Информация

6.3: Ауксотрофи и селективни среди - Биология

6.3: Ауксотрофи и селективни среди - Биология


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

В срещна мутантите са Met ауксотрофи, което означава, че те не могат да растат в среда, която не съдържа Met. Например, тъй като щамът BY4742 носи мутации в HIS3, LEU2, LYS2 и URA3 гени, щамът ще расте само в среда, съдържаща хистидин, левцин, лизин и урацил. Плазмидите, използвани за трансформация, носят функционални алели на ген, който е дефектен в щама гостоприемник, което прави възможно да се подбират трансформанти по способността им да растат върху среда, в която липсва основното хранително вещество.

Синтетичните среди са основен инструмент за култивиране и изучаване на ауксотрофи, тъй като всички компоненти са дефинирани. Изследователите на дрожди са разработили разнообразие от различни формулировки за синтетични среди. Всички синтетични среди съдържат източник на въглерод (обикновено D-глюкоза), източник на азот и основни витамини и минерали. Витамините и минералите обикновено се купуват
във формулировка, известна като дрождена азотна основа (YNB). Добавките, добавени към синтетичната среда, могат да бъдат пригодени да поддържат или избират срещу растежа на определени генотипове. В този курс ще използваме среда Yeast Complete (YC), която поддържа растежа на повечето С. cerevisiaeщамове. Скоростта на растеж на дивия тип щамове в YC е малко по-бавна от тази в богати среди като YPD, но щамовете са жизнеспособни за дълги периоди от време. Таблицата на следващата страница показва състава на YC, който включва богат запас от аминокиселини и нуклеотидни бази. В допълнение към пълната YC среда, ще използваме и селективна среда, в която някои от компонентите са пропуснати. Например, в тази лаборатория ще използваме YC-Met „отпадаща“ среда, която съдържа всички YC компоненти в следващата таблица, с изключение на метионин.

*YNB е сложна смес от витамини, минерали и соли. Крайни концентрации в YC: Витамини (μg/литър): биотин (2), калциев пантотенат (400), фолиева киселина (2), инозитол (2000), ниацин (400), р-аминобензоена киселина (200), пиридоксин хидрохлорид (400), рибофлавин (200), тиамин хидрохлорид (400 ).
Минерали (μg/литър): борна киселина (500), меден сулфат (40), калиев йодид (100), железен хлорид (200), манганов сулфат (400), натриев молибдат (200), цинков сулфат (400).
Соли (мг/литър): калиев фосфат едноосновен (1000), магнезиев сулфат (500), натриев хлорид (100), калциев хлорид (100).
(Източник: labs.fhcrc.org/gottschling/Ye...tocols/yc.html)


Въведение в дрождовата среда

Дрождите са еукариотни микроорганизми, чиито геноми са изчерпателно проучени и някои са секвенирани. Те са относително лесни за отглеждане в лабораторни условия. Освен това, въпреки малкия си размер на генома, те показват клетъчни характеристики и процеси, които са силно запазени сред повечето еукариоти. Например, те имат мембранно-свързани органели, цитоскелет, ядрена ДНК и механизми на транскрипция, които са подобни на тези, открити при висшите еукариоти. Освен това, дрождите имат много добре характеризирани секреторни протеини и феромони. Няколко гена на дрожди, участващи в обработката и секрецията на протеаза, също са идентифицирани. По този начин дрождите могат да се използват за няколко изследвания на еукариотни гени и протеини с помощта на подходящи инструменти за молекулярна биология. Някои приложения за дрождени култури включват синтез на протеинови експресионни системи, изследване на специфични генни или протеинови функции и анализи на нови протеинови взаимодействия. Използват се и за много промишлени приложения като ферментация, печене и биоремедиация.

Медиите за култура на дрожди играят значителна роля в подпомагането на растежа както за малки, така и за големи цели. Обикновено културалната среда на дрожди включва пептон, екстракт от дрожди и декстроза или глюкоза. Дори малки разлики в състава на средата могат да дадат дрожди с различни характеристики на растеж.


Генерирани от Cas9 ауксотрофи на Phaeodactylum tricornutum се характеризират с малки и големи делеции, които могат да бъдат допълнени от плазмидни гени

Моделът на диатомеята Phaeodactylum tricornutum е атрактивен кандидат за приложения по синтетична биология. Развитие на ауксотрофни щамове на P. tricornutum ще осигури алтернативни селективни маркери за често използвани гени за резистентност към антибиотици. Тук, използвайки CRISPR/Cas9, ние показваме успешно редактиране на гени в биосинтетичните пътища на урацил, хистидин и триптофан. Събитията на редактиране се характеризират със загуба на хетерозиготност и с появата на големи делеции до

2,7-kb центрирано в сайта за редактиране. Фенотиповете, изискващи урацил и хистидин, могат да бъдат допълнени от базирани на плазми копия на интактните гени след втвърдяване на Cas9-редактиращия плазмид. Растежът на урацилови ауксотрофи върху среда, допълнена с 5-FOA и урацил, води до загуба на допълващия плазмид, осигурявайки лесен метод за втвърдяване на плазмиди с потенциални приложения в щамово инженерство и CRISPR редактиране. Метаболомната характеристика на урацилови ауксотрофи разкрива промени в концентрациите на клетъчния оротат, съответстващи на частична или пълна загуба на активността на оротат фосфорибозил трансфераза в нокаут щамове. Нашите резултати разширяват обхвата на P. tricornutum ауксотрофни щамове и демонстрират, че ауксотрофните маркери за допълване осигуряват жизнеспособна алтернатива на традиционно използваните маркери за селекция на антибиотици. Базираните на плазмиди ауксотрофни маркери трябва да разширят обхвата на приложенията за геномно инженерство и да осигурят средство за биозадържане на проектирани P. tricornutum щамове.


