Информация

Сурогат (CTL-1) за грип А

Сурогат (CTL-1) за грип А


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Моля, някой може ли да посъветва някои възможни алтернативи на ниво 1, налични в търговската мрежа (изготвени), за грипния вирус? Идеята е този вирус да се улови върху специален материал. Така че „заместването“ трябва да бъде много сходно по отношение на своята външна структура и биохимия (по отношение на това как взаимодейства външно; вътрешните аспекти не трябва да имат значение). Наличието на CTL-1 би било идеално.

Моля, имайте предвид, че нямам опит в биологията.


Антивирусна терапия за грип

Всяка година грипните епидемии причиняват значително бреме от заболявания. Ваксинацията срещу грипните вируси А и В е била и остава крайъгълният камък на превенцията на грипа, но антивирусната терапия може да служи като важно допълнение към ваксинацията за контролиране на въздействието на заболяването. Два класа лекарства в момента са лицензирани в голям брой страни за лечение на грип. Блокерите на йонните канали на М2 или амантаданите (амантадин и римантадин) са специфични инхибитори на репликацията на вируса на грип А, докато инхибиторите на невраминидаза (занамивир и озелтамивир) са активни срещу грипни вируси А и В. По време на лечение с амантадан често се развиват лесно предаваеми резистентни към лекарства вируси, но не и по време на лечение с инхибитори на невраминидаза.

В този преглед данните за ефикасност и безопасност от рандомизирани контролирани проучвания се оценяват, за да се разбере какво можем и какво не можем да очакваме от антивирусното лечение. И четирите лекарства съкращават хода на грипното заболяване с приблизително 1 ден и облекчават до известна степен симптомите, но все още има несигурност дали антивирусната терапия води до намаляване на сериозните усложнения и хоспитализация. Резултатите от анализите на разходната ефективност са много разнообразни, отчасти поради различията в методологията, но и защото няма консенсус относно това какви вероятности да се присвоят на ключовите рискове и ползи, които са в основата на тези проучвания.

Консенсусните изявления на консултативните органи в Англия и Германия препоръчват инхибитори на невраминидаза за терапия на грип при лица с висок риск, като хора над 65 години или под 2 години, и лица с хронично сърдечно-съдово, белодробно или бъбречно заболяване, захарен диабет или имуносупресия. Въпреки това, няма съгласие дали антивирусната терапия може да се препоръча като цяло за иначе здрави деца и възрастни. Наличието на безопасни и ефективни опции за антивирусна терапия трябва да се има предвид от практикуващия клиницист, докато по-конкретните препоръки и формулирането на политика ще зависят от допълнителни данни за ефикасност, които включват честота на усложненията и хоспитализация като мерки за изход.

Грипът е силно инфекциозно заболяване, което се проявява при годишни сезонни епидемии и засяга 10-20% от световното население средногодишно. СЗО изчислява, че всяка година грипните епидемии водят до 3-5 милиона случая на тежки респираторни заболявания и до 500 000 смъртни случая. Повечето смъртни случаи, свързани с грип в индустриализираните страни, се дължат на усложнения от основни заболявания при хора с добре дефинирани рискове, като възраст над 65 години или под 2 години, хронично сърдечно-съдово, белодробно или бъбречно заболяване, захарен диабет или имуносупресия.[1] Само в САЩ грипът се свързва с повече от 50 000 смъртни случая от всички причини годишно.[2] В допълнение към огромното бреме на заболяването по отношение на заболеваемостта и смъртността, грипните епидемии нанасят и значителна икономическа тежест, както по отношение на преките разходи за здравеопазване, така и в непреките разходи, като например загуба на производителност.

Ваксинацията срещу грипните вируси А и В е била и остава крайъгълният камък на превенцията на грипа. Инактивираните ваксини се използват успешно повече от 60 години и наскоро се появиха нови ваксини като живи атенюирани интраназални ваксини.[3,4] Въпреки това, най-вече поради недостатъчно покритие на ваксините[5], но също така и на липсата на защитна имуногенност у ваксините. възрастните хора и в някои години несъответствие между ваксиналните щамове и циркулиращите щамове, грипът остава основен проблем за общественото здраве. Следователно спешно са необходими ефективни антивирусни терапии.

Две групи противовирусни лекарства срещу грип понастоящем са лицензирани в голям брой страни, което предлага на клиницистите избор при лечението и превенцията на грипа. Докато първата група антивирусни лекарства, блокерите на йонните канали M2, са на пазара от дълго време, групата антивирусни лекарства, инхибитори на невраминидаза, навлезе на пазара едва през 1999 г. Все още има значителна несигурност относно ролята на тези лекарства. лекарства за овладяване на грипните епидемии и за намаляване на тежестта на заболяването.

Въз основа на търсене в PubMed на статии, които съдържат поне едно от генеричните имена на лекарства и термина „грип“, и въз основа на допълнителна информация, предоставена от производителите на съответните лекарства, този преглед разглежда клиничните доказателства за ефикасността на антивирусните лекарства при лечението на грип, и накратко обобщава редица анализи на разходите и ползите и препоръки за използване на антивирусна терапия при междупандемични грипни епидемии. Химиопрофилактиката и ролята на антивирусните лекарства при пандемичен грип бяха прегледани наскоро[6,7] и не са включени тук.


ПРЕГЛЕДНА статия

Лукас Дж. Керстетер 1†, Стивън Бъкли 1†, Карли М. Блис 2† и Линда Кофлан 1,3*†
  • 1 Катедра по микробиология и имунология, Медицински факултет на Университета на Мериленд, Балтимор, MD, САЩ
  • 2 Отдел по рак и генетика, Отдел по инфекции и имунитет, Факултет по медицина, Университет в Кардиф, Уелс, Обединеното кралство
  • 3 Център за развитие на ваксини и глобално здраве, Медицински факултет на Университета на Мериленд, Балтимор, MD, САЩ

Очевидно е, че появата на инфекциозни заболявания, които имат потенциал за разпространение от животински резервоари, представляват постоянна заплаха за глобалното здраве. Събитията на предаване на зоонози са се увеличили по честота през последните десетилетия поради промените в човешкото поведение, включително увеличените международни пътувания, търговията с диви животни, обезлесяването и интензифицирането на земеделските практики, за да се отговори на търсенето на консумация на месо. Вирусите на грип А (IAV) притежават редица характеристики, които ги правят пандемична заплаха и сериозна загриженост за човешкото здраве. Техният сегментиран геном и податлив на грешки процес на репликация могат да доведат до появата на нови реасортантни вируси, за които човешката популация е имунологично неприемлива. В допълнение, способността на IAV да заразяват водни птици и домашни животни, както и хора, увеличава вероятността за повторно подреждане и последваща поява на нови вируси. Спорадичните случаи на разпространение през последните няколко десетилетия доведоха до човешки инфекции с високопатогенни вируси на инфлуенца по птиците (HPAI) с висока смъртност. Прилагането на конвенционални платформи за ваксини, използвани за превенция на сезонни грипни вируси, като инактивирани грипни ваксини (IIVs) или живи атенюирани грипни ваксини (LAIVs), при разработването на ваксини срещу HPAI вируси е изпълнено с предизвикателства. Тези проблеми са свързани с производството при засилено ограничаване на биологичната безопасност и трудностите при размножаването на HPAI вируси в ембрионирани яйца, поради тяхната склонност към смъртност в яйцата. Преодоляването на производствените пречки чрез използването на по-безопасни гръбнаци, като вируси на инфлуенца по птиците с ниска патогенност (LPAI), също може да бъде предизвикателство, ако е несъвместимо с главния щам вируси. Нерепликиращите аденовирусни (Ad) вектори предлагат редица предимства за разработването на ваксини срещу HPAI вируси. Техният геном е стабилен и позволява вмъкването на вирусни антигени на HPAI (Ag), които се експресират in vivo след ваксинация. Следователно тяхното производство не изисква подобрени съоръжения или процедури за биологична безопасност и е независимо от яйцата. Важно е, че Ad ваксините имат примерен профил на безопасност и имуногенност в многобройни клинични проучвания при хора и могат да бъдат термостабилизирани за натрупване на запаси и готовност за пандемия. Този преглед ще обсъди състоянието на базираните на реклами ваксини, предназначени да предпазват от вируси на инфлуенца по птиците с пандемичен потенциал.


Стратегии, насочени към хемаглутинин като универсална противогрипна ваксина

Благодарим ви за възможността да прегледате този ръкопис. Bullard et al обобщиха скорошното развитие и знания за универсална стратегия за ваксина срещу грипни вируси. Този ръкопис е добре написан и структуриран, затова научих много от този ръкопис за рецензия. Има няколко предложения, които могат да подобрят този ръкопис за преглед. Моля, вижте моите конкретни коментари, посочени в коментарите за автори.

  1. Бих искал да ви предложа да добавите малко по-подробно описание защо разработването на ефективни системи за ваксини срещу РНК вируси като грипа е толкова предизвикателство (например, сравняване на скоростта на мутации).
  2. В целия текст обърках думата "последователност". Имаш предвид "нуклеотидна последователност"? или "аминокиселинна последователност"?. Моля, опишете това точно.

Благодаря ви за обмислените предложения. Моля, вижте отговорите на вашите коментари по-долу. Ще откриете, че сме коригирали ръкописа и сме включили вмъкнатия текст в отговора, за да ви помогнем да идентифицирате подобренията. Благодарим на рецензентите за отделеното време и усилия.

Благодарим ви за възможността да прегледате този ръкопис. Bullard et al обобщиха скорошното развитие и знания за универсална стратегия за ваксина срещу грипни вируси. Този ръкопис е добре написан и структуриран, затова научих много от този ръкопис за рецензия. Има няколко предложения, които могат да подобрят този ръкопис за преглед. Моля, вижте моите конкретни коментари, посочени в коментарите за автори.

Бих искал да ви предложа да добавите малко по-подробно описание защо разработването на ефективни системи за ваксини срещу РНК вируси като грипа е толкова предизвикателство (например, сравняване на скоростта на мутации).

Добавихме въведението, за да включим високите нива на скоростта на мутации на РНК вирусите. Въведението сега гласи: &ldquoРазработването на противогрипни ваксини е предизвикано от значителното вирусно разнообразие на грипния вирус [14]. РНК полимеразата на грипния вирус няма активност за четене на корекция, което води до високи нива на мутации и значителен антигенен дрейф [15]. Поради това настоящите сезонни ваксини срещу грип се актуализират ежегодно и разчитат на глобално наблюдение, за да се предскажат бъдещите циркулиращи сезонни щамове [16].

В целия текст обърках думата "последователност". Имаш предвид "нуклеотидна последователност"? или "аминокиселинна последователност"?. Моля, опишете това точно.

Ние сме се уверили, че всяко появяване на думата &lsquosequence&rsquo се дефинира като HA протеинова последователност или аминокиселинна последователност.

