Информация

Измерване на плътността на повърхностните антигени

Измерване на плътността на повърхностните антигени


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Опитвам се да добия представа за разнообразието от методи, използвани за определяне на броя на антигените и рецепторите на клетъчната повърхност. Това е значително различно от определянето на афинитета на тези повърхностни маркери.


Искате да преброите броя на антигените и рецепторите в жива клетка?

Възможни начини:

  1. FRET (малко вероятно е да работи)
  2. изобразяване на рецептори с разделителна способност на единична молекула
  3. Western blot за приблизително оценка на количеството рецептори
  4. едноклетъчни протеомични техники (не много подходящи)

Рой Дж. Карвър университет в Илинойс Биотехнологичен център

Количествената поточна цитометрия (QCFM) може да се използва за анализиране на големи количества клетки за множество антигени и за количествено определяне на броя на местата на свързване на клетка. Линейната функция представлява връзката между средния интензитет на флуоресценция (MFI) на клетките, които са белязани с флуорохром, който е прикрепен към лиганд или моноклонално антитяло (mAb) и средния брой рецептори/клетки или среден брой места за свързване на mAb/клетка. Специални калибрирани зърна се използват за генериране на стандартна крива, която превръща MFI в молекулярни еквиваленти на разтворим флуорохром (MESF) чрез свързване на количествено измеримо количество антитяло (Antibody Binding Capacity – ABC). Примерът по-долу показва количествено определяне на анти-човешки EGFR върху клетъчната повърхност на клетъчна линия от човешки сквамозен карцином SQCCY1 с DAKO QIFFIT® – снимка, получена от U.T.M.D. Научен парк на раковия център на Андерсън – уебсайт на отдела за изследвания. Различни популации от перли, показани на снимката, свързват калибрирани количества CD5-FITC антитяло. Този комплект измерва имунофлуоресценцията индиректно.

Можете да използвате серия от пет популации от флуоресцентни микросфери, белязани с различни количества FITC или други известни флуорофори като Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 647, APC, Cy™5, PE-Cy™5, R-PE, за да измервате нивата на експресия на клетки. Интензитетът на флуоресценция се определя количествено чрез директно сравнение на измерванията на флуоресценция от чисти флуорохроми с тези от микросфери, повърхностно маркирани със същия флуорохром.

БЕЗПЛАТНА програма за анализ (QuickCal® v.2.3) е предоставена с всеки комплект, за да ви помогне да определите нивата на експресия на клетките, както и да оцените линейността на инструмента и прага на откриване. Програмата за анализ може да бъде получена ТУК и да се използва, като въведете номера за достъп, предоставен с вашите стандарти.

Връзки и полезна информация

Цялата работа, извършена от Биотехнологичния център на Рой Дж. Карвър (CBC), трябва да бъде призната в научни публикации, постери и презентации. Правилното признание ни позволява да измерим въздействието на нашата работа и подкрепя нашите инициативи за получаване на спонсорирано финансиране. В допълнение, всеки персонал на CBC, който има значителен интелектуален или експериментален принос, заслужава по-нататъшно признание като съавтор.


Абстрактно

Интерфазовата адсорбция на миши моноклонално антитяло (тип IgG1, анти-β-hCG) на границата между хидрофилен силициев оксид/вода е изследвана чрез спектроскопска елипсометрия и неутронно отражение, последвано от оценка на свързването на хормонален антиген, човешки хорион гонадотропин (hCG ), върху адсорбираните молекули на антитялото. Количеството на адсорбцията достига максимум около изоелектричното pH (IP) от 6 за антитялото, този pH-зависим модел може да бъде променен чрез увеличаване на концентрацията на сол, тенденция, наблюдавана и за други протеини. Неутронното отражение разкрива образуването на 40 Å равномерен слой от адсорбираното антитяло, което показва плоска ориентация. Следващото свързване на hCG показа, че моларното съотношение на hCG, свързан с антитялото на интерфейса, е до 0,7 при ниско повърхностно покритие на антитялото и намалява с увеличаване на концентрацията на повърхностно антитяло. Резултатите показват нарастваща степен на пространствена пречка за достъпа до hCG с увеличаване на плътността на опаковане на молекулите на антителата на повърхността. Сравнението с по-рано публикувани изследвания на кристалната структура предполага усукване на променливия регион, за да се позволи достъп до антигена. Установено е също, че свързването на hCG е рН-зависимо с неговия максимум около IP, ако йонната сила на разтвора е ниска (20 mM). Въпреки това, ако йонната сила се увеличи до 200 mM, тогава свързването на hCG е повлияно от комбинация от пространствени пречки и електростатично взаимодействие между антигена и повърхността. Тези резултати са много важни за подобряването на производителността на биотехнологиите като тестове за плодовитост и биосензори, базирани на имобилизация на антитела.

Автор, до когото трябва да се адресира кореспонденцията. Телефон: 44-161-2003926. Имейл [email protected]


Опции за достъп

Получете пълен достъп до дневника за 1 година

Всички цени са НЕТНИ цени.
ДДС ще бъде добавен по-късно при плащането.
Изчисляването на данъка ще бъде финализирано по време на плащането.

Получете ограничен във времето или пълен достъп до статия в ReadCube.

Всички цени са НЕТНИ цени.