Резултати

Идентифициране на цели Cas9 в гените на биосинтетичния път

Разгледахме прогнозите на KEGG 23,24 въз основа на геномната последователност на P. tricornutum за идентифициране на гени в биосинтетичните пътища на урацил и хистидин за редактиране на Cas9. Ние се фокусирахме върху тези два пътя като ауксотрофия на урацил и хистидин, а стратегиите за контраселекция обикновено се използват в други моделни организми. Този подход идентифицира по-рано описания бифункционален ген PtUMPS, за който се предвижда да катализира две стъпки в пътя на урацила - превръщане на оротат в оротидин монофосфат (OMP) и превръщане на OMP в уридин монофосфат (UMP) (фиг. 1A, допълнителна фиг. S1) 22 . Идентифицирани са също протеини, които са ортолози на характеризирани ензими, участващи в биосинтеза на хистидин (фиг. 2А, допълнителна фигура S2). Генът PHATR_3140, наричан по-долу PtPRA-PH/CH, кодира предвиден бифункционален протеин, който споделя сходство на последователността с бактериалния протеин HisIE и неговия растителен аналог HISN2 25,26. Тези протеини притежават два функционални домена, които са хомоложни съответно на ензимите фосфорибозил-АТФ пирофосфохидролаза (PRA-PH) и фосфорибозил-АМР циклохидролаза (PRA-CH). Предполага се, че PRA-PH и PRA-CH, самостоятелно или като бифункционален протеин, катализират две последователни стъпки, които се появяват рано в пътя на биосинтеза на хистидин (фиг. 2А, допълнителна фигура S2). Установено е, че генът PtIGPS, кодиращ имидазол глицерол фосфат синтаза (хомолог на HIS3), е дублиран ген в P. tricornutum сглобяване на генома и по този начин не е приоритизиран като цел на Cas9.

Ние също така идентифицирахме гена PtI3GPS-PRAI като потенциална цел, тъй като той кодира предвиден бифункционален ензим, който е сливане на индол-3-глицерол-фосфат синтаза (I3GPS) и фосфорибозилантранилат изомераза (PRAI) и би катализирал две последователни стъпки в пътя на биосинтеза на триптофан (допълнителна фигура S3).

CRISPR генерирани нокаути в прогнозирания P. tricornutum път на биосинтеза на урацил. (А) Част от предвиденото P. tricornutum път на биосинтеза за превръщане на въглеродна киселина в урацил и уридин трифосфат, като ензимът PtUMPS е подчертан в синьо. Конкурентният инхибитор, 5-флуороротова киселина (5-FOA), е показан в пунктирана кутия на мястото, където навлиза в пътя. Съкратените наименования на молекули и ензими са посочени в скоби, а предсказаните съответстващи P. tricornutum имената на гените са посочени в квадратни скоби. (Б) Примерно изображение на T7EI анализ за редактиране за скрининг на конюганти за потенциални събития на редактиране в гена PtUMPS. Субстратът показва PtUMPS генни фрагменти, амплифицирани от PCR, докато продуктът Т7 показва конюганти с доказателства за редактиране на Cas9. WT, див тип P. tricornutum геномна ДНК, използвана в анализа за редактиране на T7EI. M, 100 bp стълба с размери, посочени в базови двойки (bp). Това изображение беше изрязано от по-голямо изображение (допълнителна фигура S10). (° С) Пример за фенотипен скрининг на един PtUMPS нокаут щам ((Delta) UMPS2), поставен върху L1 самостоятелно или L1, допълнен с урацил при посоченото разреждане на първоначалната концентрация. (д) Пример за скрининг за загуба на резистентния на зеоцин Cas9 редактиращ плазмид в (Delta) UMPS2 нокаут щам чрез посяване върху L1, допълнен с урацил или L1, допълнен с урацил и зеоцин. (Е) Следи от секвениране на Sanger от характеризирани нокаути на PtUMPS с позицията (под следата) и типа на вмъкване или изтриване (над следата), посочени за всеки алел от трите щама. (Ф) Графична карта на позицията и степента на индели за всеки от трите PtUMPS нокаута спрямо дивия тип UMPS ген (показан отгоре). Червените правоъгълници показват нуклеотидни делеции, зелените триъгълници показват нуклеотидни вмъквания, жълтите и сините правоъгълници на WT гена показват позицията на PtUMPS активните места (оротат фосфорибозил трансфераза и оротидин-5'-фосфат декарбоксилаза) и белите правоъгълници представляват интрони.

За да потвърдим геномните целеви места, ние PCR-амплифицирахме и секвенирахме PtUMPS и PtPRA-PH/CH гените на P. tricornutum Щам CCAP 1055/1, използван в нашата лаборатория. Идентифицирани са два различни алела както за PtUMPS, така и за PtPRA-PH/CH гените. Седем еднонуклеотидни полиморфизма (SNPs) в алелите PtUMPS водят до аминокиселинни замествания, които диференцират двата алела един от друг и от публикуваните P. tricornutum геном (допълнителна таблица S1). Всички замествания са разположени в незапазени региони на протеина PtUMPS (допълнителна фигура S4). По подобен начин е идентифицирана мутация от A до G в базова позиция 1205 в алел 2 на гена PtPRA-PH/CH (допълнителна таблица S1). Тази трансверсия превръща силно запазен глутамат в глицин в каталитичния сайт на PRA-PH домейна. Влиянието на тези замествания върху функцията PtUMPS и PtPRA-PH/CH не е известно.

CRISPR генерирани нокаути в прогнозирания P. tricornutum път на биосинтеза на хистидин. (А) Част от предвидения път на биосинтеза за превръщане на рибоза-5-фосфат в l-хистидин, с бифункционалния PtPRA-PH/CH ензим, подчертан в синьо. Съкратените имена за всеки ензим са посочени в скоби, а предвидените съответстват P. tricornutum имената на гените са посочени в квадратни скоби. (Б) Примерно изображение на T7EI анализ за редактиране за скрининг на конюганти за потенциални събития на редактиране в гена PtPRA-PH/CH. Субстратът показва PtPRA-PH/CH генни фрагменти, амплифицирани от PCR, докато продуктът Т7 показва ексконюганти с доказателства за редактиране на Cas9. WT, див тип P. tricornutum геномна ДНК, използвана в анализа за редактиране на T7EI. M, 1 kb стълба с размери, посочени в базови двойки (bp). Това изображение беше изрязано от по-голямо изображение (допълнителна фигура S11). (° С) Пример за фенотипен скрининг на един PtPRA-PH/CH нокаут щам ((Delta) PtPRAPHCH1), трансформиран със или без допълващия PRA-PH/CH плазмид (pPtPRAPHCH) само върху твърда среда L1 или L1, допълнен с хистидин при посочено разреждане на първоначалната концентрация. WT, див тип P. tricornutum щам. (д) Следи от секвениране на Sanger от характеризирани PtPRA-PH/CH нокаути с позицията (под следата) и типа на вмъкване или изтриване (над следата), посочени за всеки алел. (Е) Графична карта на позицията и степента на инделите за PtPRA-PH/CH нокаут спрямо дивия тип PtPRA-PH/CH ген (показан отгоре). Червените правоъгълници показват нуклеотидни делеции, докато жълтите и сините правоъгълници на WT гена показват позицията на PRA-PH и PRA-CH активните места.