Авторите са прегледали стратегиите за генериране на универсална противогрипна ваксина чрез насочване към протеина хемаглутинин. Прегледът е ясно организиран и изчерпателно написан и обхваща широк спектър от допълващи се стратегии.

  • Редове от 97 до 99: това изречение трябва да бъде префразирано.
  • Фигура 2: Съкращението &ldquoRBS&rdquo трябва да се добави в легендата след мястото на свързване на региона (ред 108). Разделянето на фигурата на 2 панела съответно за 3D и линейния изглед може би ще го направи по-ясно.
  • Фигура 4 и/или свързан текст: трябва да се предоставят препратки за всяка стратегия.
  • Редове 177, 250 и следното събитие: посочете, че оценката на заболеваемостта е чрез загуба на тегло (не само загуба).

Благодаря ви за обмислените предложения. Моля, вижте отговорите на вашите коментари по-долу. Ще откриете, че сме коригирали ръкописа и сме включили вмъкнатия текст в отговора, за да ви помогнем да идентифицирате подобренията. Благодарим на рецензентите за отделеното време и усилия.

Авторите са прегледали стратегиите за генериране на универсална противогрипна ваксина чрез насочване към протеина хемаглутинин. Прегледът е ясно организиран и изчерпателно написан и обхваща широк спектър от допълващи се стратегии.

Редове от 97 до 99: това изречение трябва да бъде префразирано.

Префразирахме това изречение, така че да чете: &ldquoПротеинът на HA на грипа има способността да аглутинира червените кръвни клетки. Анти-грипните антитела, които се свързват с НА и инхибират хемаглутинационната активност на НА, се използват като сурогатна мярка за определяне на титри на неутрализиращи антитела (HI титри).&rdquo

Фигура 2: Съкращението &ldquoRBS&rdquo трябва да се добави в легендата след мястото на свързване на региона (ред 108). Разделянето на фигурата на 2 панела съответно за 3D и линейния изглед може би ще го направи по-ясно.

Добавихме RBS към легендата и също така разделихме фигура 2 на панел a и b за яснота.

Фигура 4 и/или свързан текст: трябва да се предоставят препратки за всяка стратегия.

Добавихме препратки към легендата за всяка стратегия.

Редове 177, 250 и следното събитие: посочете, че оценката на заболеваемостта е чрез загуба на тегло (не само загуба).

Изяснихме &lsquoweight&rsquo във всички случаи.

Прегледът, озаглавен &ldquoСтратегии, насочени към хемаглутинин като универсална противогрипна ваксина&rdquo от Brianna L. Bullard и Eric A Weaver, е добре написан и артикулиран.

Това е отличен принос към дизайна на ваксината срещу грип. Въпреки че са положени много усилия за разработването на универсални противогрипни ваксини, много малко от тях работят срещу сезонните грипни вируси. Следователно този преглед би бил източник на знания за изследователите, които търсят множество стратегии за проектиране на ваксини. Авторите са обобщили изчерпателно настоящите познания за дизайните на ваксини, базирани на HA.

Ето някои дребни коментари

VLP не е разширен на първа инстанция, въпреки че е разширен по-късно многократно.

Ред 230: &ldquoучастници, които&rdquo ----- &ldquoучастници, които&rdquo

Благодаря ви за обмислените предложения. Моля, вижте отговорите на вашите коментари по-долу. Ще откриете, че сме коригирали ръкописа и сме включили вмъкнатия текст в отговора, за да ви помогнем да идентифицирате подобренията. Благодарим на рецензентите за отделеното време и усилия.

Прегледът, озаглавен &ldquoСтратегии, насочени към хемаглутинин като универсална противогрипна ваксина&rdquo от Brianna L. Bullard и Eric A Weaver, е добре написан и артикулиран.

Това е отличен принос към дизайна на ваксината срещу грип. Въпреки че са положени много усилия за разработването на универсални противогрипни ваксини, много малко от тях работят срещу сезонните грипни вируси. Следователно този преглед би бил източник на знания за изследователите, които търсят множество стратегии за проектиране на ваксини. Авторите са обобщили изчерпателно настоящите познания за дизайните на ваксини, базирани на HA.

Ето някои дребни коментари

VLP не е разширен на първа инстанция, въпреки че е разширен по-късно многократно.

Ние дефинирахме вирусоподобна частица (VLP) при първото появяване.

Дефинирахме вируса на везикуларен стоматит (VSV).

Ред 230: &ldquoучастници, които&rdquo ----- &ldquoучастници, които&rdquo


Абстрактно

Последните разработки в използването на вируси като вектори за ваксини бяха улеснени от по-доброто разбиране на вирусната биология. Напредъкът настъпва, когато придобиваме по-добра представа за взаимовръзката между вирусите и имунната система. Вирусните векторни ваксини остават най-доброто средство за индуциране на клетъчен имунитет и сега са обещаващи за индуциране на силни хуморални реакции. Потенциалните ползи за глобалното здраве, които се предлагат от тази област, отразяват обхвата и полезността на вирусите като вектори за ваксини за човешки и ветеринарни приложения, с цели, вариращи от определени видове рак до широк спектър от инфекциозни заболявания.

Изминаха двадесет и пет години от първото публикувано използване на рекомбинантен вирус за доставяне на антигени от друг инфекциозен агент за целите на ваксинацията. Показано е, че вирусът на ваксина (VACV), рекомбинантен за повърхностния антиген на хепатит В (HBsAg), експресира HBsAg и впоследствие индуцира имунитет при шимпанзетата, който е достатъчен за защита срещу инфекция с хепатит В 1,2. Въпреки това обещаващо ранно начало и значително по-нататъшно развитие, списъкът с лицензирани вирусни векторни ваксини за човешка употреба е кратък, отчасти поради дългия и труден път към лицензирането на хора (за преглед вижте справка 3). Проблемите, свързани с широкомащабното производство и стабилността на такива ваксини, често изискват значителни научни инвестиции и трябва да се спазват строги изисквания за безопасност за вирусите, които в естественото си състояние имат потенциала да бъдат човешки патогени. Това е особено вярно за онези вирусни вектори, които остават компетентни за репликация или които по своето естество персистират в гостоприемника след периода на възпаление. Всъщност, в най-простия смисъл остава обхват на безопасност, който се увеличава с отслабването, което исторически трябваше да бъде балансирано с убеждението, че намаленият репликативен капацитет ще доведе до намалена имуногенност. Въпреки тези предизвикателства обаче, може би най-важният фактор, движещ продължаващото развитие на ваксините с вирусен вектор, е тяхната обещаваща имуногенност, особено с някои от най-трудните антигени в природата, принадлежащи към някои от най-силните патогени и ракови заболявания в света (Таблица 1).

В повечето случаи репликиращата се вирусна инфекция е много ефективна за предизвикване на стабилни имунни отговори в гостоприемник, които могат да продължат няколко години. Това е в контраст с много рекомбинантни антигени, които се доставят или като субединични ДНК плазмиди, или като протеини, въпреки че те се считат за сравнително безопасни (зависими от адюванта), те често страдат от слаба имуногенност. Обратно, вирусни ваксинни вектори, които се репликират in vivo с енергия, подобна на техните родителски вируси от див тип, често са силно имуногенни, но също така носят риск от рекомбинация, реактогенност или връщане към вирулентност. Търсенето на оптимална среда доведе до нови усилия в разработването на атенюирани вирусни вектори с дефектна репликация, стратегия, насочена към максимизиране на имуногенността и безопасността (фиг. 1).

Атенюирани вирусни вектори с дефектна репликация са разработени като част от стратегия за максимизиране на имуногенността и безопасността. Те се намират в средата на набор от сложност и потенциал за репликация, между технологиите за ваксини в двете крайности, които са лицензирани за човешка употреба. Въпреки че разработването на клинична ваксина изисква дългосрочна работна програма, лицензирането на такива векторни ваксини (ако се докаже, че са безопасни и ефективни) остава напълно постижима и реалистична цел. AAV, адено-асоцииран вирус AdV, аденовирус AS01, адювантна система 01 от GlaxoSmithKline HPV, човешки папиломен вирус MF59, емулсионен адювант масло във вода от Novartis MVA, модифициран вирус на ваксина Ankara VEE, част от вируса на венецуелски конски вирус VLP, VLP.

Атенюиращи вируси като вектори за ваксина

Един от пробивите в основата на областта на вирусните ваксини през последното десетилетие е осъзнаването, че репликационната компетентност и вирусната вирулентност не винаги корелират с имунологичната устойчивост. Например, VACV и неговите по-безопасни, силно атенюирани (дефектни по репликация) братовчеди — модифициран вирус на ваксина Анкара (MVA) 4,5,6 и Нюйоркски атенюиран vaccinia virus (NYVAC) 7 — показаха сравнима и понякога дори по-добра имуногенност при животните проучвания 8,9,10,11 . Понастоящем широк спектър от семейства вируси са в процес на интензивно разработване като вектори за ваксини за човешка или ветеринарна употреба, включително някои, които са компетентни за репликация, но също така и много, които са специално атенюирани. Таблица 1 очертава основните семейства вируси, които са в процес на разработка като вектори и свързаните с тях заболявания.

Имунно избягване: последици за отслабването. Исторически, затихването на вирусите е било емпирично, чрез непрекъснато преминаване в трансформирани клетъчни линии или в атипични гостоприемници и чрез доставяне по неестествени пътища. Много вируси са сложни патогени и големите ДНК вируси като поксвируси, аденовируси (AdVs) и херпесвируси са посветили голяма част от геномите си на гени, които им позволяват да избягват имунните отговори на гостоприемника. Много такива вирусни гени кодират протеини, които засягат специфични имунни защити, включително тези, които действат върху ранните вродени пътища, като пътища, включващи интерферони 12, рецептори за разпознаване на образи (Toll-подобни рецептори TLRs) 13,14, хемокини 15,16 и цитокини 17, както и тези, които действат върху последващи адаптивни реакции чрез промяна на обработката на главния комплекс за хистосъвместимост на вирусни пептиди 18,19,20. Към днешна дата повечето процеси на затихване - например чрез непрекъснати инвитро преминаване в клетъчни линии - не са селективни за видовете вирусни гени, които са загубени или променени. В крайна сметка, вирусните варианти са избрани поради липсата на вредни ефекти при малки животни, така че те вече не са патогенни и не причиняват на гостоприемника малка или никаква вреда. Въпреки това, вирусните гени, които се губят или променят по време на процеса на неспецифично затихване, може да не са непременно най-оптималните по отношение на подобряването на вируса за имунното представяне на рекомбинантни вложки с по-мощен адювантен ефект. Като се има предвид, че много вирусни геноми сега са добре охарактеризирани, бъдещите усилия за подобряване на адювантните свойства на вирусните вектори и тяхното проектиране за предизвикване на различни типове отговори ще се основават на насочване към специфични вирусни гени, които по различен начин влияят върху имунната система на гостоприемника. Например, нокаутирането на вирусни гени, които са еволюирали, за да намалят антивирусните имунни отговори на гостоприемника, може да намали свойствата за избягване на имунитета и да подобри специфичните за адюванта характеристики на определени вирусни вектори, но антивекторните отговори могат да попречат на последващата повторна употреба на този вектор в индивид .