Дискусия

В това проучване ние описахме конструиран антигенен рецептор, който осигурява оптичен контрол върху вътреклетъчната сигнализация в Т клетките, докато е конюгиран с антиген-представящи клетки. Използвахме този нов инструмент за директно разпитване на капацитета на вътреклетъчната мрежа за интегриране на сигнала на антигенния рецептор чрез количествено определяне на устойчивостта на стимулите в различни точки в тази мрежа. Основната констатация от тази работа е, че във всички тествани части на вътреклетъчната сигнална мрежа, нарушаването на сигнализирането на антигенния рецептор е причинило по същество цялата остатъчна информация в мрежата да се разсее в рамките на 10-15 минути. Това засилва възгледа, че проксималната сигнализация от TCR и вероятно много други рецептори на имунни клетки трябва да се поддържа в продължение на много часове, за да доведе до ефективно активиране, както беше предложено по-рано (Huppa и др., 2003) и вероятно изисква наличието на костимулиращи сигнали (Trendel и др., 2019 г.). Въпреки това бихме могли директно да наблюдаваме персистирането на този биохимичен сигнал в мрежата на ниво генна експресия, използвайки пулсиращи влакове на сигнализиране. Ние също така демонстрирахме, че е необходима продължителна проксимална сигнализация за поддържане на транскрипционните фактори в активно състояние и следователно продължителна генна експресия, като разпадането на иРНК е най-дълго живеещият сигнален междинен продукт с приблизителен полуживот между 15 и 30 минути за измерените транскрипти тук. След това демонстрирахме, че тази ограничена устойчивост на сигнала може да бъде използвана за увеличаване на ефективния изход от Т клетките, когато се стимулира от клинично значим анти-CD19 CAR чрез пулсираща сигнализация.

Нашите резултати предполагат, че Т клетките могат само директно да интегрират TCR сигнали през множество APC взаимодействия в рамките на кратък времеви прозорец. Както беше отбелязано по-горе, интервалът между последователните взаимодействия Т-клетка/APC може да бъде 1,5-2 часа (Gunzer и др., 2000), което е несъвместимо дори във времевите скали, които сме измерили за устойчивост на mRNA. Въпреки това, има добри доказателства, че Т клетките натрупват резултата от генната експресия при множество взаимодействия (Faroudi и др., 2003 г. Munitic и др., 2005 Кларк и др., 2011), което предполага, че трябва да съществува праг на протеинова експресия, отвъд който се появява спецификацията на функцията на Т-клетките. Чрез титриране на величината на интензитета на сигнала, излъчван от OptoCAR, използвайки степенувано осветяване, успяхме да демонстрираме, че е необходимо минимално ниво на сигнализиране, за да се управлява изходът надолу по веригата по цифров начин, в съгласие с това. Проучването на Bousso и колеги (Clark и др., 2011) предполагат, че натрупването на активиран FOS е потенциален механизъм за интегриране на множество сигнални събития на Т-клетки, където откриват, че фосфо-FOS T325 се увеличава дори когато рецепторната сигнализация е нарушена. Този резултат обаче не отговаря на бързата загуба на тази модификация, когато активността на ERK е инхибирана (Murphy и др., 2002), в съгласие с нашето откритие, че активността на FOS бързо се губи при прекратяване на сигнализирането (Фигура 4F). Това несъответствие може да се състои в това как е открит активиран FOS или използването на покрити с антитела перли за активиране на Т клетките. Ограничение на нашия подход OptoCAR и за CAR като цяло е, че може да има някои други протеинови взаимодействия, управлявани от допълнителните CD3 вериги, които не присъстват в тези химерни рецептори, които могат да помогнат за поддържане на сигнализирането, дори когато те се дисоциират от лиганда.

Имаше ясна корелация между разстоянието на мрежовия междинен продукт от активиращия рецептор и намалената скорост, с която сигналите се разсейват при нарушаване на сигнализирането, отчасти обяснимо с прехода от Tyr- към Ser/Thr-базирани киназни реакции. Това предполага, че продължителността на сигнализирането може да бъде кодирана от диференциално постоянство на сигнала в мрежата, като експресията на протеин е единственото състояние, което може да продължи в часовата времева скала. Като се има предвид, че много сигнални мрежи са изградени от последователни стъпки, по-добра „памет“ за активиране на рецептора ще се отпечата, когато се стимулират по-отдалечени стъпки. Това също би имало ефект на филтриране на по-фалшиви сигнални импулси, които не биха могли ефективно да преодолеят множество стъпки и така да се разсейват по-ефективно (Altan-Bonnet & Germain, 2005). Важно следствие от тези заключения е, че поне за тези, които сме изследвали, противоположните реакции в рамките на сигналната мрежа, които се стремят да възстановят базалното ниво на сигнализация, трябва да бъдат ефективни и мощни, като за преодоляването им е необходим непрекъснат сигнален поток. .