Cas9 и TevCas9 редактирането на ауксотрофни гени се характеризира със загуба на хетерозиготност

За генериране на нокаути в биосинтетичните гени на урацил и хистидин, ние проектирахме и клонирахме индивидуално Cas9 и TevCas9 единични водещи РНК (sgRNAs) срещу различни места в гените PtUMPS, PtPRA-PH/CH и PtI3GPS-PRAI (Таблица 1, допълнителна фигура S55). –S7). TevCas9 нуклеазата е двойна нуклеаза, която генерира делеция на 33–38 базови двойки между I-TevI ​​(Tev) и Cas9 изрязани места 27 . Изискванията за насочване за нуклеаза TevCas9 са мотив за разцепване на I-TevI ​​5 (^prime) -CNNNG-3 (^prime), разположен (sim) 15–18 базови двойки нагоре от 5 (^prime) край на sgRNA свързващото място. В тях бяха преместени редактиращите плазмиди Cas9 или TevCas9 P. tricornutum чрез бактериална конюгация и конюганти, избрани върху среда, съдържаща зеоцин.

Първо оценихме редактирането чрез скрининг P. tricornutum ексконюганти чрез Т7 ендонуклеаза I (T7EI) анализи за несъответствие на разцепване върху PCR продукти, амплифицирани от всеки целеви ген (фиг. 1В, 2В, таблица 1). Този анализ идентифицира 6 sgRNA с откриваеми скорости на редактиране въз основа на скрининг на ексконюганти. Колониите, които показаха редактиране, се разреждат, поставят се за получаване на субклони и впоследствие се изследват за съответния ауксотрофен фенотип върху твърда среда със и без ауксотрофна добавка (урацил или хистидин) (фиг. 1С, 2С). За да се излекуват Cas9-редактиращите плазмиди, нокаут щамовете се отглеждат без селекция на зеоцин в продължение на 1 седмица и се поставят разреждания за получаване на единични колонии. Колониите се нанасят на ивици върху L1 плаки със и без зеоцин за скрининг за загуба на плазмид. Представително изображение, демонстриращо чувствителност към зеоцин поради загуба на Cas9-редактиращия плазмид, е показано на фиг. 1D. За нокаут на гена PtUMPS, ние допълнително характеризирахме 3 субклона с фенотип, изискващ урацил, за да определим дали нокаутите са моноалелни или биалелни. Тъй като двата алела PtUMPS на P. tricornutum притежавали SNPs един спрямо друг, ние успяхме да картографираме алел-специфични събития за редактиране (фиг. 1E, F). Два от щамовете, (Delta) UMPS1 и (Delta) UMPS2, бяха биалелни и показаха загуба на хетерозиготност, като единият алел притежава малка делеция (< 20 bps), а другият алел притежава голяма делеция (> 610 bp). Третият характеризиран субклон, (Delta) UMPS3, е моноалелен и притежава хомозиготна 1-bp инсерция. За PtPRA-PH/CH нокаутите, които генерират фенотип, изискващ хистидин (фиг. 2B,C), целевото секвениране на един субклон разкрива биалелен генотип с делеция от 11 bp в единия алел и делеция от 6 bp във втория алел (фиг. 2D,E).

Големи изтривания в редактирани P. tricornutum метаболитни гени, уловени чрез секвениране на ампликон на Nanopore. За всеки (АЕ), са посочени името на целевия ген, както и редактиращият ензим. В най-ляво графиката показва нормализирано покритие на четене, осреднено за 5-bp прозорец за редактираната проба (черни точки) и пробата от див тип (оранжеви точки) спрямо позицията в PCR ампликона. Номерирането по оста x е относително към стартовия кодон ATG за всеки ген, като последователността нагоре по веригата е обозначена със символ минус (-), а последователността надолу по веригата е обозначена със символ плюс (+). Зелената вертикална линия показва мястото на разцепване на Cas9 или TevCas9, докато защрихованият правоъгълник показва ORF. В среден графика е графика на плътност на изтривания > 50-bp. В най-дясно графиката показва дължината и позицията на делециите > 50-bp спрямо тяхната позиция в PCR ампликона, с номериране на оста x, както в най-ляво панел. Всяка хоризонтална линия показва картографирано събитие на изтриване. Изтриванията се подреждат от най-дългата към най-малката. Зелената линия показва мястото на разцепване на Cas9 или TevCas9.

Видовете делеции, наблюдавани в урацил- и хистидин-ауксотрофите, са в съответствие с хетерогенни събития на редактиране, водещи до загуба на хетерозиготност 28,29,30. За да разширим тези наблюдения, използвахме секвениране на Nanopore, за да оценим по-добре спектъра от големи делеции, които често се пренебрегват в проучванията за редактиране на Cas9. В допълнение към двете sgRNA, които показаха стабилно редактиране на гена PtUMPS, ние изследвахме събития на делеция в ексконюганти с sgRNA, насочени към гена PtUREASE 6 и гена PtI3GPS-PRAI. За всеки експеримент, (sim) 1000 ексконюганта бяха обединени и (sim) 6 kb PCR продукт, генериран за всеки от целевите гени с предвидените Cas9 или TevCas9 целеви места в средата на ампликона. Фокусирахме вниманието си върху делеции > 50 bp, тъй като тези делеции обикновено са недостатъчно докладвани при целевото секвениране на ампликон. Отбелязахме спад в покритието на четене на Nanopore, съсредоточено около предвидените целеви места на sgRNA за продукти, амплифицирани от експерименти за редактиране на Cas9 и TevCas9 (черни точки) в сравнение с покритието за четене за контролни експерименти (оранжеви точки), в съответствие с редактирането на тези места (фиг. 3, наляво панели). Картографирането на началните и крайните точки на изтриването разкри, че повечето изтривания са центрирани върху целевия сайт Cas9 или TevCas9 (фиг. 3, право панели), като делециите се простират до 2700 bp (фиг. 3, център панел). Средната дължина на изтриване за събития за редактиране, изследвани чрез секвениране на Nanopore и > 50 bp, е 1735 ± 719 bp за Cas9 и 2006 ± 633 bp за TevCas9.

Взети заедно, тези данни показват, че Cas9 или TevCas9 редактиране на биосинтетични гени може лесно да генерира P. tricornutum ауксотрофи, които могат да бъдат идентифицирани чрез фенотипни или генетични скрининги. Освен това, нашите данни са съгласни с нарастващия брой доказателства, разкриващи, че редактирането на Cas9 (и редактирането на TevCas9 тук) генерира големи изтривания, които обикновено биха били пропуснати, освен ако стратегиите за скрининг не са изрично проектирани да търсят загуба на хетерозиготност.