Емпирично срещу рационално затихване. Атенюираните поксвируси бяха използвани за първи път по време на кампанията за ликвидиране на едра шарка и оттогава бяха доразвити и използвани като вектори за ваксина. Един от тях, MVA, е бил пасиран повече от 570 пъти във фибробласти на пилешки ембриони, губи приблизително 15% от генома си и в крайна сметка е бил дефектен в репликацията в клетките на бозайници 4,21,22. Обратно, NYVAC е получен от копенхагенския изолат на VACV чрез изтриването на 18 различни ORF чрез инвитро рекомбинация, която е причинила дефицит на репликация 7 . Няколко скорошни проучвания показват, че MVA поддържа силен имуностимулиращ капацитет, може би дори по-голям от този на NYVAC 23,24,25,26, докато скорошно проучване на примати на кандидати за ваксина срещу HIV-1 показа, че тези два вектора, получени от ваксина, предизвикват качествено различни видове имунни отговори към кодираните Gag-Pol-Nef (групово-специфичен антиген-полимераза-HIV-1 отрицателен фактор) и обвивни (Env) антигени - NYVAC индуцира доминиращ CD4 + Т-клетъчен отговор, докато MVA индуцира по-силен CD8 + Т клетъчен отговор и придружаващи CD4 + Т клетъчни отговори 27 . Комбинираното действие на много вирусни протеини, някои от които действат върху TLR сигналните пътища и други антиген-представящи клетъчни функции, вероятно обяснява тези разлики. Докато няма по-добри прогнозни анализи за in vivo резултат, процесът ще остане до голяма степен емпиричен и зависи от най-добрите in vivo модели за оценка на имуностимулиращите свойства на всеки вектор. Независимо от това, в случай на емпирично атенюиран MVA, рационалното заличаване на гени може допълнително да повиши имуногенността, като два доклада демонстрират, че делецията на B15R, който кодира разтворим интерлевкин-1β (IL-1β) рецептор, може да увеличи специфичния за вируса памет CD8 + Т клетъчен отговор 28,29. По същия начин, чрез намаляване на вектор-специфичната генна експресия на рекомбинантен VACV, CD8 + Т клетъчният отговор към самия вектор може да бъде намален и този срещу трансгена следователно засилен 30 . Бъдещите усилия трябва да продължат по тези линии, целящи да изтрият повече гени, самостоятелно и в комбинация, в опит за рационално повишаване на имуногенността на тези вирусни вектори.

Повишаване на имуногенността

Режими на първично усилване. През 90-те години вълнението заобикаля появата на ДНК плазмидни ваксини. Скоро обаче стана ясно, че ДНК ваксините сами по себе си са недостатъчно имуногенни, за да генерират Т-клетъчни отговори с величина, достатъчна за защита срещу трудни заболявания при хората 31,32. С напредъка в количествените Т-клетъчни анализи, които се използват в клинични изпитвания, включително ex vivo интерферон-γ ELISPOT (ензимно-свързан имуносорбентно петно) и култивирани интерферон-γ ELISPOT анализи, както и многопараметрична поточна цитометрия 33,34, вирусните вектори отново заеха централно място след демонстрирането на тяхната повишена сила за клетъчни имунни отговори в сравнение с други типове ваксини335 ,36 . Въпреки това, за разлика от ДНК ваксините, след едно или две приложения in vivo, отговорите на гостоприемника към структурните протеини на самия вирусен вектор стават самоограничаващи се, което води до намаляване на отговорите срещу ваксината, когато векторът се използва за множество имунизации. Разработването на протоколи за първично усилване е необходимо за преодоляване на тези антивекторни отговори, като същевременно се максимизира отговорът на гостоприемника към вложката за ваксина.

Първоначално хетероложните протоколи за първично усилване с обикновени вложки за ваксина често използват ДНК плазмид за зареждане на имунната система, но в последно време интересът нараства към използването на комбинации от различни рекомбинантни вирусни вектори и към това как тяхната последователност на приложение може да повлияе на естеството на индуциран имунен отговор. Множество подходи вече са тествани както при животински модели, така и при хора, включително DNA–MVA, DNA–NYVAC, вирус на птича шарка (FPV)–MVA, грип–MVA, AdV–MVA, хетероложен AdV–AdV и ДНК–Sendai вирус, насочване широк спектър от заболявания от малария, ХИВ-1, туберкулоза (ТБ) и хепатит С до ракови заболявания (Таблица 2). Последователно наблюдение през всички тези проучвания е диференциалната способност на определени вектори да първоначално или да засилят отговорите. ДНК ваксините, FPV и грипния вирус са добри праймиращи вектори, докато поксвирусите (MVA и NYVAC) са последователно в състояние да засилят Т-клетъчните отговори, които се праймират по други начини. Голяма част от данни сега показват, че като цяло рекомбинантният AdV може да започне и да засили Т-клетъчните и В-клетъчните отговори забележително добре 10,31,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Съвсем наскоро беше използвана комбинация от три несвързани векторни модалности, изразяващи една и съща ваксина 47,48. Оценката на тези вектори е подпомогната от по-задълбочен анализ, по-специално чрез използване на многопараметрична поточна цитометрия 34 , която позволява дисекцията на различните популации на Т клетки - както фенотипно, така и по отношение на производството на цитокини и ефекторната функция - че са индуцирани от такива различни вектори и режими 27,37,49,50,51,52,53 . Съпоставянето на защитните резултати на „качество срещу количество“ на Т клетъчните отговори, които са индуцирани от тези различни имунизационни режими и векторни стратегии, остава предизвикателство за тази област.

Повишаване на хуморалния имунитет. По-нова работа установи използването на режими на първична имунизация за индуциране на В-клетъчни, както и Т-клетъчни отговори, по-специално AdV-MVA или хетероложни AdV-AdV режими 39,40. Индукцията на двете рамена на адаптивния имунен отговор вероятно ще бъде от полза за защита срещу патогени като маларийни паразити и много вируси, за разлика от микобактериите, за които клетъчният имунитет вероятно е доминиращ защитен механизъм. Изглежда, че AdV векторите са в състояние да засилят и засилят отговорите на В-клетките, за разлика от MVA векторите, които са много по-способни да засилят отговора, отколкото да го засилят. Това може да е резултат от продължителна експресия на антиген на високо ниво след имунизация с AdV, която е по-полезна за праймиране на В клетки, в сравнение с кратък изблик на антиген от MVA, който е по-подходящ за стимулиране на В клетките 54 . Алтернативно, проучвания върху плазмоцитоидни дендритни клетки показват, че вълна от цитокини, по-специално тип I интерферон (IFN) и след това IL-6, е от съществено значение за стимулиране на диференцирането на В-клетките в ефекторни плазмени клетки в отговор на инфекция с грипен вирус 55 . Обратно, праймирането на трансген-специфични антитяло отговори от AdV вектори изглежда отрицателно корелира с производството на IFN тип I 56,57, което също е свързано с намалена трансгенна експресия 58 . В случай на MVA, E3L придава резистентност към IFN тип I и е от съществено значение за устойчивия растеж на фибробластите на пилешки ембриони и E3L-нокаут вирус индуцира повишени нива на пилешки тип I IFN и IL-6 в клетъчната култура 59,60. Ако праймирането на В-клетки чрез MVA се случи по начин, подобен на този, индуциран от грипния вирус, E3L-медиираният механизъм на имунно избягване може да обясни слабото праймиране на В-клетки, което се наблюдава с този вектор. В крайна сметка, много по-доброто разбиране на това как цитокините могат да повлияят на индуцирането на В-клетъчни отговори от различни семейства вируси е от съществено значение за подобряване на рационалния дизайн на векторите и стратегиите за първично усилване, които могат да бъдат пригодени за индуциране на оптимални отговори на антителата.

Заобикаляне на съществуващ имунитет. Вирусите, които обикновено заразяват човешката популация, носят със себе си проблема за съществуващия имунитет. За някои вирусни вектори, като тези, базирани на човешки AdV и херпесвируси, това може да бъде сериозна пречка. Например, кандидат HIV-1 ваксина, базирана на човешки AdV серотип 5 (HAdV-5) вектор, наскоро беше оценена във фаза II проучване, проведено при лица, които са изложени на висок риск от HIV-1 инфекция. Изпитването беше спряно поради липса на ефикасност, но по това време се наблюдаваше незначителна тенденция към повишено придобиване на HIV-1 инфекция при тези индивиди с по-високи титри на съществуващи HAdV-5-неутрализиращи антитела към момента на записване 52, 61 . Този въпрос провокира интензивен дебат относно използването на този често срещан човешки вирус като вектор за ваксина, но въпреки това неуспех за векторната платформа HAdV-5 активно се преследват други стратегии за предоставяне на жизнеспособни алтернативи, които могат да преодолеят вече съществуващия векторен имунитет 62 . Те включват модифициране на вектора за експресиране на хетероложни аденовирусни хексони 63 или използване на човешки аденовируси с по-редки серотипове 40,44,64,65 или такива от други видове като шимпанзета 66,67,68,69,70. Важно е, че всички такива нови вектори, особено тези, които са екзогенни за даден вид, ще трябва да изчистят регулаторните, безопасни и производствени пречки.

Емпиричен срещу рационален дизайн на векторни ваксини. С нашите разширяващи се познания по имунология и вирусна биология беше установена нова ера на науката във ваксинологията, която осигури бъдеща основа за рационалното развитие на ваксини с вирусни вектори. Оптимизиране на дизайна на антиген на субединицата ваксина и разбиране на векторния тропизъм, включително обработка и представяне на целеви антиген in vivo, е от решаващо значение за този подход. В случая на VACV е показано, че пътят на приложение 71, както и поксвирусният промотор, използван за задвижване на трансгенна експресия 72, могат да повлияят на степента, до която антигените са директно или кръстосано представени в Т клетките. По същия начин, новите данни показват, че структурните антигени на ортопоксвируса, които се експресират късно в инфекцията и обикновено не могат да влязат в директния път на представяне поради неуспешна инфекция в антиген-представящи клетки, също са специално скрити във вирусни фабрики, като по този начин избягват кръстосаното представяне път и възпрепятства индуцирането на специфични за поксвирус CD8 + Т клетъчни отговори 73 . Това не е така за чужди антигени, задвижвани от ранни или късни промотори на поксвирус, тъй като тези антигени обикновено не са насочени към такива фабрики на поксвируси. Важно е последствията от такива наблюдения за индуцирани от ваксина Т клетъчни отговори срещу вектора и трансгена да бъдат по-добре разбрани и тези данни може да започнат да обясняват защо поксвирусните вектори като MVA са показали, че са ефективни при повторно засилване на имунитета реакции при хора 12 месеца след предишна имунизация със същия вектор 74 .