Предишни проучвания са изследвали как преходното инхибиране на TCR сигнализирането влияе върху нивото на потока на Ca 2+ и скоростта на неговото намаляване при нарушаване на сигнала (Valitutti и др., 1995 Варма и др., 2006 Юсефи и др., 2019 г.). Тези доклади откриват силна зависимост от проксималната TCR сигнализация за поддържане на повишеното ниво на Ca 2+ йони в съгласие с нашите открития. Въпреки това, ние измерихме далеч по-бързо намаляване на това отчитане (Фигура 2L), което приписваме на начина, по който нарушаваме сигнализирането на рецептора, като по-директен и ефективен. Бързото намаляване на фосфорилираната ERK при нарушаване на сигнализирането, което наблюдавахме (Фигура 3E), също е открито в друго скорошно оптогенетично проучване в NIH3T3 клетки (Bugaj и др., 2018), което предполага, че резултатите, които открихме, вероятно ще бъдат по-общо приложими извън Т-клетъчната сигнализация. Нашето откритие, че активното състояние на транскрипционния фактор FOS, подобно на ERK, изисква непрекъснато проксимално сигнализиране, предполага, че само техният изход надолу по веригата на повишена генна експресия може да представлява значително постоянно състояние на предишно сигнализиране за тези TFs. Ние не предполагаме, че други персистиращи състояния не могат да съществуват, като например миграция или цитотоксична активност чрез други механизми. Това означава, че кодирането на сигналната динамика чрез TF също трябва да бъде на това ниво и предишни проучвания предоставиха доказателства за този резултат (Murphy и др., 2002 Локасале, 2007 Кларк и др., 2011 Марангони и др., 2013 ).

Има няколко други проучвания, използващи оптогенетика, за да проучат как динамиката на сигналите влияе върху клетъчното активиране надолу по веригата, което доведе до някои вълнуващи нови резултати (Toettcher и др., 2013 Грациано и др., 2017 Уилсън и др., 2017 Бугай и др., 2018 г.). Тези проучвания неизменно използват медиираната от светлина транслокация на конститутивно активен ензим към плазмената мембрана като средство за контролиране на сигнализирането надолу по веригата. Макар и много ефективен, този подход „къси“ сигнализирането от горния рецептор, потенциално заобикаляйки ключови части от мрежата и премахвайки всяка пространствено-времева информация, която може да бъде кодирана при физиологично рецепторно активиране в клетъчните конюгати. В нашия подход светлината контролира самото начало на трансдукция на рецепторен сигнал, без да променя архитектурата на мрежата, като активирането на рецептора се случва във физиологичния контекст на интерфейса на конюгат на Т-клетка/представяща клетка. Вярваме, че този подход осигурява най-реалистичния контрол върху активирането на рецепторите, без да нарушава сигнализирането от други рецептори на клетъчната повърхност, които могат да модулират входа на TCR, като костимулация чрез ангажиране на CD28. Ние също така изследвахме ендогенните сигнални компоненти, а не свръхекспресиращите протеинови сензори, които трябва да докладват най-точно динамиката на мрежата.

OptoCAR, който разработихме в тази работа, съдържа три ITAM сигнални мотива. Въпреки че е способен да инициира много ефективно сигнализиране надолу по веригата, не може да се очаква да възпроизведе напълно всички аспекти на пълния TCR комплекс. По-рано показахме, че ортогоналната двойка рецептор/лиганд, използвана в OptoCAR, може да предизвика еквивалентна сегрегация на фосфатазата CD45, за която се смята, че инициира сигнализиране на рецептора, както се наблюдава за TCR (James & Vale, 2012), както и задвижване на сигнализиране надолу по веригата (James, 2018 г.). Ние също така показахме, че увеличеният брой ITAM, присъстващи в TCR, му позволява да бъде високо ефективен при трансдуциране на свързване на лиганда в сигнал дори при ниска заетост на рецептора (James, 2018). Въпреки това, за всички експерименти, извършени в тази работа, ние работихме в режим на висока заетост чрез насищане с димеризатора, така че очакваме, че OptoCAR, подобно на подобни CAR конструкции, осигурява широко еквивалентен стимул на този, който се очаква от самия TCR.

Ние използвахме клетъчната линия Jurkat за повечето от нашите анализи, която е добре използван модел за изследвания на Т-клетките (Abraham & Weiss, 2004), но не може да възпроизведе напълно функциите на първичните CD4 + Т клетки (Bartelt и др., 2009 г.). Въпреки това, известната мутация в клетките Jurkat в сигнализирането на PI3K поради инактивиране на PTEN (Shan и др., 2000) не се очаква да има пряк ефект върху динамиката на сигналните пътища, изследвани в това проучване. Следователно ние сме уверени, че заключенията, които направихме от нашите набори от данни, вероятно ще се обобщят за други мрежи за сигнализиране на рецептори, които зависят от същите пътища на трансдукция.

В обобщение, ние разработихме оптично контролиран антигенен рецептор за количествено определяне на времевия прозорец, през който Т клетките могат да интегрират TCR сигнали между последователни APC взаимодействия и да подсилим възгледа, че е необходима продължителна проксимална сигнализация за мощно клетъчно активиране.


Инструменти за подобряване на дизайна на вашия панел – Определяне на плътността на антигена

Когато изследовател избере да използва поточна цитометрия, за да отговори на научен въпрос, той първо трябва да изгради полихроматичен панел, който ще се възползва от силата на технологията и експерименталния дизайн.

Когато се настроим да използваме поточна цитометрия, за да отговорим на научен въпрос, трябва да проектираме полихроматичен панел, който ще ни позволи да идентифицираме клетките, които ни интересуват - целта на изследването. За да идентифицираме тези клетки, трябва да изградим панел, който да се възползва от относителната яркост на флуорохромите, нивото на експресия на различните протеини в клетката и производителността на инструмента, наред с други неща.