Фенотипна и метаболомна характеристика на нокаутите на PtUMPS. (А) Точкови анализи на щамове от див тип (WT), (Delta) UMPS1 и (Delta) UMPS2 само върху твърда среда L1, L1 допълнен с урацил, L1 допълнен с 5-FOA или L1 допълнен и с двете урацил и 5-FOA. Посочените разреждания са по отношение на първоначалната концентрация. (Б) Криви на растеж на течности от див тип (WT), (Delta) UMPS1 и (Delta) UMPS2 щамове в L1 течна среда самостоятелно, или допълнени с урацил или 5-FOA или и двете. Точките от данни са средната стойност на три независими повторения, като лентите за грешки представляват стандартната грешка на средната стойност. (° С) Концентрациите на оротат се измерват чрез LC-MS от култури, отглеждани със и без добавки с урацил. Лентите представляват средни стойности, а лентите за грешки представляват стандартно отклонение за три биологични повторения. Отделните точки от данни са представени като цветни точки. Статистическото ниво на доверие се изчислява чрез едностранен t тест. p < 0,001 е обозначено със звездичка. (д) Лентова графика, показваща процентно задържане на плазмиди в щамовете (Delta) UMPS1 и (Delta) UMPS2, съдържащи различни PtUMPS конструкции след 14 дни израстване. Лентите представляват средното съотношение на колониите върху селективни L1 + нурсеотрицин спрямо неселективни L1 плаки от три независими повторения, като лентите за грешки представляват стандартната грешка на средната стойност.

Фенотипна и метаболомна характеристика на нокаутите на PtUMPS

Два ауксотрофа, изискващи урацил ((Delta) UMPS1 и (Delta) UMPS2) бяха избрани за по-нататъшно характеризиране чрез първо точково поставяне върху L1 среда със и без урацил и 5-FOA (фиг. 4А). Нокаутните щамове на PtUMPS успяха да оцелеят само в присъствието на добавки с урацил. Освен това, нокаутите оцеляха при концентрации на 5-FOA, които напълно инхибираха растежа на див тип P. tricornutum (фиг. 4А). Това е в съответствие с фенотипите, наблюдавани по-рано за P. tricornutum UMPS нокаути 7,22 . Имаше леко предимство на растежа на (Delta) UMPS1 пред (Delta) UMPS2 на среда, допълнена както с 5-FOA, така и с урацил, но не и върху среда, съдържаща само урацил. За да сравним дали наблюдаваните фенотипове са последователни в твърда и течна среда, ние наблюдавахме растежа на тези щамове в продължение на 10 дни в течна среда (фиг. 4В) и установихме, че скоростта на растеж е в съответствие с тези, наблюдавани в твърда среда, като един забележителен разлика (допълнителни фигури. S8, S9, допълнителна таблица S3). Предимството на растежа на (Delta) UMPS1 спрямо (Delta) UMPS2, наблюдавано върху твърда среда, допълнена както с 5-FOA, така и с урацил, не се репликира в течна среда, тъй като времената на генериране за (Delta) UMPS1 и (Delta) UMPS2 бяха много сходни ((sim) 24 и (sim) 22 h, съответно).

За да изследваме въздействието на PtUMPS нокаутите върху метаболизма на урацил, ние извършихме целенасочена метаболомика върху оротат на субстрата на UMPS, използвайки LC-MS в див тип и нокаутни щамове (фиг. 4C). Ние се фокусирахме върху характеризирането на оротатния междинен продукт в пътя на урацила (фиг. 2А, 4С), предвиждайки, че трябва да има увеличение на оротат в нокаутните щамове в сравнение с дивия тип. Не успяхме да открием оротат в щама (Delta) UMPS1 при липса на добавка на урацил (-урацил) или в щама (Delta) UMPS2 в състояние -урацил или +урацил. Наблюдава се (sim) шесткратно повишаване на нивата на клетъчния оротат в дивия тип щам, когато L1 среда е допълнена с урацил (+урацил) в сравнение с минимална L1 среда (-урацил) (фиг. 4C). Интересно е, че когато щамът (Delta) UMPS1 беше отгледан с добавка на урацил, ние открихме оротат на нива, подобни на тези, наблюдавани при дивия тип щам, отглеждан с урацил. Този резултат предполага, че алел 1 в щама с нокаут (Delta) UMPS1 (с 18-bp изтриване в рамката) запазва UMPS активност, която се държи подобно на дивия тип щам. За разлика от това, щамът (Delta) UMPS2 има две изтривания извън рамката, които вероятно премахват ODC и OPRT активността. Предполагаме, че неоткриваемите нива на оротат в щама (Delta) UMPS2 може да се дължи на това, че е отклонен към друг биосинтетичен път.

Плазмидно допълване на ауксотрофите на урацил и хистидин

Плазмидно-базирано допълване на P. tricornutum ауксотрофите биха потвърдили, че събитието за редактиране на Cas9 е причината за ауксотрофния фенотип, както и предоставяне на алтернативи на базираните на антибиотици методи за селекция за поддържане на епизомални вектори. Първо изследвахме комплементацията на фенотипа, изискващ урацил, чрез клониране както на gDNA, така и на cDNA версии на всеки алел PtUMPS с нативния промотор и терминатор в нурсеотрицин-резистентния pPtGE31 експресионен плазмид 6. Тези плазмиди бяха обозначени като pPtUMPSA1, pPtUMPSa2, pPtUMPScA1 и pPtUMPScA2 (допълнителна таблица S3) и бяха преместени в щамовете (Delta) UMPS1 и (Delta) UMPS2 чрез конюгиране. Ексконюгантите се поставят на място върху твърда L1 среда със и без добавка на урацил и 5-FOA (фиг. 4А). Всички комплементирани щамове растат върху минимална L1 среда, докато некомплементираните нокаути не, потвърждавайки експресията на UMPS гена от pPtGE31 плазмида. Никакъв щам не е нараснал само на 5-FOA. Неочаквано някои от комплементираните щамове оцеляха на плочи, допълнени както с 5-FOA, така и с урацил. Например, когато (Delta) UMPS2 се трансформира с някой от плазмидите за комплементация на алел 1 (pPtUMPSA1 и pPtUMPScA1), се наблюдава ясна резистентност към 5-FOA в присъствието на урацил. Фенотипите, наблюдавани върху твърда среда, са в съответствие с тези, наблюдавани, когато щамовете са отглеждани в течна среда с подобна добавка на среда (допълнителни фигури S8, S9).