„Инженерен“ имунитет. За разлика от огромната сложност на анти-векторния имунитет, който е свързан с устойчиви ДНК вируси като аденовируси, конструираните лентивируси, лишени от голяма част от структурните им антигени, са разработени като вектори за доставяне на гени до специфични клетки in vivo за вътреклетъчна имунизация 75 . Това става възможно отчасти от минималната експресия на гени на лентивирусния вектор и отчасти поради повтарянето in vivo прилагането (както при традиционната имунизация) не е целта. Всъщност лентивирусите понастоящем се използват за „инженеринг на имунитет“ за рак и ХИВ-1 (Справки 76, 77). Трансдукцията на хемопоетични стволови клетки с лентивируси, съдържащи Т клетъчни рецепторни гени, вече е влязла в клинични тестове за имунотерапия на рак. Също така е постигнат значителен предклиничен напредък при използване на тези вектори за трансдуциране на човешки CD34 + клетки с В клетъчни рецепторни гени, кодиращи неутрализиращи моноклонални антитела срещу HIV-1 (Спр. 76). Разработени са и стратегии за насочване на лентивирусни вектори към специфични типове клетки, като подгрупи от кожни дендритни клетки (DC), например, мутирала версия на фузогенния протеин на вируса Sindbis, който запазва способността да свързва DC-SIGN (специфичен за дендритни клетки ICAM3-грабващи неинтегринови) протеини са разработени 78 . Разработването на по-нататъшни специфични технологии за насочване би могло значително да подобри рационалния дизайн на вирусни векторни ваксини, които предизвикват съобразени и ефективни имунни отговори за превенция на широк спектър от инфекциозни заболявания и ракови заболявания.

Напредък във ветеринарните ваксини

Най-успешните приложения на вирусно-векторните ваксини несъмнено са във ветеринарната област. Това е в контраст с разработването на ваксини за човешка употреба, което включва по-строги регулаторни изисквания, поетапни клинични изпитвания с хора доброволци и по-дълго време за лицензиране и възвръщаемост на инвестициите. Понастоящем най-малко 12 ваксини с вирусен вектор са лицензирани за ветеринарна употреба (Таблица 3), а много други са в процес на разработка (за преглед вижте справки 79, 80). Независимо от това, тези технологии все още са изправени пред тежка борба срещу конкуренцията от класическите инактивирани ваксини, които често са по-лесни за производство. Предизвикателствата при контролирането на инфлуенцата по птиците при домашните птици се ръководят от икономиката и изискват стратегии за масова ваксинация, като приложение в питейна вода, чрез аерозолен спрей или чрез имунизация in ovo 81 (фиг. 2). Поддържането на ниски разходи за тези начини на приложение, като същевременно поддържа ефикасността на ваксината, представлява значителни предизвикателства за технологиите с рекомбинантни вирусни вектори. Един успешен подход е използването на новия рекомбинантен вирус на Нюкасълска болест (NDV), който осигурява двувалентен метод за контрол на два различни патогена по птиците едновременно чрез in ovo имунизация 82 . Нови стратегии за ваксинация за друг важен и силно заразен ветеринарен патоген, вируса на болестта шап (FMDV) 83, се изследват с помощта на HAdV-5 с дефектна репликация. Защитен имунитет е издигнат при говеда и свине 7 дни след еднократна имунизация с рекомбинантен HAdV-5, експресиращ FMDV капсид и протеазни антигени 84,85. За разлика от инактивираните ваксини с цели вируси, способността за разграничаване на заразени от ваксинираните животни (DIVA виж каре 1) с помощта на тази платформа за векторна ваксина, в съчетание със значително повишена биобезопасност, би направила тази ефективна технология много желана за страни, свободни от шамар. По същия начин, по отношение на важни респираторни патогени на добитъка, като туберкулоза по говедата, се изследват рекомбинантни HAdV-5 или MVA ваксинни вектори. Тези вектори, експресиращи антигена на микобактериалната миколил трансфераза 85А, са описани като ефективни усилващи агенти за Mycobacterium bovis bacill Calmette-Guérin (BCG) ваксина при говеда 86,87,88 . Сега са необходими експерименти с предизвикателство, за да се оцени защитата с тези режими на усилване на BCG първичен вектор в стада имунизирани говеда след директно излагане, а също и в среда на естествено предаване. Ако е по-ефективно от само ваксината BCG, използването на векторни ваксини за засилване на отговорите, базирани на BCG, може да бъде обещаващо за контрола на туберкулозата по говедата, която се оценява, че струва на света приблизително 3 милиарда долара годишно. Важно е, че условията за туберкулоза при говедата продължават да предоставят полезна имунологична информация за проектирането и тестването на кандидат-ваксини срещу човешки туберкулоза 89 .

Показани са потенциални предимства (+) и недостатъци (-) за различни възможни начини на ваксинация. а | Интрамускулната имунизация е основният подход към ваксинацията при хора, с малки изключения като Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guérin (BCG) ваксина, които се прилагат рутинно интрадермално. Понастоящем напредва работата по разработването на транскутанни устройства без игли, като пластири, покрити с ваксина, които могат да се поставят самостоятелно при отсъствие на обучен индивид – очевидно предимство за масова и спешна ваксинация. Някои ваксини срещу рак могат също да се прилагат интравенозно, но като цяло опасенията за безопасността остават високи за този път. Имунитетът на лигавицата може да се засили в стомашно-чревния (GI) и дихателните пътища чрез използването на перорални или аерозолни ваксини. Това може да повиши защитния имунитет към патогени, например срещу туберкулозна инфекция в белите дробове или HIV инфекция в тъканта на лигавицата. Рекомбинантният аденовирус човешки серотип 41 (HAdV-41), естествен ентерален патоген, може да се окаже по-подходящ вектор за орален път, като се има предвид, че се съобщава, че стимулира имунните отговори при киселинни условия 127 . Въпреки това, все още трябва да се свърши много работа по отношение на демонстрирането и поддържането на безопасността, ефикасността, стабилността и дозирането на ваксините, преди тези начини на ваксинация да могат да бъдат широко използвани при хора.Поддържането на ниски разходите за използване на който и да е от тези по-малко стандартни начини на приложение при хора, като същевременно се поддържа ефикасността на ваксината и, което е по-важно, безопасността поставя значителни предизвикателства за технологиите с рекомбинантни вирусни вектори и все още се изискват много изследвания за доказване на концепцията. б | Ветеринарните ваксини също използват стандартни парентерални имунизационни пътища (интрадермални и интрамускулни), но използването на алтернативни пътища като приложение в питейна вода, чрез аерозолен спрей или чрез имунизация in ovo се ръководят от икономика, по-малко строги изисквания за безопасност при животните и честата нужда от стратегии за масова ваксинация.

Ваксини срещу човешки инфекциозни заболявания

Вирусните векторни ваксини първоначално са разработени, за да индуцират защитни Т-клетъчни отговори срещу вътреклетъчни патогени. Въпреки това, до момента нито ваксина с вирусен вектор, нито ваксина, която действа директно от Т-клетъчно-медииран имунитет (с възможно изключение на BCG), са лицензирани за човешка употреба. Тази ситуация се усложнява от факта, че тези нови подходи са избрани за някои от най-сложните човешки патогени, за които конвенционалните подходи за ваксинация не са били ефективни. Те включват Plasmodium falciparum малария, Mycobacterium tuberculosis и ХИВ-1. Въпреки това е постигнат значителен напредък с технологиите за рекомбинантна вирусна ваксина. Списък с вектори, които в момента се разработват за човешка употреба, е представен в Таблица 2. Впечатляващи нива на Т-клетъчна имуногенност сега се съобщават за първи път в клинични изпитвания при хора - цел, която въпреки обширните усилия все още не е постигната само чрез технологии за ДНК плазмидна ваксина. Ключът към този напредък е разработването на ваксини с AdV-вектор - AdV има забележителна способност да подготвя имунни отговори срещу трансген, който може да бъде повишен до високи нива с втори вектор, който е рекомбинантен за същия антиген, обикновено MVA или втори AdV на хетероложен серотип. По същия начин, както MVA, така и AdV могат значително да засилят имунните отговори, подготвени с други средства, например BCG ваксинация. Сравнение на тези два широко използвани вектора е предоставено в Таблица 4.

Ваксини срещу малария. Наскоро беше постигнат напредък при използване на смес от два вектора HAdV-5, експресиращи малариен антиген в предеритроцитен стадий циркумспорозоит протеин (CSP) или антиген на малариен антиген в кръвен стадий на апикален мембранен антиген 1 (AMA1) 90 . След единична имунизация при хора доброволци, впечатляващ среден отговор на всеки антиген от 500–1000 петнообразуващи единици (SFU) на милион мононуклеарни клетки на периферната кръв (PBMCs) беше измерен чрез ex vivo IFN-γ ELISPOT. Изследванията за изчерпване определят отговора като смесен CD8 + и CD4 + Т клетъчен отговор, като фенотипът на CD8 + е три до пет пъти по-чест от фенотипа CD4 + сред IFN-γ-секретиращите отговорни клетки, измерен чрез поточна цитометрия (M. Седега и Т. Ричи, лична комуникация). В опит да се заобиколи проблемът със съществуващите реакции на гостоприемника към HAdV-5, рекомбинантните аденовируси от редки човешки серотипове или от нечовешки примати също се разработват като кандидати за ваксина срещу малария. Подготовката и подсилването с хетероложни AdVs, като HAdV-35 и HAdV-11, се проучват предклинично 44 и, окуражаващо, рекомбинантен аденовирус на шимпанзе серотип 63 (AdCh63) 70, експресиращ пре-еритроцитния стадий на антиген-рефулирания протеин от еритроцитен антиген ad thrombohe към многоепитопен низ (ME-TRAP), последван от усилване с MVA, предизвиква средни нива от >1,000 SFU на милион PBMCs срещу маларийния антиген при хора доброволци (A. Hill, лична комуникация). По-нататъшни предклинични проучвания също съобщават за използването на режим на AdV-MVA при мишки за индуциране на високотитърни отговори на антитела и мощни Т-клетъчни отговори. Този специфичен режим на HAdV-5-MVA, използващ вектори, които са рекомбинантни за антигена на маларийния антиген мерозоит 1 (MSP1), индуцира защитни реакции на антитела срещу инфекция в кръвен стадий 39, както и Т-клетъчни отговори, които са частично ефективни срещу предшестващата инфекция в чернодробен стадий 91 .