В най-основната си форма целта е да се увеличи максимално чувствителността на измерването на целевите клетки. Постигаме това чрез сдвояване на по-ярки флуорохроми с по-ниско изразени цели, като същевременно минимизираме загубата на разделителна способност в целевите канали.

Една от първите стъпки в процеса е да се класира нивото на експресия на целите върху клетките от основните маркери на поднастройка (CD3, CD4, CD19 и др.) до целите на нашето изследване. За да намерим отговора на тези въпроси, трябва да проучим литературата. За щастие има няколко налични ресурси, които да помогнат с тази работа.

Първият е уебсайтът Benchsci.com. Този уебсайт използва AI за куриране на публикувани документи, идентифициране на цели, клонинги, клетки, анализи и др. Когато търсите дадена цел, можете да видите данните, където са били използвани, което ви позволява да вземете по-информирано решение относно полезността на целта. Benchsci.com също така представи инструмент, който се възползва от техния AI, за да помогне при избора на реагенти за вашето изследване.

Вторият ресурс е публикация на Калина и колеги (2019). В тази статия авторите измерват нивата на експресия на CD антигени от 1 до 100 на 47 подгрупи на имунни клетки. Те са използвали PE-белязани антитела за изчисляване на нивата на експресия. Всички данни са достъпни на www.hcdm.com. Примерни данни, предоставящи общ преглед на нивата на експресия, са показани на Фигура 1.

Фигура 1: Модел на експресия на 29 CD антигена на повърхността на подгрупи на имунни клетки (в горната част). Цветът показва интензивността на изразяване, докато размерът на кръговете представлява честотата на популацията в даденото подмножество.

Третият ресурс е документ на Амир и колеги (2019). Те използваха масова цитометрия, за да направят същото, което Калина и колегите направиха, използвайки флуоресцентни етикети. В тази статия авторите са изследвали 350 антитела и са използвали платформата за автоматизиран анализ Astrolabe. Данните, които ще позволят на изследователя да изследва техните целеви антигени, са достъпни на този сайт.

Фигура 2: Модел на експресия на различни антигени в различни клетъчни подгрупи (хоризонтални). Цветът представлява интензитета на сигнала, а размерът на кръга представлява процента положителна популация.

Преди това определянето на нивото на експресия на различни антигени беше комбинация от догадки и детективска работа. Трябваше да прочетете множество списания, за да добиете представа какво са публикували другите, това стана само по-сложно и отнема много време, когато антигените започнаха да имат множество клонове. Въведете автоматизацията и изкуствения интелект под прикритието на Benchsci.com. Този инструмент е отличен ресурс, който да помогне на изследователите да идентифицират правилния клонинг, който да използват за своята работа.

Освен това, две групи използваха различни подходи, за да предоставят на изследователската общност инструментите за определяне на плътността на антигена на различни клетъчни подгрупи. И двамата направиха своите данни публично достъпни, за да може изследователската общност да се възползва пълноценно от тези ресурси.

Така първата стъпка от дизайна на панела премина от разочароващо и досадно до прост въпрос на превръщане на вашия уеб браузър в три сайта, за да получите цялата необходима информация. В следващия блог за дизайна на панела ще обсъдим приликите и разликите между дизайна на панела за традиционната флуоресцентна поточна цитометрия и спектралната цитометрия, като ще бъде добавена щрих от масова цитометрия за добра мярка.

Тим Бушнел има докторска степен по биология от Политехническия институт Rensselaer. Той е съосновател на ExCyte, водеща световна компания за обучение по поточна цитометрия, и дидактичен ум, чиято организация може да се похвали с истинска библиотека от лабораторни ресурси за секвениране, микроскопия и свързани теми в науките за живота.


Дискусия

Отдавна е признато, че диференциалното разпознаване на антигена от BCRs играе ключова роля в две специфични фази на Т-зависими В-клетъчни отговори. Първият е, когато В-клетките в покой са избрани да влязат в отговора, тъй като това изисква взаимодействието на BCR с чуждия антиген да надхвърли критичен праг. Впоследствие, соматично мутирали В клетки, генерирани в GCs, се размножават само ако придобият повишен афинитет към антигена, представен в имунни комплекси върху фоликуларни дендритни клетки. Между тези две контролни точки обаче, отговарящите В клетки трябва да решат дали да влязат в GC реакцията или да се подложат на бърза диференциация на плазмените клетки в екстрафоликуларни пролиферативни огнища. В това проучване ние демонстрираме, че това решение също се контролира от естеството на взаимодействието между BCR и антигена. По този начин ние показваме, че само реагиращите клонове, които претърпяват силно първоначално взаимодействие с антигена, могат ефективно да се диференцират в екстрафоликуларни плазмени клетки и да допринесат за бързия ранен Т-зависим отговор на антитялото.

Извършените тук изследвания изискват производството и пречистването на милиграмни количества от различните рекомбинантни HEL протеини. Това се постига с помощта на експресия на дрожди и се получават протеинови препарати, които са >95% чисти. Въпреки това съществуваше възможността следи от продукти, получени от дрожди с потенциални имуномодулиращи ефекти, да повлияят на резултатите. Смятаме, че това е много малко вероятно поради няколко причини. Първо, отговорът, наблюдаван тук след предизвикване с HEL WT -SRBC, е неразличим от този, получен, когато естественият HEL, получен от пилешко яйце, е конюгиран със SRBC (6). Второ, характерните отговори, получени за всеки от мутантите на HEL, са съвместими между партидите от същия пречистен протеин (непубликувани данни). И накрая, когато В клетките с висок и междинен афинитет отговарят конкурентно на същия антиген в същия гостоприемник, прогнозираните разлики в производството на плазмени клетки все още се наблюдават (Фиг. 7). Заедно тези наблюдения показват, че нашите резултати не са повлияни от наличието на потенциален замърсител с дрожди.