Фенотипът на растеж на щамовете (Delta) UMPS1 и (Delta) UMPS2 в среда, допълнена с урацил и 5-FOA, може да се обясни с контраселекция срещу плазмида, носещ непокътнат ген PtUMPS, който ще метаболизира 5- FOA до токсичен междинен продукт. По този начин тествахме за загуба на плазмид в комплементираните щамове чрез посяване на щамовете (Delta) UMPS1 и (Delta) UMPS2, носещи различни експресионни плазмиди върху твърд L1 със и без нурсеотрицин след 14 дни растеж. Както е показано на фиг. 4D, задържането на плазмиди, измерено чрез съотношението на колониите върху L1 плюс нурсеотрицин спрямо L1 плочки, е силно намалено при всички щамове, вариращи от (sim) 1 до (sim) 33% . Това наблюдение може да обясни защо колониите лесно се появяват върху L1 среда, допълнена с 5-FOA и урацил, и предполага, че втвърдяването на плазмиди, носещи гена PtUMPS от нокаут щамове на PtUMPS, е прост въпрос на растеж върху подходящата среда.

По същия начин, ние успяхме да допълним фенотипа, изискващ хистидин, чрез клониране на див тип копие на гена PtPRA-PH/CH в експресионен вектор и трансформиране на плазмида в (Delta) PRAPHCH1 щам чрез конюгиране. Щамът (Delta) PRAPHCH1 с допълващия плазмид расте както върху твърда L1 среда със и без добавяне на хистидин, докато щамът (Delta) PRAPHCH1 без допълващия плазмид расте само върху L1 среда с добавка на хистидин (фиг. 2С).


Протокол

1. Подгответе безопасно и стерилно работно място

Запознайте се с всички лабораторни правила и предпазни мерки, които трябва да се вземат при работа с микроорганизми. Независимо от класификацията на биологична опасност, всички материали, които влизат в контакт с микроорганизми, се считат за инфекциозни отпадъци и трябва да бъдат обеззаразени преди изхвърляне. Следвайте указанията за безопасност в съответствие с тези, предоставени от институционалните отдели за здраве и безопасност на околната среда, като създадете подходящи контейнери за отпадъци за незабавно и правилно изхвърляне на потенциално замърсени материали (биоопасности).

Стерилизирайте всички инструменти, разтвори и среди, преди да ги използвате за процедури за нанасяне на покритие.

Изчистете всички материали, затрупващи работната ви зона на лабораторната маса.

Почистете работната зона с дезинфектант, за да сведете до минимум възможното замърсяване.

Поставете горелка на Bunsen и работете бавно, внимателно и умишлено в зоната на стерилно поле, създадена от възходящото течение на пламъка.

Ако работите с организми BSL-2, настройте работното си пространство в шкаф за биологична безопасност. Горелката на Bunsen не може да се използва вътре в шкафа, тъй като топлината от пламъка нарушава въздушния поток, който е важен за неговата функционалност.

Подредете всички необходими консумативи за процедурата на лабораторната пейка близо до стерилното поле. Уверете се, че всички материали са правилно етикетирани. Организирането на работната зона за максимална ефективност на работата и избягване на ненужни движения ще сведе до минимум времето на излагане на експерименталните материали на замърсители във въздуха.

Поставете горелката на Bunsen отдясно на пейката.

Поставете плочи с агар или блюда на Петри отляво.

Подредете клетъчни култури, епруветки, колби и бутилки в центъра на пейката.

Разхлабете капачките на епруветките, колбите и бутилките, за да могат лесно да се отварят с една ръка по време на последващи манипулации.

Измийте добре ръцете си с антисептичен сапун и топла вода, преди да работите с микроорганизми.

2. Процедура на плоча с ивици: изолиране на бактериални колонии с помощта на квадрантния метод

Процедурата на стрик-плоча е предназначена да изолира чисти култури от бактерии или колонии от смесени популации чрез просто механично разделяне. Единичните колонии се състоят от милиони клетки, които растат в клъстер върху или в агарова плоча (Фигура 1). Колонията, за разлика от една клетка, се вижда с просто око. На теория всички клетки в колонията са получени от една бактерия, първоначално депозирана върху чинията и по този начин се означават като клонинг или клъстер от генетично идентични клетки.

Бактериите съществуват в различни форми и размери. Например индивидуално Ешерихия коли клетките са пръчковидни със средна дължина 2 μm и ширина 0,5 μm, докато стрептокок клетките са сферични със среден диаметър 1 μm. Някои бактерии (напр Е. coli) съществуват като единични клетки, докато други образуват различни модели на асоцииране. стрептокок, например, растат по двойки или образуват вериги или клъстери от клетки. Обикновено се приема, че една колония възниква от една клетка, подложена на бинарно делене, но това предположение не е вярно за онези бактерии, които естествено съществуват като двойки, вериги или клъстери или които се делят по други механизми. Като алтернатива, ако се поставят твърде много бактерии, тогава може да се получи припокриване на клетките и да се увеличи вероятността две или повече бактерии да доведат до това, което изглежда като една колония. За да се избегнат тези усложнения при описване или изброяване на бактериални култури, растящи върху твърда среда, колониите се наричат колонии образуващи единици (cfu).

С процедурата на стрик-плоча смес от клетки се разстила върху повърхността на полутвърда хранителна среда на базата на агар в петриева паничка, така че все по-малко и по-малко бактериални клетки се отлагат в широко разделени точки на повърхността на средата и след инкубация се развиват в колонии. Тук ще бъде описан квадрантният метод за изолиране на единични колонии от смес от клетки.

Покриването на ивици може да се осъществи с редица различни инструменти (Фигура 2). Металната примка може да бъде използвана многократно и се използва за рутинни лабораторни щамове с ивици. Пластмасови бримки за еднократна употреба се предлагат в търговската мрежа и се използват по-често при работа с BSL-2 щамове в шкаф за биобезопасност. Много изследователи предпочитат да използват еднократни, предварително стерилизирани дървени пръчици или плоски клечки за зъби за нанасяне на ивици. Те са евтина алтернатива на пластмасовите бримки за еднократна употреба и могат да бъдат особено полезни при работа с проба от околната среда като почва, която вероятно съдържа спорообразуващи бактерии.

Предварително стерилизираните пръчици и клечки за зъби за еднократна употреба не трябва да се запалват с горелката на Bunsen, като по този начин се предотвратява ненужното аерозолиране на спорообразуващи бактерии и кръстосано замърсяване на лабораторни повърхности или агарови плочи със спори.