Режимите на имунизация с хетероложни поксвируси и ДНК-поксвируси установяват стойността на подходите за първично усилване при хора, постигайки много по-силни Т-клетъчни отговори в клинични изпитвания, отколкото едновекторните подходи 31,38,92. Независимо от това, ефикасността е ограничена и затова изследванията на маларията във фаза IIa на тези нови ваксини с AdV-вектор, планирани за 2009–2010 г., ще бъдат важни. Дори и да успеят, тези обещаващи кандидати за ваксини ще бъдат изправени пред допълнителни предизвикателства, включително потенциалните проблеми на съществуващия имунитет на високо ниво към вектора на HAdV-5 в човешката (особено африканската) популация 93 . Освен това остава да се види колко имуногенни AdV вектори ще бъдат в целевата популация от малки африкански деца. При деца на възраст между 1 и 6 години, живеещи в райони с висока степен на предаване на малария, се съобщава за намалена имуногенност на ваксините в сравнение с естествено имунизирани възрастни африкански хора и доброволци, нелекуващи малария, в развитите страни 94 .

Ваксини срещу туберкулоза. Подобно на ситуацията с маларията, много обещаващи програми за векторна ваксина са в ход за туберкулоза при хора. Те остават до известна степен възпрепятствани поради липсата на експериментален модел на предизвикателство за хора, въпреки че се полагат усилия за разработване M. bovis BCG като сурогатно предизвикателство за М. туберкулоза при хората 86 . Следователно, полеви опити за ефикасност остават от съществено значение, след като кандидат-ваксините са избрани - процес, който е едновременно дълъг и скъп. BCG prime и MVA-85A (MVA вектор, съдържащ гена, кодиращ антигена на микобактериалната миколил трансфераза 85A) сега влиза във фаза IIb проучване за ефикасност в Южна Африка и досега демонстрира високи нива на Т-клетъчна имуногенност както в Обединеното кралство и Африка и отличен рекорд за безопасност при над 500 души, включително възрастни, юноши, бебета, ХИВ-позитивни лица и тези, които са латентно заразени с М. туберкулоза 51,95,96,97 . Областта на ваксините срещу туберкулоза също разработва ваксини кандидати за AdV-вектор и използва подобни подходи за заобикаляне на човешките анти-HAdV-5 отговори чрез използване на редки човешки серотипове като HAdV-35. Кандидат за ваксина HAdV-35, експресиращ сливане на три туберкулозни антигена, 85A, 85B и 10.4 (Спр. 98), може да засили Т клетъчните отговори, които са подготвени или от BCG, или от рекомбинантен BCG при нечовекоподобни примати 99, установявайки подход който се тества при хора 100 . Смесен CD8 + и CD4 + T клетъчен отговор е докладван във фаза I проучвания както в САЩ, така и в Южна Африка 137 , но приносът на CD8 + T клетъчните отговори към човешкия имунитет срещу туберкулоза остава неясен. И за двата водещи кандидати за ваксини с вирусен вектор, предклиничните проучвания сега активно преследват потенциала за аерозолно, а не системно доставяне, вероятно с помощта на пулверизатори, за да се опитат да повишат имунитета на лигавицата, който може да бъде по-защитен срещу М. туберкулоза инфекция 50 (фиг. 2). Необходими са допълнителни предклинични данни от нечовекоподобни примати, ако искаме да отговорим на тези нерешени имунологични въпроси.

Флавивируси. Жълтата треска, вирусно заболяване, се появява отново при наивните хора поради промяна в нейната епидемиология. Високоефективна атенюирана ваксина (YFV-17D) се използва при хора повече от 70 години 101 . С разработването на живи атенюирани флавивирусни вектори, базирани на YFV-17D, еволюира програма за рационално разработване на флавивирусни ваксини 102, в която preM–Env гените, кодиращи пред-мембранните и обвивните протеини на флавивируса, са заменени с тези от вируса на Западен Нил, вируса на японския енцефалит или вируса на денга за генериране на химерни вектори. Беше много по-трудно да се експресират стабилно нефлавивирусни антигени в тези вектори, но се съобщава за вмъкване на не-флавивирусни епитопи 103 , както и за стабилното вмъкване на GFP 104 . След обширни и успешни тестове за безопасност и имуногенност във фаза I–III проучвания, химерният флавивирус за японски енцефалит може да бъде първата ваксина с вирусен вектор, която е лицензирана за употреба при хора 105 .

Грипен вирус. Разработването на противогрипна ваксина с кръстосани щамове би било голямо и дълго търсено постижение, особено като се има предвид продължаващата сезонна поява на нови варианти на грип, настоящата пандемия от грипен вирус H1N1 и възможността от огнище на високопатогенна инфлуенца по птиците. Индуцирането на защитни Т-клетъчни отговори срещу запазени вътрешни грипни антигени, а не на вариант-специфични антитела срещу повърхностни хемаглутинин и невраминидазни антигени, е един подход, който може да има шанс за успех. Фаза I изпитания на нов кандидат за кръстосана грипна ваксина в момента са в ход, като се използва MVA вектор, който експресира високо запазения вътрешен нуклеопротеин и матрикс 1 (NP-M1) антигени на грип А. Този вектор може да засили Т-клетъчните отговори при индивиди, които вероятно са подготвени от естествена експозиция (S. Gilbert, лична комуникация). Ако тези Т-клетъчни отговори са свързани със защита, както предполагат някои доказателства 106, тогава подходът за ваксина с вирусен вектор може да се окаже високо рентабилен в сравнение със сезонните имунизации срещу грип, насочени към индуциране на антитела срещу специфичните за варианта антигени на повърхностната обвивка.

ХИВ. Може би по-голямо предизвикателство за разработването на ваксини от сезонната променливост и антигенния дрейф на грипния вирус е непрекъснато развиващата се епидемия на ХИВ. Т-клетъчните индуциращи ваксини срещу HIV-1 имат за цел да намалят вирусния товар и загубата на CD4 + T клетки, да удължат преживяемостта и да намалят предаването 107 . Подновените усилия са насочени към режими на поксвирус, използващи атенюиран вирус на канарска шарка (ALVAC), MVA или NYVAC. Всеки от тези вектори за поксвирусна ваксина е разработен и оценен за способността им да индуцират HIV-1-специфични имунни отговори при хора. Най-новото клинично изпитване фаза III на HIV-1 използва комбинация от ALVAC и AIDSVAX (мономерен HIV-1 гликопротеин 120) в голяма популация, базирана в общността, при която рискът от предаване се основава на хетеросексуалния начин на живот. Въпреки че проучването установи обнадеждаваща тенденция към превенция на HIV-1 инфекция (31,2% ефикасност), няма полза за постинфекционния вирусен товар или броя на CD4 + Т клетките 108 . В предклинични проучвания за ефикасност при нечовекоподобни примати, се съобщава за контрол на вирусното натоварване и запазване на броя на CD4 + Т клетките, когато определени вектори, базирани на шарка, са били използвани в хетероложни комбинации първично-усилване за засилване на отговорите с праймиране на ДНК 41,48. Те са в състояние да индуцират реакции на антитела срещу Env и да предизвикат Т-клетъчни отговори на различни нива. При хората Т-клетъчните отговори са със смесен фенотип CD4 + и CD8 + и са многофункционални по отношение на производството на цитокини 37,109,110. Независимо от това, остава консенсусът, че тези режими на ваксина трябва да бъдат подобрени, за да се увеличат величината и широчината на CD8 + и CD4 + T клетъчните отговори срещу антигени като Gag и Pol и за индуциране на неутрализиращи антитела с висок титър или антитела с висока авидност срещу нативния тримерен протеин Env.

Разработването на HAdV-5 рекомбинанти за ваксинация срещу HIV-1 доведе до най-имуногенната кандидат-ваксина до момента, която беше пренесена в изпитване за ефикасност при хора, обозначено STEP. Рекомбинантите HAdV-5 останаха водещ подход за разработчиците на ваксини срещу HIV-1, докато STEP изпитването не беше прекратено поради безполезност 52,61,111. Въпреки че много по-силни Т-клетъчни отговори са били предизвикани в програмите за ваксинация срещу малария и туберкулоза при хора, провалът на изпитването STEP беше предложен от някои като основание за отхвърляне на концепцията за ваксини, насочени към индуциране на Т-клетъчно-медииран имунитет. Обнадеждаващо обаче, след известно първоначално униние, дискусията се пренасочи към по-нататъшното оптимизиране на имуногените и технологиите на ваксините 62 . Действително, сега, когато се съобщава за далеч по-висока индукция на Т-клетките за не-HIV инфекции, е време да съпоставим тези в областта на ваксината срещу ХИВ. Разработчиците на ваксини за ХИВ-1 вече са започнали да се фокусират върху други, по-малко установени, химерни технологии с вирусен вектор. Вирусът Sendai, цитомегаловирусът (CMV), реовирусът, вирусът на херпес симплекс и NDV в момента се оценяват от редица групи, включително Международната инициатива за ваксина срещу СПИН (IAVI). Неотдавнашната употреба на CMV като вектор показа, че този вектор има значителна ефикасност в строгия SIVMAC (вирус на маймуна имунна недостатъчност на макака) rhesus macaque предизвикателен модел, надвишаващ потискането на вирусното натоварване, което се наблюдава при друго проучване, използващо HAdV-5 (Справки 112, 113). Алтернативните стратегии вероятно ще комбинират най-имуногенните режими на първично усилване, които са налични в момента, като AdV-MVA или хетероложни AdV-AdV режими или дори тройни комбинации, за да се улесни набирането както на Т-клетъчните, така и на В-клетъчните отговори 41,114. Наскоро беше описан режим на рекомбинантен HAdV-26-HAdV-5, който може да индуцира Т-клетъчен отговор срещу SIVMAC Гаг при макаците резус, който е по-силен, по-полифункционален и по-защитен от отговора, предизвикан от хомоложен режим на HAdV-5 40 . В действителност, средно от >2 000 SFU на милион PBMCs е постигнато при тези макаци 40, в сравнение с около 300 SFU на милион PBMCs средно при доброволци в HAdV-5 хомоложния първично-усилващ STEP опит 52 . Бъдещите проучвания ще разкрият дали тези подходи могат последователно да подобрят показателите за имунологичен и вирусен контрол, които бяха определени от комбинацията от ДНК и HAdV-5 ваксинни вектори в SIVMAC предизвикателство модел резус макак.