Съществуването на антиген-зависим праг за ранно производство на плазмени клетки първоначално беше очевидно в това проучване от селективното отсъствие на екстрафоликуларен отговор, когато SWHEL В клетките бяха предизвикани с нисък афинитет (Kа от ~1,5 × 10 6 M -1 ) HEL 3X -SRBC антиген (фиг. 1, 3 и 4). Този резултат контрастира с констатациите от предишни проучвания за Т-зависими В-клетъчни отговори, използващи химически хаптен NP, конюгиран с пилешки γ-глобулин (CGG) носител на протеин (NP-CGG). В тази система В клетките с диапазон от първоначални анти-NP афинитети не показват диференциална локализация към екстрафоликуларни огнища спрямо ранните GCs (11, 30, 31). Всъщност афинитетите от 10 5 M-1 са представени еднакво както в екстрафоликуларните огнища, така и в ранните GC, генерирани след имунизация с NP-CGG (11). Резултатите от анти-NP системата доведоха до теорията, че диференциацията на отговарящите В-клетки по двата начина на ранен отговор е по същество стохастичен процес, който действа независимо от разликите в разпознаването на антигена (11, 32). Този модел прогнозира, че първоначалният изблик на производство на антитяло от екстрафоликуларни плазмени клетки отразява спецификата на всички В клетъчни клонове, наети в отговора и следователно е предимно с нисък афинитет. Въпреки че това наистина е така при анти-NP отговорите (5, 7), анализът на отговорите към вируси и естествени протеинови епитопи показва, че първоначалният взрив на производството на антитяло към Т-зависим антиген често е с относително висок афинитет (>10 7 M − 1 препратки 13–15).

Различните изисквания за висок антигенен афинитет в различни Т-зависими отговори на антитела могат да бъдат съгласувани, като се признае, че силата на взаимодействието между антиген и BCR е от решаващо значение за регулиране на този процес, а не афинитетът на антигена сам по себе си. Това схващане беше потвърдено в настоящото изследване, като се показа, че SWHEL В клетките могат да произведат бързи реакции на плазмени клетки и антитела към антигена на HEL 3X -SRBC с нисък афинитет, когато плътността на HEL 3X върху повърхността на SRBC се увеличи (фиг. 6). Следователно наличието на клонове с нисък афинитет в отговора на екстрафоликуларния фокус към NP-CGG се обяснява лесно с високата епитопна плътност на този хаптениран протеинов антиген, който обикновено носи 16 NP групи на CGG мономер (31). Следователно нашите резултати предполагат, че В клетките, които разпознават епитопи с нисък афинитет, все още могат да взаимодействат достатъчно силно с антигена, за да влязат в отговора на екстрафоликуларния фокус, но само ако епитопът присъства при относително висока плътност.

Когато плътността на епитопа се поддържа постоянна, е очевидно, че 50-кратно намаляване на антигенния афинитет (т.е. HEL 2X -SRBC към HEL 3X -SRBC) може да премахне екстрафоликуларния плазмен клетъчен отговор, монтиран от SWHEL В клетки (фиг. 3–5, 4 5). По-малките количествени промени в силата на взаимодействието между антигена и BCR чрез понижаване на плътността на HEL 2X или увеличаване на плътността на HEL 3X върху повърхността на SRBC имат значителни, но по-малко абсолютни ефекти върху ранния отговор на плазмените клетки (фиг. 6 ). По същия начин, SWHEL(H) В клетките, които свързват HEL WT с междинен афинитет, са способни да предизвикат намален, но все още ясно очевиден плазмен клетъчен отговор на ден 5 (Фиг. 7). Взети заедно, тези резултати показват, че няма рязък праг на взаимодействие между антиген и BCR, който определя дали ще настъпи или не ранна диференциация на плазмените клетки. По-скоро, в рамките на определен диапазон от сила на взаимодействие, относителният размер на ранния отговор на плазмените клетки е пряко свързан със силата на това първоначално антигенно взаимодействие.

Дали силното взаимодействие между BCR и антигена е универсално необходимо за образуване на екстрафоликуларен фокус е трудно да се прецени без изучаване на този въпрос директно с помощта на други моделни антигени. Сравнително високият афинитет на ранния отговор на антитялото към няколко Т-зависими антигена (13-15) със сигурност е в съответствие с BCR-зависимата регулация на производството на екстрафоликуларни плазмени клетки, която също се среща в тези случаи. Независимо от това, възможно е адювант или други модифициращи фактори да променят количеството или качеството на BCR-независими сигнали, доставяни на реагиращите В клетки от Т клетки и/или дендритни клетки и те от своя страна могат да отменят BCR-зависимите контроли, описани в настоящото проучване. Ще бъде интересно да се тества тази възможност в бъдеще, като се предизвика SWHEL В клетки с различни мутантни HEL протеини в алтернативни имуногенни форми.