Етикет около ръба на дъното (не на капака) на агаровата плоча с поне вашето име, датата, вида на растежната среда и вида на организма, който ще бъде поставен върху средата.

Плочите трябва да са напълно сухи без конденз върху капака и предварително затоплени до стайна температура преди нанасяне на ивици. Ако плочите се съхраняват при 4 ଌ, отстранете ги няколко часа или дори предния ден. Разпределете ги на малки, шахматно разположени купчини от не повече от 2-3 чинии и ги оставете да изсъхнат.

Пробата, от която ще бъде инокулирана плочката с ивици, може да бъде или суспензия от клетки в бульон, или съществуваща колония от друга агарова плака. За начало се препоръчва да се използва само една проба за инокулиране на една плоча. За да спестите време и материали, една плоча може да се използва за множество проби, но само след като станете опитни в нанасянето на една проба върху плоча.

За първия квадрант пробата се взема и се разстила върху около една четвърт от повърхността на средата, като се използва бързо, плавно движение напред-назад (панел А на Фигура 3). Повдигнете долната половина на обърната чиния от пейката. Преместете примката, пръчката или клечката за зъби напред-назад много пъти по повърхността на агара от ръба до центъра на чинията.

Ако инокулумът е клетъчна суспензия, вземете примка с метална примка или 5 до 10 μl с микропипетка. Уверете се, че сте завъртели или завихряте клетъчната суспензия, преди да отстраните аликвотна част за посяване. Използвайте асептична техника, докато изпълнявате тази стъпка, като запалвате не само примката, но и ръба на бутилката или епруветката преди и след отстраняване на инокулума. Също така, не докосвайте стените на епруветката или бутилката с примката или цевта на микропипетката. Ако пипетирате инокулума, разпределете клетъчната суспензия на подходящото място на плаката, след което използвайте бримка, пръчка или клечка за зъби, за да я разнесете върху първия квадрант на плаката.

Ако инокулумът е колония от друга плака, внимателно докоснете колонията с примката, пръчката или клечката за зъби, след което я разпръснете върху първия квадрант на плаката. Уверете се, че металната примка е охладена, преди да докоснете колонията. За да сте сигурни, че примката не е твърде гореща, докоснете я леко върху агаровата плоча в определено място, където няма да има ивици. Необходими са само няколко клетки от колонията, а не цялата колония.

Ако използвате метален контур, запалете го с горелка на Bunsen, преди да получите инокулума за плаката (панел B на Фигура 3). Започнете на около 3-4 инча от примката, като жицата е в върха на синия конус, най-горещата част на пламъка. Металът трябва да стане горещ. Преместете жицата, така че пламъкът да се приближи до контура. Тази манипулация предотвратява аерозолирането на бактериите, останали в контура от предишната употреба.

Пламъкът убива бактериите (макар и не спорите) и конвекционните потоци от нагрятия въздух предотвратяват утаяването на други замърсители във въздуха върху металната тел по време на последващи манипулации.

Ако използвате стерилна плоска клечка за зъби, задръжте внимателно тесния край между палеца и безименния си пръст под ъгъл от 10 до 20° спрямо средата и използвайте широкия край, за да начертаете квадрантите. Ако използвате бримка или дървена пръчка, дръжте я като молив под същия ъгъл. Не натискайте толкова силно, че примката, пръчката или клечката за зъби да забият в агара.

След като завършите първия квадрант, обърнете и поставете чинията обратно в капака на пейката. Изхвърлете пръчката или клечката за зъби или запалете отново металната примка, както е описано в стъпка #4.

Завъртете паничката на Петри 90 °, за да начертаете втория квадрант. Повдигнете долната половина на обърната чиния от пейката, след което докоснете примката, пръчката или клечката за зъби до първия квадрант близо до края на последната ивица. Използвайки шаблона напред-назад, пресечете последната половина от ивици в първия квадрант, след което преминете в празния втори квадрант. Обърнете и поставете чинията обратно в капака на пейката, след като вторият квадрант е запълнен.

Примката, пръчката или клечката за зъби никога не трябва да се връщат обратно в първата половина на ивици в първия квадрант, където е депозирана по-голямата част от оригиналния инокулум.

За всеки квадрант трябва да се използва нов пластмасов контур, дървена пръчка или клечка за зъби.

Повторете стъпка #6 два пъти за третия и четвъртия квадрант.

Не забравяйте да изхвърлите пръчката или клечката за зъби или да запалите отново металната примка между всеки квадрант.

Избягвайте да навлизате в първия квадрант, когато очертавате четвъртия квадрант.

Инкубирайте чинията с главата надолу, така че кондензацията, която се натрупва върху капака, да не капе върху колониите.

3. Процедура за изливане на плоча: Изброяване на бактериални клетки в смесена проба

Този метод често се използва за преброяване на броя на микроорганизмите в смесена проба, която се добавя към разтопена агарова среда преди нейното втвърдяване. Процесът води до колонии, равномерно разпределени в твърдата среда, когато се постави подходящо разреждане на пробата. Тази техника се използва за извършване на преброяване на жизнеспособни плаки, при което се изброява общият брой на единиците, образуващи колонии в агара и на повърхността на агара върху една плака. Преброяването на жизнеспособните плочки предоставя на учените стандартизирано средство за генериране на криви на растеж, за изчисляване на концентрацията на клетките в епруветката, от която е поставена пробата, и за изследване на ефекта на различни среди или условия на растеж върху оцеляването или скоростта на растеж на бактериалните клетки.

Етикет около ръба на дъното (не на капака) на стерилна, но празна паничка на Петри с поне вашето име, датата, вида на растежната среда и вида на организма, който ще бъде добавен към разтопената агарова среда.

Включете коефициента на разреждане, ако се покрива серийни разреждания, или серия от повтарящи се разреждания, което води до систематично намаляване на концентрацията на клетките в пробата. Приготвянето на серийни разреждания е необходимо, ако броят на клетките в пробата надвишава капацитета на агаровата плака, в която статистически значимият диапазон е от 30 до 300 cfu. Ако в чинията има повече от 300 cfu, тогава колониите ще бъдат претъпкани и припокриващи се.

Вземете епруветка, съдържаща 18 ml разтопена агарова среда.

Агаровата среда трябва да се разпредели в епруветки и предварително да се стерилизира в автоклав. В същия ден, който е необходим за експеримент, агарът трябва да се разтопи на пара за 30 минути, след което да се прехвърли във водна баня при 55 ଌ. Трябва да се стопи само толкова агар, колкото е необходимо за експеримента, тъй като не може да се използва повторно.