Ваксини срещу рак. Областта на ваксината срещу рак (за изчерпателни прегледи, виж справки 115, 116) не само е претърпяла проблема за предизвикване на силни, трайни, ефективни имунни отговори (проблем, споделен с много ваксини срещу инфекциозни заболявания), но също така се е опитал да направи това в лицето на уникалното и сложно предизвикателство за нарушаване на толерантността срещу собствени антигени - които по дефиниция са или слабо имуногенни, или функционално неимуногенни в имунологично компрометирана среда. Интригуващо е, че изглежда има надежда за определени ваксини срещу рак в специфични условия. Използването на терапевтични ваксини с вирусен вектор, насочени към карциноембрионния антиген (CEA), в комбинация с локална радиация, химиотерапия или цитотоксични Т лимфоцитен протеин 4 (CTLA4)-специфични моноклонални антитела, доведе до подобрена преживяемост при някои пациенти 117 . В тази обстановка е наблюдавана „антигенна каскада“, при която Т-клетъчните отговори към СЕА са отбелязани не само след ваксинация, но и като de novo отговори на други тумор-асоциирани антигени (TAAs), които вероятно са били индуцирани след по-ефективно имунно насочване на ракови клетки. MVA векторите, експресиращи TAAs, понастоящем също са в напреднали клинични изпитвания като допълнение към терапиите от първа линия за рак на бъбреците, простатата и недребноклетъчния рак на белия дроб 118,119,120. Последните имунологични анализи показват, че има значителна корелация между нивото на активираните естествени клетки убийци в началото и последващата ефикасност при пациенти, получаващи химиотерапия плюс MVA–MUC1–IL-2 за рак на белия дроб 121 . Нивото на активирани естествени клетки убийци може потенциално да се използва като предсказващ биомаркер за пациенти, които биха могли да се възползват от комбинираната терапия за имунизация на вирусен вектор. Както при имунно-компрометиращи вирусни инфекции, използването на ваксини срещу рак в терапевтична среда ще изисква възстановяване на функционален и силен имунен отговор, който може да бъде поддържан в потенциално толерогенна среда - обстановка, предизвикана като част от стратегията за избягване на имунитета на някои видове рак. В тази светлина комбинираните терапии имат най-голяма надежда в областта на ваксината срещу рак, въпреки че предклиничните данни от проучвания при мишки 122 и нечовешки примати 123 показват, че AdV векторите, експресиращи кандидат TAA, могат да нарушат толерантността. Остава да се види дали кандидат-ракови ваксини, базирани на AdV вектори, могат да постигнат дори по-добра имуногенност при проучвания при хора от тази, наблюдавана при имунотерапии, базирани на поксвирус.

Повечето вируси са развили механизми за избягване на имунните отговори на гостоприемника и за модулиране на последващата възпалителна среда по различни начини. Тези уклончиви характеристики са в противоречие с имуностимулиращите свойства на идеалните адюванти за ваксини. Въпреки това, в новата ера на геномиката, специфични вирусни гени, кодиращи фактори с имуноотклоняващи свойства, са насочени към подобряване на тези имуностимулиращи свойства. Тази нова наука във ваксинологията не само използва добре установени вирусни вектори, но и тъй като се откриват нови вируси и се характеризира тяхната полезност като вектори за ваксина, също се изследва. Например, разследвания са в ход, като се използват множество стратегии за намиране на алтернативни вектори за заобикаляне на проблема с вече съществуващия имунитет на векторите. Тези вектори, съчетани с нови режими на първоначално усилване на ваксината, които ще предизвикат по-силни, по-широки и по-трайни ефекторни реакции, предлагат обещаващи решения на имунологични проблеми. Появата на много нови векторни системи не трябва да отвлича вниманието от големите възможности за подобряване на сегашните вектори. Подходите, които нокаутират вирусните гени и водят до подобрено представяне на антигена, подобрени адювантни ефекти и умишлено изкривяване на имунните отговори, са важни нови линии на изследване. Новите технологии включват по-лесното манипулиране на геномите на поксвируса чрез „рекомбиниране“ в бактериални изкуствени хромозоми 28,124 и високопроизводително вмъкване на трансген в AdV вектори, включително използването на бактериални tet операторни елементи в трансгенния промотор за спиране на транскрипцията на трансгени, които могат да бъдат токсични или вредни за вирусния растеж 125 . Използването на такива технологии ще бъде прието за редица различни векторни платформи, което позволява скрининг на нови вирусни ваксинни вектори, които остават безопасни, но показват подобрена имуногенност за рекомбинантните ваксинни антигени, които доставят.

Разработването на ваксини с вирусен вектор за използване при животни и хора е изправено пред съществени предизвикателства, както в научната, така и в регулаторната сфера. Тези технологии обаче най-накрая постигат ефикасността при животните и силните имунни реакции при хората, които са търсени толкова дълго, по-специално в областта на маларията, туберкулозата и грипа. Преводът на тези нови технологии ще улесни разработването на ваксини срещу някои от най-трудните предизвикателства в областта, като рак и ХИВ-1. Лицензирането на вирусни векторни ваксини с дефицит на репликация е осъществимо, като се има предвид, че те се намират между двете крайности на ваксините с протеин в адювант и живите вирусни ваксини - и двете, след значителни усилия, са били лицензирани преди. С първата химерна флавивирусна ваксина срещу вируса на японския енцефалит в очакване на регулаторно одобрение, пътят е проправен за много други вирусни векторни ваксини в напреднало клинично развитие. Следващите 25 години ще се окажат предизвикателно, но вълнуващо време за този ренесанс в науката за ваксините.

Клетка 1 | Разграничаване на заразени от ваксинирани животни

В случай на някои инфекции на добитъка са налични ефективни конвенционални ваксини, но не могат да се използват без да се намесва в мониторинга на заболяването въз основа на серологични изследвания. Както естествената инфекция, така и ваксинацията водят до серопозитивно животно. Класически пример е вирусът на болестта шап (FMDV) при говедата: въпреки че инактивираните ваксини могат да се използват ефективно за контрол на болести, те не се използват рутинно в страни, свободни от FMDV, тъй като това би компрометирало страната, свободна от болести статут и водят до значителни икономически последици за международната търговия. Ваксините срещу шампа са използвани за намаляване на разпространението на болестта по време на епидемия, въпреки че ваксинираните животни впоследствие трябва да бъдат заклани, за да се даде възможност за възстановяване на статута на свободна от шампил на тази страна 126 . Други примери включват инфекция с херпесвирус тип 1 на говеда (която води до инфекциозен ринотрахеит по говедата), класическа чума по свинете и болестта на Ауески (причинена от псевдобесен вирус или suid херпесвирус 1) при прасета 79 .

Една алтернатива за предотвратяване на този сценарий е разработването на ваксини, които позволяват диференцирането на заразените от ваксинираните животни (DIVA). Това се постига чрез използването на субединични ваксини (например вирусни вектори, експресиращи единичен антиген от патогена) или селективна делеция на идентифицирани гени от конвенционални атенюирани ваксини. Следователно ваксинацията и естествената инфекция могат да бъдат разграничени серологично, като се използват подходящи диагностични анализи, които идентифицират реакциите на антитела срещу антиген във ваксината спрямо тези срещу антиген, който е изтрит или отсъства от ваксината, на който животното е изложено само чрез естествена инфекция с дивата природа - вид патоген.


Ваксини на базата на други вирусни протеини

В допълнение към овладяването и подобряването на хуморалния имунен отговор към HA антигена, универсалните ваксини срещу грипен вирус биха могли потенциално да се възползват от включване на разнообразни и по-високо запазени антигени.

Невраминидаза

Скорошно проучване, използващо модел на заразяване с грип при хора, предполага, че активността на инхибиране на серумната невраминидаза може да бъде по-предсказуема за чувствителността към заразяване с жив вирус, отколкото настоящия стандартен предиктор за защита, HAI титъра 127,128,129. NA е тип II трансмембранен гликопротеин, съставен от 11 подтипа, които попадат в три генетични групи (фиг. 3а). Този тетрамерен протеин премахва крайните сиалови киселини и улеснява освобождаването на новообразувани вирусни частици 130 (фиг. 3b). Въпреки че антителата срещу NA са идентифицирани 131,132,133,134, малко се знае за това как те влияят върху изхода от инфекция с грипен вирус 135 . NA е валидирана лекарствена цел, тъй като инхибиторите на NA с малки молекули, като озелтамивир, занамивир и ланинамивир, могат да модулират тежестта на заболяването 136 . Скорошно идентифициране и характеризиране на широко защитни антитела, които разпознават активното място на NA, предполагат, че тези антитела могат потенциално да бъдат индуцирани от ваксини 137 . Смята се, че антигенният дрейф и изместването на NA се появяват независимо от HA. В резултат на това N2 антителата може да са помогнали за ограничаване на тежестта на пандемията H3N2 от 1968 г., при която HA се промени, но NA не 138 . Въпреки че потенциалното значение на NA като имуноген срещу грип беше признато по време на тази пандемия 139,140, ​​настоящите производители на сезонни ваксини срещу грип не са длъжни да измерват количеството или качеството на NA в предлаганите на пазара продукти. Простото добавяне на известно количество конформационно правилен NA към настоящите сезонни ваксини може да подобри ефикасността и, потенциално, широчината срещу дрейфиращи щамове на грип 141,142. Допълнителни усилия, като например създаването на „консенсусни“ NA имуногени, се тестват в животински модели и може да са обещаващи за използване на NA като компонент на по-универсална ваксина 143 .

а | Филогенетично дърво на подтиповете на грип А и грип В невраминидаза (NA). Грипът A NA може да бъде разделен на три генетично различни подгрупи: група 1 се състои от N1, N4, N5 и N8, група 2 се състои от N2, N3, N6, N7 и N9, а група 3 има два NA подтипа от плодови прилепи (*N10 и *N11). Лентата на скалата показва броя на аминокиселинните замествания на място. б | Структура на грип NA. Показани са изгледи отгоре и отдолу на NA тетрамери. Запазване на последователност от избрани NAs от 1977 до 2018 г., изобразено в червено (променливо) и циан (запазено) и картографирано върху кристалната структура на ектодомена на NA от A/California/04/2009 (H1N1) (PDB 3TI6).

Матричен протеин 2 ектодомен

Ектодоменът на матричен протеин 2 на вируса на грип А (M2e) е предложен като универсален антиген за ваксина 144,145, но M2e представлява множество предизвикателства. Въпреки че йонният канал M2 е от съществено значение за напъпването на грипния вирус и разглобяването на вирусното ядро ​​и поради това е силно запазен, неговият повърхностно експониран аминотерминален ектомейн е слабо имуногенен 146 . Ако M2e се конюгира с различни носители или се доставя като вирусоподобна частица, неговата имуногенност се подобрява 147 . Всъщност, IgG-медиирана защита от широк спектър от щамове на грипен вирус е демонстрирана в животински модели 148 . Тази защита обаче произтича от ефекторните функции на Fc и не е установен стабилен имунен корел на защита149, което прави количественото определяне на имунитета, базиран на M2e, предизвикателство и ограничава измерването на ефикасността на ваксината до големи полеви изпитания. Пасивно прехвърлено човешко моноклонално антитяло към M2e наистина намали вирусния товар в модел на заразяване с човешки грип 150 . Имунният отговор на M2e може да бъде подобрен с адюванти и във фаза I клинично изпитване, ваксина със слят протеин M2e-flagellin индуцира силни антитела при високи дози, въпреки че профилът на системната реактогенност е неприемлив 146 . Като се има предвид, че M2e е сравнително малък протеин и са идентифицирани вирусни избягали мутанти, по-вероятно е ваксина на базата на M2e да се използва като допълнение към ваксини на базата на НА, за да осигури допълнителен защитен имунитет, особено когато има несъответствие между ваксината и циркулиращите епидемични щамове 151 .