За разлика от Т-зависимите антигени, Т-независимите тип 2 (TI-2) антигени като NP-Ficoll обикновено генерират само екстрафоликуларен отговор. Абортивни GC могат да се генерират, но само ако дозата на антигена и честотата на прекурсора са достатъчно високи (33). Това пристрастие на TI-2 отговорите към образуването на екстрафоликуларен фокус също е очевидно в SWHEL система. По този начин, когато 10 4 HEL-свързващ SWHEL В клетките се предизвикват с HEL WT -Ficoll, генерират се краткотрайни екстрафоликуларни плазмени клетки, но не и GC (непубликувани данни). Ако наблюденията на Т-зависимите отговори в настоящото проучване могат да бъдат приложени и към TI-2 отговорите, възможно е да се припише способността на TI-2 антигените да предизвикват силен екстрафоликуларен фокусен отговор на факта, че тези антигени обикновено са силно кръстосано свързване (34, 35) и следователно е вероятно да взаимодействат силно с BCR. В този случай неуспехът на TI-2 антигените да генерират ефективно GCs най-вероятно отразява значението на помощта на Т-клетките за потенциране на образуването на GC. Алтернативно, силата на BCR ангажирането може да повлияе на Т-зависимите и TI-2 отговори по различен начин, потенциално поради модулация в последния случай чрез ко-стимули, доставяни чрез CD21/35 или Toll-подобни рецепторни молекули (36).

Констатацията, че количествените разлики в разпознаването на антигена регулират клетъчната съдба по време на ранните Т-зависими В-клетъчни отговори, разкрива сложно ниво на контрол, което вероятно е еволюирало, за да оптимизира разгръщането на отговарящи В-клетъчни клонове. Свързването на бързата диференциация на плазмените клетки със силното първоначално взаимодействие с антигена означава, че значителните ресурси, необходими за поддържане на диференциацията на плазмените клетки и последващото производство на антитела на високо ниво (37), са посветени само на онези клонове с добър шанс за секретиране на биологично ефективни антитела (38). В случай на пауцивалентни епитопи това ефективно означава, че се произвеждат само антитела с относително висок афинитет (фиг. 2–4, 3 4). Въпреки това, епитопите, присъстващи с висока плътност, могат да бъдат ефективно неутрализирани от антитела с по-нисък афинитет (39-41). При тези специфични условия (например, HEL 3X -SRBC с висока плътност), биологично има смисъл В клетките с нисък афинитет да бъдат разрешени в отговора на извънфоликуларната плазмена клетка (Фиг. 6). BCR-медиираната регулация на ранните Т-зависими отговори също така гарантира, че специфичните за антигена специфики, които имат минимален принос към първоначалния отговор на антитялото, не се изхвърлят, а са специално насочени към GC. Тук те могат да преминат през SHM и съзряване на афинитета и могат да допринесат за нови ефективни специфики на по-късен етап от отговора. Това е илюстрирано, когато SWHEL В клетките са предизвикани с HEL 3X -SRBC с междинна плътност, където отсъствието на ранен (ден 5) антитяло (фиг. 5 C) е последвано от последващо натрупване на анти-HEL 3X антитела с висок афинитет, произведени от соматично мутирали след- GC плазмени клетки (непубликувани данни).

Критичната роля на силното антиген-BCR взаимодействие в ранната диференциация на плазмените клетки in vivo е интригуваща, като се има предвид, че В клетките, стимулирани със сигнали, получени от Т клетки in vitro, претърпяват ефективна диференциация на плазмените клетки, свързана с пролиферацията, без необходимост от BCR лигиране (32). Тази дихотомия предполага, че диференциацията на В-клетките in vivo се влияе от допълнителни сигнали, които при липса на силно разпознаване на антигена потискат пътя на диференциация на плазмените клетки по подразбиране. Тъй като отговарящите В-клетки могат да пролиферират и да влязат в GC отговора, без да претърпят значителна диференциация на плазмените клетки (например, HEL 3X -SRBC отговор), възможно е GC микросредата да инхибира този процес. Ако това е вярно, силното първоначално взаимодействие между BCR и антигена може да позволи поне част от дъщерните клетки на отговарящ клонинг да заобиколи GC и да претърпи диференциация на плазмените клетки. Специфичният включен механизъм не е ясен, но може да се основава на BCR-медиирани промени в експресията на хемотактични рецептори, които улесняват екстрафоликуларната миграция (1). Като алтернатива, по-ефективното представяне на пептиди, получени от антиген, улеснено от по-силно разпознаване на антиген, може да доведе до количествени или качествени разлики в доставянето на Т-клетъчна помощ, които влияят на последващия В-клетъчен отговор. Потенциална улика може да се крие във факта, че прогресивното понижаване на първоначалния антигенен афинитет намалява скоростта на пролиферация на анти-HEL В клетките през първите 64 часа от отговора (фиг. 2). Следователно е възможно първоначалният пролиферативен отговор да повлияе на способността на реагиращите клетки да претърпят бърза диференциация на плазмените клетки. В този случай е възможно сигналите, доставени независимо от взаимодействието антиген-BCR, но с потенциал да модифицират пролиферацията на В клетките (например, Toll-подобни рецепторни лиганди), също да повлияят върху размера на реакцията на екстрафоликуларната плазмена клетка. Изследванията, използващи описания тук модел, ще помогнат за разрешаването на специфичните включени механизми и допълнително характеризират сигналите, които оформят in vivo В клетъчните отговори. Тази информация има голямо обещание за бъдещото развитие на нови терапии за автоимунни заболявания, както и за оптимизиране на стратегиите за ваксинация.


