., 2016 ). Most of the plant transposable elements possess a double-domain stability element (Tycowski et al., 2016 ). Here, the upper domain resembles the canonical KSHV PAN U-rich stem-loop whereas the lower domain shows two notable structural differences: A 3- or 4-nucleotide-long bulge and the A-minor stem interrupted by a bulge or an internal loop (Tycowski et al., 2016 ). Like the single-domain stability elements, the poly(A) tail is predicted to interact with both U-rich internal loops, although mutational studies indicate the upper domain of the TWIFB1_OSa structure is responsible for most stabilization activity (Figure 6b Tycowski et al., 2016 ). Currently, there is no 3D structure of a double-domain stability element therefore, it will be interesting to learn the structural significance of the upper domain over the lower domain and if the poly(A) tail engages in tertiary interactions with the stem connecting the upper and lower domains.

Among the 200+ stability elements discovered to date, the MALAT1 and MENβ structures are distinctly different from all others (Figure 6). The MALAT1 and MENβ lncRNAs undergo 3′-end processing by RNase P due to the presence of tRNA-like structures in their transcripts and the resulting mature forms of MALAT1 and MENβ terminate with genomically encoded A-rich tracts rather than 3′-poly(A) tails (Sunwoo et al., 2009 Wilusz, Freier, & Spector, 2008 ). The single-domain MALAT1 and MENβ stability elements have U-rich internal loops uniquely interrupted by G and C nucleotides that interact with the complementary nucleotides in the downstream A-rich tract so that the triple helices have a blunt end, rather than a 3′-poly(A) tail overhang predicted for others (Figure 6 Brown et al., 2012 , 2014 Wilusz et al., 2012 ). The blunt-ended triple helix of MALAT1 effectively inhibits the rapid phase of nuclear RNA decay whereas the KSHV PAN RNA triple helix only reduces the rapid phase according to a cell-based intronless β-globin reporter decay assay in HeLa-TetOff cells (Brown et al., 2014 Conrad et al., 2006 ). However, the decay machinery for the MALAT1 and KSHV PAN triple helices may be different. While KSHV PAN undergoes a deadenylation-dependent decay due to its poly(A) tail, the 3′ end of MALAT1 is sequestered into a blunt-ended triple helix therefore, it may first require a helicase, such as DHX9, to disrupt the triple helix and/or undergo oligouridylation (Brown et al., 2016b Jain, Bacolla, Chakraborty, Grosse, & Vasquez, 2010 Wilusz et al., 2012 ). Moreover, the MALAT1 triple helix interacts with a protein, methyltransferase-like protein 16 (METTL16 Brown et al., 2016b Warda et al., 2017 ). METTL16 is an н 6 -methyladenosine (m 6 A) RNA methyltransferase and how the METTL16-triple helix complex affects the half-life of MALAT1 remains unknown as well as the biological function of the complex itself (Pendleton et al., 2017 ). A weak m 6 A site has been detected in the upper stem of the MALAT1 stability element using miCLIP (m 6 A individual-nucleotide resolution crosslinking and RNA immunoprecipitation), although it is unknown if METTL16 catalyzes formation of this m 6 A mark and/or recognizes it (Linder et al., 2015 Pendleton et al., 2017 ). Lastly, another unique function of the MALAT1 triple helix is that it upregulates translation in the context of a GFP reporter system (Wilusz et al., 2012 ). Therefore, understanding the mechanism of translational upregulation mediated by a triple helix may potentially lead to the discovery of novel triple helices having roles in the cytoplasm.

In summary, triple-helical RNA stability elements exist for multiple classes of RNAs, including those that localize to the nucleus and cytoplasm as well as those expressed by viruses, animals, fungi, and plants. Understanding the structure and function of these unique stability elements has led to novel experimental tools as well as drug targets. For example, the MALAT1 triple helix has been used to study the functional role of the poly(A) tail in transposons and used as a stability tool for RNAs in cell-based systems (Doucet, Wilusz, Miyoshi, Liu, & Moran, 2015 Nissim, Perli, Fridkin, Perez-Pinera, & Lu, 2014 Vogan et al., 2016 Zhan, Xie, Zhou, Liu, & Huang, 2018 ). Moreover, MALAT1 is upregulated in multiple cancer types and its triple helix is required for this accumulation, making it a potential drug target (Gutschner, Hammerle, & Diederichs, 2013 ). Most triple-helical RNA stability elements remain uncharacterized and likely hold the potential to revealing more unique insights into the roles of RNA triple helices in biology.

3.5 Other RNA triple helices

Other RNA triple helices containing major-groove base triples have been observed. Notably, two consecutive U•A-U base triples were observed in an NMR structure of the 7SK stem-loop 1 in complex with a peptide representing the RNA-binding domain of the HIV Tat protein (Pham et al., 2018 ). Interestingly, arginine sandwich motifs recognize the Hoogsteen face of G in C-G base pairs flanking the U•A-U base triples. A similar mode of recognition of a C-G base pair adjacent to a U•A-U base triple in HIV-1 TAR RNA has been demonstrated for arginine residues in HIV Tat and a lab-evolved RNA recognition motif (Belashov et al., 2018 Pham et al., 2018 ). Also noteworthy, an X-ray crystal structure of Campylobacter jejuni Cas9 in complex with guide RNA and DNA revealed an unusual arrangement of a U•A•G major-groove base triple and an A•A-U minor-groove base triple being interrupted by a base quintuple and an extrahelical residue, A63 (Yamada et al., 2017 ). Защото C. jejuni tracrRNA (транс-activating CRISPR RNA) lacks two consecutive major-groove base triples, it is not included in the table of triple helices (Table 1). Nonetheless, it is notable that Cas9 does not establish base triple-specific interactions except for an arginine-phosphate backbone contact (Yamada et al., 2017 ). Rather, the extrahelical base of A63 stacks with a histidine residue and the N1 of A63 forms a hydrogen bond with an asparagine residue (Yamada et al., 2017 ). Therefore, it is possible that proteins recognize flanking sequences and structures of triple helices instead of the triple helix itself.

Additional RNA triple helices have been reported, although some have only partial triple helix character or there is no 3D structure and/or cell-based compensatory mutagenesis studies performed to validate triple helix. In vitro-selected aptamers having base triples were not discussed in this review because they are non-natural RNAs. Finally, R•D-D triple helices comprised of noncoding RNA and genomic DNA were not discussed because this review is focused on triple helices in which all three strands are RNA.


Immune cells within the tumor microenvironment: Biological functions and roles in cancer immunotherapy

The immune cells within the tumor microenvironment (TME) play important roles in tumorigenesis. It has been known that these tumor associated immune cells may possess tumor-antagonizing or tumor-promoting functions. Although the tumor-antagonizing immune cells within TME tend to target and kill the cancer cells in the early stage of tumorigenesis, the cancer cells seems to eventually escape from immune surveillance and even inhibit the cytotoxic function of tumor-antagonizing immune cells through a variety of mechanisms. The immune evasion capability, as a new hallmark of cancer, accidently provides opportunities for new strategies of cancer therapy, namely harnessing the immune cells to battle the cancer cells. Recently, the administrations of immune checkpoint modulators (represented by anti-CTLA4 and anti-PD antibodies) and adoptive immune cells (represented by CAR-T) have exhibited unexpected antitumor effect in multiple types of cancer, bringing a new era for cancer therapy. Here, we review the biological functions of immune cells within TME and their roles in cancer immunotherapy, and discuss the perspectives of the basic studies for improving the effectiveness of the clinical use.

Ключови думи: Cancer immunotherapy Immune cells Tumor microenvironment.