Нуклеопротеин

Стимулирането на CD4 + и/или CD8 + Т клетъчните отговори, включително набиране на резидентни клетки за памет в интраепителна тъкан на белия дроб 152 или Т фоликуларни помощни клетки, които са от решаващо значение за образуването на зародишния център в лимфния възел 153, може да подобри трайността, ефикасността и широчината на грипа имунитет. Показано е, че както CD4+, така и CD8+ Т клетъчните отговори са свързани с хетеросубтипичен имунитет срещу грип 154,155,156,157,158. Т-клетките са замесени, както директно чрез CD8-медиирана цитотоксичност, така и индиректно чрез CD4 помощ, в широчина на защита при миши 159 и нечовешки примати 160 модели на грипна инфекция. Въпреки че базираният на Т клетки имунитет варира в зависимост от HLA типа и все още не е установен абсолютен корел на защита, проучвания при хора свързват по-голям брой кръстосано реактивни Т клетки със защита от грипна инфекция 161,162. NP е вътрешен протеин, запазен в щамовете на грип А, който е идентифициран като цел на Т-клетъчния имунитет и е изследван в ранна фаза на клинични проучвания. MVA-векторна NP + M1 ваксина индуцира CD4 + и CD8 + Т клетъчни отговори, открити чрез интерферон-γ (IFNγ) ензим-свързан имуноспот, при по-млади и по-възрастни кохорти (Таблица 2). Тази ваксина също подобрява Т-клетъчните и специфичните за щама антитела, когато се използва заедно със сезонни ваксини 163,164. При предизвикателство срещу грип, MVA NP + M1-ваксинирани индивиди имат по-ниски резултати от симптомите в сравнение с неваксинираните контроли, въпреки че броят на изследваните индивиди е малък 66,165. Както в гореспоменатите проучвания, е установено, че ваксинните платформи с вирусен вектор и базирани на нуклеинова киселина предизвикват подобрени Т-клетъчни отговори в сравнение с традиционните инактивирани противогрипни ваксини при животински модели и при предизвикателство за човешки грипен вирус 59,60,166 и такива алтернативни платформи може да се изисква за универсална ваксина за ефективно набиране на Т клетки.


Дискусия

За първи път генерирахме специфични за свинския грип mAbs от белодробните дрениращи лимфни възли на прасета, заразени с H1N1pdm09. Антителата са главно срещу главата на НА и са насочени към два основни имунодоминантни епитопа – Sa мястото (остатъци 160 и 163) и Ca мястото (остатък 130), също разпознати от хората. Неутрализиращата активност на тези mAbs от прасета е сравнима с най-силните човешки mAbs. Избраното mAb, pb27, намалява вирусното натоварване и патологията след приложение при 10 mg/kg, което води до устойчива серумна концентрация от 100 μg/ml с приблизително три log по-малко в BAL. Натоварването с вируса на белия дроб и BAL беше премахнато и белодробната патология елиминирана с доза от 10 mg/kg. Изливането на носа, макар и намалено, не беше елиминирано.

Въпреки че наскоро бяха генерирани свински mAbs срещу епидемична диария по свинете, класическа чума по свинете и вируси на репродуктивен и респираторен синдром, тук показваме, че свинските mAbs могат да бъдат произведени с висока ефективност, използвайки дрениращи лимфни възли, а не кръв [9–11]. Открихме много ниска честота на HA специфични В-клетки в кръвта, но много по-висока честота в локалните белодробни тъкани и сливиците. Достъпът до дрениращи възли (чрез иглена биопсия), сливици и BAL със сигурност е възможен при хора или други големи животни и може да повиши ефективността на генериране на mAbs срещу различни болестни агенти.

Репертоарът от IGLV и IGKV генни сегменти на нашите mAbs, както се очаква за прасета, няма видимо отклонение в употребата [25,26]. Интересно е да се отбележи, че най-дългите IGH вериги са склонни да се сдвояват с IGL, докато най-късите IGH вериги са склонни да се сдвояват с IGK. Също така, IGL веригите са склонни да се сдвояват с IGH вериги, съдържащи двойна Cys (така че вероятно дисулфидна връзка) в CDRH3. От еволюционна гледна точка е интересно да се отбележи, че говедата почти изключително използват IGL и имат по-дълги от обикновено CDRH3, богати на цистеини [34,35]. Въпреки това, сравнително малко клонинги бяха анализирани в настоящото проучване (n = 45) и е необходима бъдеща работа, за да се определи дали това явление остава вярно за по-голям брой клонинги в целия репертоар на свине.

Ние показахме, че силно неутрализиращо моноклонално антитяло 2-12C срещу главата на HA, прилагано профилактично (при 15 mg/kg) на прасета, намалява вирусното натоварване и белодробната патология след заразяване с грип H1N1pdm09 в краткосрочен експеримент [23]. Въпреки това, по-дългите терапевтични експерименти се сблъскват с проблема с реакциите на античовешки антитела. Използването на mAbs от свине ще заобиколи тази трудност. Въпреки че все още не сме измерили фармакокинетичните свойства на свинските моноклонални антитела, тяхната наличност ще позволи изследване как да се използват оптимално mAbs за предотвратяване или лечение на заболяване. Интересно е, че pb27, свинско IgG1 mAb, не премахва отделянето на вируса в назалните тампони. Може да се окаже, че различен IgG подклас или локално приложение в дихателните пътища ще бъде по-ефективно за потискане на назалното отделяне.

В нашия експеримент pb27 беше даден 24 часа преди заразяването с вируса, докато при хора mAbs вероятно ще бъдат дадени след инфекцията. Ще са необходими допълнителни експерименти, за да се определи ефикасността на mAb терапията след инфекция в модела на свине. Моделът на свински грип може също да се използва за оценка на платформите за доставяне на антитела, ефекта на IgA и различни IgG подкласове и ролята на медиираните от Fc функции. По-специално, тъй като неутрализиращи стволови свързващи антитела са били преди това замесени в засилено заболяване в модела на прасета, ще бъде важно да се оцени in vivo ефект на анти-стволовото mAb pb29, което ще подобри нашето разбиране за Fc медиираната функция в този важен модел на естествен гостоприемник [36].

Всички наши mAbs са IgG1, докато при прасета са докладвани 6 различни IgG подкласа – IgG1, IgG3, IgG5a, IgG5b, IgG6a и IgG6b [37]. Няма информация за тяхната Fc функция и няма налични подкласови специфични анти-имуноглобулинови антитела поради ниското пазарно търсене. Смята се, че IgG3 е наследствената последователност и анализът предвижда, че съдържа мотиви, които вероятно ще позволят активиране на комплемента и свързване с IgG транспортния рецептор FcRn [37]. Без допълнителен анализ не можем да изключим възможността други подкласове да бъдат индуцирани и не знаем дали IgG1 е преобладаващият отговор на грипната инфекция. Ясно е, че високите свързващи вещества на IgG1 медиират CDC и ADCC, докато за разлика от това предполагаемият анти-стволов pb29 не успява да медиира нито CDC, нито ADCC. Допълнителни изследвания ще определят дали други анти-стволови антитела и други IgG подкласове могат да изпълняват медиирани от Fc функции.

Специфичността на mAbs от прасета е много подобна на човешките mAbs, за които е известно, че са насочени към H1N1pdm09 HA. Те разпознават двете основни места Sa (остатъци 160 и 163) и Ca (остатък 130). През 2014 г. вирусите H1N1pdm09 придобиха антигенен дрейф чрез заместване в позиция K163. Въпреки това, антисерумите на порове, използвани за наблюдение на вирусите, не успяха да открият тази антигенна промяна [31,38,39]. Докато H1N1pdm09 произхожда от свине, е необходим допълнителен анализ, за ​​да се потвърди дали специфичността на реакцията на антителата при прасетата ще бъде подобна на тази при хората за сезонни грипни вируси, които се възпроизвеждат слабо и се нуждаят от адаптация, за да причинят инфекция при прасетата. Въпреки това ние показахме, че четиривалентен сезонен LAIV, адаптиран към студа при хора 2017–2018 г., може да предизвика имунни отговори при прасета, че е имало репликация на H3N2 компонента на ваксината в назални тампони и по-силен имунен отговор към H3N2 в сравнение с компонента H1N1 [40]. Освен това, 4 от 6 прасета са били заразени с A/Hong Kong/4801/2014 (H3N2) и са се отделили от вируса, макар и на по-ниско ниво и за по-кратко време в сравнение с H1N1pdm09 [40].

Като цяло, нашите резултати показват, че прасето е отличен модел за разбиране как най-добре да се прилагат mAbs като терапия при хора и тъй като прасетата изглежда дават отговор на антитела, подобен на този на хората, свинските антисеруми може да са по-добър заместител от антисерумите за порове на откриване на антигенен дрейф на грипа и по този начин информиране за препоръките за ваксини за хора.


Резултати

Анализ на последователността

Извършен е цялостен анализ на HA протеинова последователност, като се използват последователности от H1, H2, H3 и H5 подтипове на грип А, които са налични в базата данни NCBI, за идентифициране на всички неизменни региони. Анализът беше извършен първо на две стъпки, бяха генерирани индивидуални профили от всеки подтип и след това всеки профил беше подравнен с H2 профила, за да се получат най-значимите подравнявания. Графиките на корелация на H2 с други подтипове отразяват, че подтиповете H2 и H5 и H2 и H1 са очевидно по-сходни от двойката H2-H3 (Фигура 1). Двойките H2-H5 и H2-H1 имат корелационни резултати, вариращи от 0,8-1,0 за 66% и 56% от аминокиселинните остатъци в HA1, съответно. Въпреки това, корелационен резултат от 0,8–1,0 се наблюдава само за 33% от остатъците в двойката H2-H3. Подобни резултати са докладвани по-рано от Nobusawa et.al. [18], който показа, че подтип H1 показва 58,7% и 55,7% идентичност на субединицата HA1 с HA1 съответно в подтиповете H2 и H5 и най-малко идентичност с подтипа H3 (35,2%).

Показана е корелация на H2-H5, H2-H3 и H2-H1 в HA1 домейна. В този анализ се проследява номерирането на остатъците от Н3.

Данните за подравняване на последователността бяха разпределени в два компонента: остатъци с резултат за запазване от 0,9–1,0 се считат за запазени остатъци и региони, съдържащи 6 остатъци или повече, където повече от 50% остатъци имат резултат за запазване от 0,9–1,0 бяха групирани като запазени региони . Използвайки тези критерии, очаквахме да пропуснем някои важни отделни аминокиселинни позиции и конформационни епитопи, но да идентифицираме региони, подходящи за антивирусни/пептидни терапии. Тези данни ясно идентифицираха деветте най-запазени области във всички подтипове, както е показано в Таблици 1 и 2. Резултатът за запазване на всеки променлив остатък в рамките на идентифицирания запазен регион беше изобразен в скоби, ако вариацията е резултат от подобен остатък, който няма да доведе до промяна в заряд/хидрофобност. Окончателното запазване на всяка позиция в избраните запазени региони е по-високо, отколкото изглежда в Таблици 1 и 2, тъй като вариацията в избраните региони между подтиповете често води до подобни замествания.