Сравнителна оценка на повърхностната експресия на CD19 и CD20 върху В-клетъчни лимфоми от клинични биопсии: Последици за насочени терапии

Педро Хорна, Гжегож Новаковски, Ян Ендел, Райнер Боксхамер Сравнителна оценка на повърхностната експресия на CD19 и CD20 върху В-клетъчни лимфоми от клинични биопсии: Последици за насочени терапии. кръв 2019 134 (Допълнение_1): 5345. doi: https://doi.org/10.1182/blood-2019-129600

Заден план: CD19 и CD20 са специфични за В-клетъчна линия антигени, експресирани върху клетъчната повърхност на повечето В-клетъчни лимфоми. Докато CD20 се придобива по време на късните етапи на В-клетъчната лимфогенеза и след това се губи при диференциация в плазмени клетки, експресията на CD19 покрива целия спектър на ранен В-клетъчен генезис и съзряване. CD20-targeting agents have been broadly integrated into the therapeutic armamentarium for B-cell lymphomas. More recently, CD19-targeting agents have emerged as promising alternatives with demonstrated therapeutic value. Given the imminent availability of both CD19 and CD20 targeted therapies, and potential for combinational approaches, we studied the surface expression of these antigens at the single-cell level on lymphoma cells and benign background lymphoid subsets from biopsy specimens.

Методи: Flow cytometric analysis (seven-color) was performed on biopsy specimens from 47 patients with newly diagnosed B-cell lymphomas, including diffuse large B-cell lymphoma (n=15), follicular lymphoma (n=15), marginal zone lymphoma (n=9), mantle cell lymphoma (n=9), Burkitt lymphoma (n=2), and unclassifiable low-grade B-cell lymphoma (n=2). Small lymphocytic lymphoma was intentionally excluded, given its well-described loss of CD20 expression. Biopsies from eight additional patients with persistent/recurrent B-cell lymphomas after anti-CD20 therapy (greater than 6 months after last dose) were also evaluated. Thresholds for CD19 or CD20 antigen positivity were defined for each case, based on the 95th percentile fluorescence intensity of the respective marker on tumor-infiltrating T-cells (internal negative control). In addition, CD19 or CD20 fluorescence intensities of tumor cells were normalized to background benign B-cells (internal positive control) using the median fluorescence ratio (MFR).

Резултати: Both CD19 and CD20 were highly expressed on CD20 treatment naïve tumor cells, with a slightly higher median percentage of positive tumor cells for CD19 (98%) compared with CD20 (93%) (p=0.003), and one case lacking CD20 expression. When compared with background benign B-cells, CD20 was frequently overexpressed on tumor cells (mean MFR=1.8), while CD19 expression was overall similar to background benign B-cells (mean MFR=0.9) (p=0.001). As the surface density of CD20 on benign B-cells is reportedly higher than CD19 (

20,000 molecules per cell, respectively), these findings are consistent with a higher density of surface CD20 than CD19 on most B-cell lymphomas. However, CD20 expression was more heterogeneous (within individual patient samples and across patients), with a higher median percentage of CD20-negative tumor events (median=0.5%, range=0-98%) compared with CD19-negative events (median=0%, range=0-28%) (p=0.003). Interestingly, expression of CD19 within the CD20-negative tumor subsets was largely preserved (mean % CD19-positive events=97.86%, min=40%). In addition, percentages of CD19/CD20 double-negative tumor events were very small (median=0%, range=0-4.9%), and only detectable in 15 cases (32%). Of eight additional cases studied post-anti-CD20 immunotherapy (6-84 months after last dose), the percentage of antigen-positive events by tumor cells was largely preserved for both CD19 (median=99.6%, range=93.5-100%) and CD20 (median=95.7%, range=55.6-100%), similar to the pre-therapy cohort.

Заключения: CD19 and CD20 are both highly and consistently expressed in B-cell lymphomas. While CD20 has a higher average density of surface molecules per tumor cell, CD19 expression is more homogenous and is preserved in small CD20-negative tumor subsets and after anti-CD20 targeted therapy. These findings support the clinical evaluation of anti-CD19 immunotherapies and combinational therapies targeting both surface antigens.

Horna:MorphoSys AG: Research Funding. Nowakowski:Selvita: Membership on an entity's Board of Directors or advisory committees Celgene: Consultancy, Research Funding Bayer: Consultancy, Research Funding Curis: Research Funding F. Hoffmann-La Roche Ltd: Research Funding Genentech, Inc.: Research Funding MorphoSys: Consultancy, Research Funding NanoString: Research Funding. Endell:MorphoSys AG: Employment, Patents & Royalties. Boxhammer:MorphoSys AG: Employment, Patents & Royalties.


Дискусия

In this paper we have introduced a coarse-grained model of immunoglobulin G (IgG) molecules, realized by fastening three ellipsoids with the proper aspect ratio together around a common hinge. The purpose of our study is to shed light on the role of the IgG flexibility and large size on its ability to bind to surface-absorbed antigens. Our coarse-grained (CG) model is conceived explicitly so as to reproduce the distributions of inter-domain angles measured by cryo-ET.