Десет минути преди изливането на плочките, епруветките с разтопен агар трябва да бъдат прехвърлени от 55 ଌ водна баня в топлинен блок на лабораторната маса, настроен на 48 ଌ. След като агарът достигне тази температура, той е готов за изливане. Ако агарът е твърде горещ, бактериите в пробата могат да бъдат убити. Ако агарът е твърде хладен, средата може да е на бучки, след като се втвърди.

Вземете вашата проба, която трябва да бъде или бульонна култура, или суспензия от клетки, получени чрез смесване на клетки от колония в буфер или физиологичен разтвор.

Пробите могат да бъдат получени от серия от разреждане на една проба.

Обемът на пробата за поставяне трябва да бъде между 0,1 и 1,0 ml.

Отворете капака на празната паничка на Петри и разпределете пробата си в средата на чинията (панел А на Фигура 4). Затворете капака.

Използвайте асептична техника по време на тази процедура.

Използвайте или серологична пипета, или микропипетатор, за да прехвърлите пробата си в плаката. Контролирайте потока на пробата, така че да не изпръсне от плочата.

Отстранете капачката от епруветката с разтопения агар и прекарайте ръба на отворената епруветка през пламъка на горелката на Bunsen.

Отворете капака на паничката на Петри, съдържаща вашата проба, и внимателно изсипете агара (панел B на Фигура 4).Затворете капака, след което смесете пробата с агара, като внимателно завъртите чинията.

Оставете агара да се втвърди напълно, преди да обърнете плаката за инкубация.

4. Процедура за разпръскване на плаки: образуване на отделни бактериални колонии за преброяване на плочките, обогатяване, селекция или скрининг

Тази техника обикновено се използва за отделяне на микроорганизми, съдържащи се в малък обем на пробата, който се разпределя по повърхността на агаровата плоча, което води до образуването на дискретни колонии, разпределени равномерно по повърхността на агара, когато се постави подходяща концентрация на клетки. В допълнение към използването на тази техника за преброяване на жизнеспособни плаки, при която общият брой образуващи колонии единици в една плоча се изброява и се използва за изчисляване на концентрацията на клетките в епруветката, от която е поставена пробата, рутинно се използва разпръскване в експерименти за обогатяване, селекция и скрининг. Желаният резултат за тези три експеримента обикновено е същият като при броенето на плочки, при което се образува разпределение на отделни колонии по повърхността на агара. Целта обаче не е да се гарантира всичко жизнеспособните клетки образуват колонии. Вместо това трябва да растат само тези клетки в популацията, които имат определен генотип. Процедурата за разпръскване на плочата може да се използва върху техниката на плочата за изливане за експеримент за изброяване, ако крайната цел е да се изолират колонии за по-нататъшен анализ, тъй като колониите растат достъпно на повърхността на агара, докато те се вграждат в агара с процедурата за изливане.

Има две описани тук стратегии за процедурата за разпръскване. Първият (Метод А) включва използване на грамофон и стъклен или метален прът, оформен като хокейна пръчка. Вторият (Метод Б), наричан "Метод Копакабана", включва разклащане на предварително стерилизирани стъклени перли. И двете улесняват равномерното разпространение на клетките по повърхността на агара.

Метод А: Разпръскване с грамофон и стъклен или метален прът

Етикет около ръба на дъното (не на капака) на агаровата плоча с поне вашето име, датата, вида на растежната среда и вида на организма, който ще бъде поставен върху средата.

Включете коефициента на разреждане, ако се покрива серийни разреждания.

Плочите трябва да са напълно сухи без конденз върху капака и предварително затоплени до стайна температура преди нанасяне. Ако плочите се съхраняват при 4 ଌ, отстранете ги няколко часа или дори предния ден. Разпределете ги на малки, шахматно разположени купчини от не повече от 2-3 чинии и ги оставете да изсъхнат.

Центрирайте плочата върху грамофона (Фигура 5).

Вземете вашата проба, която трябва да бъде бульонна култура или суспензия от клетки, получени чрез смесване на клетки от колония в буфер или физиологичен разтвор.

Пробите могат да бъдат получени от серия от разреждане на една проба.

Обемът на пробата за поставяне трябва да бъде между 0,1 и 0,2 ml.

Отворете капака на паничката на Петри и разпределете пробата си в центъра на агара. Затворете капака.

Използвайте асептична техника по време на тази процедура.

Използвайте микропипетатор, за да прехвърлите пробата си в чинията. Контролирайте потока на пробата, така че да не изпръсне от плочата.

Потопете стъклената пръчка или металната пръчка (наричана още разпръсквачка) в чаша със 70% (v/v) етанол.

ВНИМАНИЕ: Никога не потапяйте горещ спрейтър в чаша с алкохол.

Етанолът трябва да докосва само долната част на разпръсквача и първия инч от стеблото.

Отцедете и запалете излишния етанол, като го прекарате през пламъка на горелка на Bunsen.

Пламъкът трябва да се движи по дължината на разпръсквача и стеблото, които са влезли в контакт с етанола, след което бързо да изгаснат.

Ако чашата с етанол се запали, не се паникьосвайте! Поставете стъклен капак върху чашата, която бързо ще гаси огъня.

Отворете капака на агаровата чиния, като държите капака в лявата си ръка с палеца и показалеца. Охладете разпръсквача, като го докоснете до агара по ръба близо до ръба.

Не докосвайте агара, където са добавени клетките. Горещият разпръсквач ще убие клетките.

С лявата си ръка (докато все още държите капака на агаровата чиния) завъртете бавно грамофона.

Въпреки че е най-добре да се избягва, ако трябва да сложите капака надолу, поставете го с лицето надолу върху дезинфекцирана повърхност в стерилното поле на горелката на Bunsen. При капак, обърнат нагоре, има по-голям шанс за замърсяване от движения на предмети или ръце, създавайки въздушни потоци, които карат микроорганизми и прахови частици да се спускат към вътрешната повърхност на капака.

С дясната си ръка дръжте разпръсквача внимателно върху повърхността на агара и постепенно разпределете пробата равномерно по цялата плоча. Преместете разпръсквача напред и назад през плочата, докато въртящата се плоча.

Оставете пробата да се абсорбира добре (поне 5 минути), преди да обърнете плаката за инкубиране.

Метод Б: Покриване със стъклени перли: „Метод Копакабана“

Етикет около ръба на дъното (не на капака) на агаровата плоча с поне вашето име, датата, вида на растежната среда и вида на организма, който ще бъде поставен върху средата.