Ние заключихме, че въпреки големите разлики в подтиповете, има области с ниска вариабилност, които биха могли да бъдат основни цели за антипептидни/антивирусни отговори.

Структурен анализ

Насочването на антивирусни агенти/антитела към специфични региони на протеина е сложно и не напълно разбрано. Понастоящем няма ефективен метод за прогнозиране на епитопната структура на патогена и насочване на отговора на антитялото към предварително определени региони, използвайки протеин като антиген. Въпреки това, има доказателства, че къси пептиди с предварително определена специфичност на последователността могат да се използват за повишаване на анти-пептидни антитела, които разпознават пептид-специфична област на протеина [19], [20] и моноклоналните антитела, създадени срещу синтетични пептиди, могат да кръстосват реагират с непокътната протеинова молекула [21]. По-голямата част от литературата предполага, че не всички региони на протеина кръстосано реагират със синтетични пептидни антитела и редица структурни параметри като повърхностна експозиция [22], [23], хидрофилност и вид на остатъка [17], влияят на тази склонност. Следователно, горните параметри бяха оценени на всяко от деветте идентифицирани места, за да се предвиди тяхната достъпност до антипептидни антитела.

Структурата на НА на грипен вирус А (подтип H3) щам A/Aichi/2/68 е определена от Wilson et al., 1981 [24] и впоследствие проучванията на вариантни вируси позволяват картографиране на антигенни места върху протеина (прегледано в справка 10). Съвсем наскоро бяха решени структури на HA вируса на грип А за три допълнителни подтипа: H1 [25], [26], H5 [27] и H9 [28]. Избрахме структурата на H3 (PDB: 1HGJ) за нашия анализ, за ​​да се придържаме към номерирането, използвано в анализа на последователността.

Позицията на девет идентифицирани области беше картографирана върху 3-D структурата на HA мономера и показана на фигура 2А като лентов модел. Всеки идентифициран регион също беше увеличен, за да изобрази детайлите на 3-D структурата (Фигура 2В). Всички идентифицирани места 1–9 бяха оцветени в червено (Фигура 2В) и техните вторични структурни детайли, стойност на хидрофобност и повърхностна площ, достъпна за разтворители, бяха представени в таблица (Таблица 3). Място 1 присъства в N-края на HA1. Това място съдържа запазения цистеинов остатък, който образува дисулфидна връзка с HA2 [10]. Мястото съществува като бримка върху HA мономера с голяма повърхност, достъпна за разтворители. Място 2 и място 7 имаха малко остатъци, които образуваха част от известните места за свързване на антитяло E и C съответно [10]. Място 2 е предимно α-спирално, докато място 7 има предимно β-структура. И двете тези места имат малки повърхностни площи, достъпни за разтворители и могат да бъдат недостъпни/заровени в мономера.

(А) Позицията на запазените региони беше изобразена върху HA мономера, показана като модел на плоска лента. Кристалната структура на подтип H3 (PDB: 1HGJ) беше използвана за картиране на идентифицираните запазени региони (оцветени в червено). (Б) Запазените региони, показани на фигура 2А, бяха увеличени, за да се изобразят детайлите на 3-D структурата.

Място 3 се състои както от α-спирална област, така и от бримка с голяма повърхност, достъпна за разтворители, подобно на място 1. Този регион е силно хидрофилен и е доказано, че е имунодоминантен при предизвикване на антитела срещу синтетичен пептид [29 ], [30]. Този регион обаче не образува част от известно място за свързване на антитяло, което показва, че в разтвор този регион може да придобие някаква конформация, която е достъпна само за пептидни антитела.

Места 4 и 6 присъстват главно като β-лист и изглежда са скрити в мономера. Място 8 и място 9 бяха открити в С-края на HA1 и бяха главно бримки с голяма повърхност, достъпна за разтворители, и висока хидрофилност. Доказано е също, че място 9 предизвиква неутрализиращ отговор на антитела срещу множество подтипове НА [31].

Тази работа не идентифицира отделно мястото на свързване на рецептора, но някои от запазените остатъци на мястото на свързване са разположени в места 3, 4 и 5. Тази липса на специфична идентификация може да се дължи на факта, че мястото на свързване на рецептора се състои от остатъци, които не са съседни в протеиновата 3-D структура и няколко от остатъците не са запазени [18].

Широко кръстосано реактивен отговор на антитяло е по-вероятен, ако деветте идентифицирани места са приели подобни конформационни структури в подтипове H1, H2 и H5, като тези в подтип H3. За да тестваме това, ние оценихме структурата на идентифицираните сайтове, използвайки структурата H1 (PDB: 1RVZ). Избрахме структурата на H1 самостоятелно поради висока степен на сходство на последователността между подтиповете H1, H2 и H5. В допълнение към сходството на последователностите, деветте места имат висока степен на запазване на структурата, с подобна повърхност, достъпна за разтворители, и вторична структура (Таблица 3). Някои малки разлики във вторичната структура се наблюдават на места 3, 6 и 7. Хидрофобната/хидрофилната природа на местата също остава непроменена, с изключение на място 9, което има повишена хидрофобност в структурата на H1. За да се идентифицират места, които имат висок потенциал за генериране на антипептиден отговор, местата се класират въз основа на тяхната достъпна за разтворител повърхност и хидрофобност. Хидрофилните места бяха избрани и класирани на първо място според тяхната повърхност, достъпна за разтворители, последвани от хидрофобните места (Таблица 3).

Пет (1, 3, 5, 8, 9) от деветте идентифицирани неизменни области имаха високо ниво на запазване на структурата между подтиповете, подходяща вторична структура и значително голяма повърхност, достъпна за разтворители, за насочване към антипептид/антивирусно средство отговор.


Текущи предизвикателства пред производството и ефективното използване на ваксини

Най-голямото предизвикателство за производството на ваксини както за животински, така и за човешки грип е високата вариабилност и бързата еволюция на вируса, което води до постоянно преследване на вируса на ваксината, за да съответства на циркулиращите щамове. В резултат на това настоящите програми за ваксини зависят от задълбочено наблюдение в глобален мащаб за човешките ваксини и в регионален/локален мащаб за ваксините за животни. Тъй като няма стандартизирани програми за подбор на ваксини във ветеринарната област, ваксинните щамове често са несъответстващи и предлагат неоптимална защита, която може да насърчи, а не да спре разпространението на полеви щамове. Освен това, прасета, ваксинирани с адювант IIV и след това заразени с хетероложен вирус от същия подтип, могат да покажат засилена респираторна патология поради силно стимулиране на отговора на неутрализиращи антитела, наречено засилено респираторно заболяване, свързано с ваксината (VAERD Gauger et al., 2011) . Освен това, неоптималната ваксина може да доведе до избягали мутанти, които ще представляват повишена заплаха за наивните популации.

Друга пречка за ефективна ваксина е времевият график, необходим за производството на ваксината и разпоредбите за одобрение. Графикът за събиране на данни от наблюдение за човешкия грип се опитва да включи пика на текущия сезон и да увеличи шансовете за правилна прогноза кои вируси е най-вероятно да циркулират през следващия сезон. Въпреки това, тъй като производителите трябва да отделят достатъчно време за производството, за да отчетат възможните закъснения, това не винаги е така и в някои случаи разпространението и антигенният състав на циркулиращите вируси в края на сезона се различават от избрания ваксинален щам, който може да доведе до несъответствие. От подбора на щамове до разпространението на ваксината отнема най-малко 6 месеца, без да се вземат предвид възможни пречки като пречки за доставка на яйца или проблеми при спазване на изискванията за биобезопасност и стабилност. Що се отнася до ваксините за животни, щамовете не се актуализират толкова често и процесът на лицензиране на актуализирани или нови продукти може да отнеме дори повече време, отколкото за човешките ваксини. Последните промени, въведени от Центъра за ветеринарни биологични продукти на USDA, сега позволяват на производителите да променят или заменят щамове по съществуващ лиценз, без да се налага да преминават през изцяло нов процес на лицензиране (Center for Veterinary Biologics, 2007), което представлява напредък по пътя към напредъка програми за ваксини.

Присъщите вариации в имунния статус на дадена популация също са основен фактор, влияещ върху безопасността и ефикасността на ваксината. Например, високорискови групи, като възрастни хора или хора с отслабен имунитет, може да не реагират оптимално на ваксинация поради намалена имунна функция (Kunisaki and Janoff, 2009 Lambert et al., 2012). Предишният имунитет на индивида може да окаже голямо влияние върху отговорите на ваксината. Добре прието е, че първата имунологична среща с грип, било чрез естествена инфекция, или чрез ваксинация, ще формира бъдещи реакции в живота на индивида, процес, често наричан първороден антигенен грях а напоследък като антигенно отпечатване. Получените вторични експозиции са склонни да засилят отговора на антитялото към първоначалната експозиция в пълно или частично увреждане на имунологичния отговор срещу новия щам, процес, известен като или засилване на гърба (Fazekas de St and Webster, 1966 Ma et al., 2011 Fonville et al., 2014).

В системите за производство на свине и домашни птици, майчините антитела при млади животни могат да попречат на активния имунен отговор към ваксината в зависимост от възрастта при ваксинация (Loeffen et al., 2003 De Vriese et al., 2010). Други пречки за прилагането на програми за ваксинация при селскостопански животни са разходите, прекомерният карентен период след ваксинацията, трудността за разграничаване на ваксинираните от заразените животни и маскирането на клиничните признаци, които могат да доведат до търговски ограничения (Spackman and Pantin-Jackwood, 2014 г. ).


Заключителни бележки

Описахме дизайна и характеризирането на серия от разтворими HA имуногени, съставени единствено от HA стъблото. Въпреки че всички избрани мини-HAs предизвикват сравними нива на антитела към FL HA, широчината и защитната способност на предизвиканите антитела прогресивно се увеличават със структурната еволюция на мини-HA конфигурацията. Последният кандидат - стабилизиран тримерен mini-HA #4900 - демонстрира уникалната си способност да предизвиква широк и защитен имунен отговор при мишки и нечовекоподобни примати. Докладвано е (42, 43), че стабилизирането на антигена на респираторния синцитиален вирус F подобрява имунния отговор и защитата. Нашите резултати показват, че същият принцип важи за грипна НА и осигуряват по-нататъшна насока за проектиране на базирана на епитоп, универсална противогрипна ваксина.


Гледай видеото: Грипп непредсказуемая угроза (Декември 2022).