In our simulations, a large number of IgGs diffuse in a given volume and a binding equilibrium is reached with antigens adsorbed at a given density on the bottom surface. The equilibrium profiles of the surface concentrations of IgGs bound with one Fab and with both Fabs to the antigen-covered surface highlight the crucial role played by flexibility. When compared with antibodies frozen in an equilateral triangular configuration, fully flexible molecules demonstrate a much higher ability to bind with both Fabs. This is a direct result of a dynamic Търсене process performed by the dangling second Fab of IgGs already bound with one arm. This capability of adapting to irregular antigen configurations is quenched in the rigid molecules, which are only able to bind bivalently when they happen to find two antigens lying at the appropriate distance matching their fixed Fab-Fab angular aperture.

In order to shed light on the observed binding equilibrium, we formulate a two-step kinetic model, where IgGs first bind from the bulk to the surface with one Fab (equilibrium dissociation constant ) and then double with the second Fab (equilibrium dissociation constant ). Importantly, our model not only includes the information on the На и изключен rates, but also accounts explicitly for an important geometrical constraint, namely surface скрининг. IgGs are large molecules and excluded-volume interactions, especially in the proximity of the antigen-covered surface, prove extremely important. This effect is two-fold. On the one side, (i) IgGs diffusing in the bulk виж a number of available epitopes on the surface which is reduced with respect to the bare number of sites that are already occupied. In fact, a substantial number of non-bound antigens are nonetheless де факто unavailable as a result of the large size of IgGs bound in their proximity, which make them invisible to other antibodies in the bulk. Moreover, (ii) as a result of the IgG-IgG excluded-volume interactions at the surface, it turns out that the second Fab of a single-arm bound IgG always sees the face-value antigen concentration around, as it never gets to probe already occupied sites. These are too far away on average as a result of the effective repulsion among bound IgG molecules on the surface.

We conclude that the large and extremely flexible three-lobe conformation of IgGs is accurately designed to afford bivalent binding and at the same time take advantage of excluded-volume interactions to a maximum. This is probably the result of concurrent evolutive pressures towards smart antigen chasers capable of (i) bind strongly, т.е. with two binding sites (ii) bind differentially, т.е. bind to antigens of widely different sizes and (iii) bind optimally, т.е. maximize the number of bound molecules at a given concentration of target density.

Our model is in excellent agreement with surface plasmon resonance experiments of IgGs binding to surface-adsorbed haptens. We establish very clearly that flexibility is essential to reproduce the experiments (see Fig 6(a)). Furthermore, our theory allows us to isolate the second binding as the key factor that makes flexible IgGs much more powerful antigen binders. In fact, the dissociation constant measured from our simulations for rigid IgGs is five times larger than for the flexible ones.

A striking confirmation that the equilibrium constant for the second binding is the key factor can be gained by studying the equilibrium fraction of bivalently bound molecules (or, equivalently, sites). Once plotted against the antigen surface concentration rescaled by the dissociation constant (see Fig 6(b)), the three models, flexible, rigid and ghost fall on the same curve as the experimental data (where we have used the experimental dissociation constant). This remarkable fact proves very neatly that such роднина measure conceals a great deal of the physics underlying the binding process.

The concealed information is instead conspicuous when one looks separately at the binding profiles, т.е. the average number of single-Fab (н1) and double-Fab bound (н2) IgGs against antigen concentration σ. More precisely, the low-concentration regime turns out to be the same in the three models, namely н1σ, н2σ 2 . At low antigen coverage, it makes no difference at all whether IgGs are able to stretch their second arm to get hold of neighboring haptens or whether they repel each other on the surface. Importantly, the low-σ regime fixes the two equilibrium constants and , but obviously bears no sign of the screening effect. At increasing values of σ, the telltale signs of surface screening emerge clearly. Fully flexible molecules take advantage of the combined effects of their flexibility and mutual repulsion, which essentially makes haptens within reach of the second Fab always unoccupied on average. On the contrary, rigid IgGs remain largely unable to bind with both arms, despite their mutual exclusion, while ghost molecules take full advantage of their invisibility to bind with two Fabs, unphysically outperforming fully flexible antibodies at high densities.

We stress that our model includes in a natural way the kinetic parameters (На и изключен rates for the two binding events) and the key geometrical parameters. This is at variance with an existing model of IgGs binding to antigen-covered surfaces [33], which conceals the thermodynamic and geometrical information in one and the same parameter, namely an effective screening area. As such, our model provides a more accurate and valuable theoretical framework to interpret experimental profiles of antibodies binding to multi-valent surfaces in different contexts.


Measuring cell fluorescence using ImageJ¶

Repeat this step for the other cells in the field of view that you want to measure.

NB: Size is not important. If you want to be super accurate here take 3+ selections from around the cell.

  • Once you have finished, select all the data in the Results window and copy and paste into a new spreadsheet (or similar program)
  • Use this formula to calculate the corrected total cell fluorescence (CTCF).

CTCF = Integrated Density – (Area of selected cell X Mean fluorescence of background readings)

Notice that rounded up mitotic cells appear to have a much higher level of staining due to its smaller size concentrating the staining in a smaller space. If you used the raw integrated density you would have data suggesting that the flattened cell has less staining then the rounded up one, when in reality they have a similar level of fluorescence.

This method is based, with permission, on an original protocol from QBI, The University of Queensland, Australia.


Гледай видеото: Златни Самородки и Монети, Измерване на плътност, чистота и карат, чрез хидростатично претегляне (Февруари 2023).