Включете коефициента на разреждане, ако се покрива серийни разреждания.

Отворете капака на агаровата чиния, като държите капака в лявата си ръка с палеца и показалеца. След това отворете стъклената тръба или бутилката, съдържаща предварително стерилизирани стъклени перли. С дясната си ръка запалете ръба на епруветката или бутилката, след което внимателно разпределете 10-12 стерилни стъклени перли върху плоча с агар (Фигура 6). Затворете капака на чинията и запалете ръба на епруветката или бутилката още веднъж, преди да поставите капачката и да я оставите настрана.

Внимателно изсипете мънистата от епруветката или бутилката на няколко сантиметра над агара, така че зърната да не отскачат от паничката на Петри.

Използвайте стъклени перли с диаметър 4 мм. Стерилизирайте ги в стъклени бутилки или епруветки в автоклава при 121 ଌ на сух цикъл (настройка на гравитация) за 30 минути.

Едно от предимствата на използването на мъниста вместо разпръсквач е, че не са необходими отворени контейнери с етанол за многократно запалване.

Отворете капака на агаровата чиния и разпределете пробата си в центъра на агара. Затворете капака.

Използвайте асептична техника по време на тази процедура.

Аликвотна част от 100 до 150 μl проба на плоча. Този обем ще улесни равномерното разпространение на клетките. Използвайте микропипетатор, за да прехвърлите пробата си в чинията. Контролирайте потока на пробата, така че да не изпръсне от плочата.

Разстелете пробата, като леко разклатите зърната по повърхността на агара 6 до 7 пъти. За да осигурите равномерно разпределение на клетките, използвайте хоризонтално разклащане.

Не въртете мънистата, в противен случай всички клетки ще се окажат на ръба на плочата.

СЪВЕТ: Ако се извърши правилно, процедурата звучи като "разклащане на маракаси".

Завъртете плочата 60°, след което отново разклатете хоризонтално 6 до 7 пъти.

Завъртете плочата 60° втори път и отново разклатете хоризонтално. Досега трябва да постигнете равномерно разпределение на клетките по повърхността на агара.

След приключване на разпръскването пробата трябва да се абсорбира и повърхността на агара трябва да е суха. Изсипете замърсените зърна в маркирана събирателна чаша, съдържаща 10% хлорна белина.

Не изхвърляйте мънистата в кошчето! Използваните мъниста ще бъдат изплакнати и автоклавирани, като се стерилизират повторно за повторна употреба.

ЗАБЕЛЕЖКА: Ако повърхността на агара е все още мокра след трикратно разклащане, оставете плочата да престои няколко минути, за да позволите на течността да се абсорбира от агара, след това повторете стъпки #4-6, докато повърхността на плочата изглежда суха.

Обърнете плочата за инкубация.

5. Процедура за наслагване с мек агар: образуване на плаки за изолиране и изброяване на фаг (тест на плака)

Тази техника обикновено се използва за откриване и количествено определяне на бактериофаг (фаг) или бактериални вируси с размери от 100 до 200 nm. Необходим е електронен микроскоп, за да се видят отделни фагови частици. Въпреки това, наличието на инфекциозни фагови частици може да се установи като плаки върху чиния с агар (Фигура 7А). Фагите не могат да се репликират извън техните бактериални клетки-гостоприемници, така че размножаването и откриването изисква смесване на фаги и клетки-гостоприемници преди посяването. За процедурата за наслагване с мек агар, малък обем, обикновено в диапазона от 50 μl до 200 μl, от фагова суспензия се разпределя в епруветка, съдържаща около 10 8 бактерии (клетки гостоприемници), които са равномерно диспергирани в 2,5 -3,0 ml мек (0,5 до 0,7% [w/v]), разтопен хранителен агар. Получената смес се излива върху повърхността на твърда (1,5 до 1,9% [w/v]) плоча с хранителен агар. Плаката се разклаща достатъчно, за да се гарантира, че мекият агар покрива цялата повърхност на твърдия агар. След това плочката се поставя на равна повърхност, докато горният слой агар има време да се втвърди и след това може да се постави в инкубатора.

С течение на времето се образува мътна суспензия от бактериални клетки, наречена a морава, става видим в цялата мека агарова среда (Фигура 7В). Плаки се образуват, ако фагът зарази една от бактериалните клетки, репликира се в клетката, след което лизира клетката, освобождавайки до 100 потомствени фага (известен още като размер на взрива). Новите фагови частици дифундират в мекия агар, заразявайки бактериите в областта около лизираната бактериална клетка. След множество цикъла на инфекция и лизис, мътната бактериална клетъчна суспензия в мекия агар изчезва, оставяйки зона на изчистване, наречена плака. Всяка плака съдържа повече от 10 9 фагови частици, всички генетично идентични с оригиналната инфекциозна фагова частица. Тъй като плака възниква от единична фагова частица, полученият брой от плакообразуващи единици (pfu) може да се преброи и първоначалната концентрация, или титър, на фаговата суспензия може да се изчисли. Този тип експеримент, наречен анализ на плака, също предоставя на учените стандартизирани средства за генериране на криви на растеж в една стъпка, за изследване на специфичността на обхвата на гостоприемника и за трансдуциране на бактериални клетки за генетични експерименти.

Пригответе индикаторните бактерии: Експоненциално растяща култура на бактериалния щам гостоприемник трябва да бъде подготвена за експеримента с наслагване с мек агар. Всеки хост има свои собствени изисквания за растеж. За всяка плака са необходими между 0,3 ml и 0,5 ml суспензия от индикаторни бактерии. Ако се приготви колба с индикаторни бактерии (например, 25 ml), културата трябва да бъде разделена на по-малки аликвоти (например аликвоти от 5 ml, разпределени в стерилни епруветки с винтова капачка), за да се сведе до минимум възможността от кръстосано замърсяване. Епруветките могат да се държат на лед (при 4 ଌ), докато бъдат готови за използване в експеримента. Използвайте асептична техника за инокулиране на стерилен хранителен бульон, след което инкубирайте според спецификациите на бактериалния щам. Останалите култури трябва да се изхвърлят в края на деня.

Подгответе адсорбционни тръби: Поставете две стерилни микроцентрофужни епруветки в поставка. Означете капака на първата епруветка с „Фаг“ и капака на втората епруветка с „Контрол“.

Обикновено серийни разреждания от фагови лизати се приготвят и поставят в плаки, в който случай допълнителни микроцентрофужни епруветки ще бъдат добавени към стойката и маркирани с фактора на разреждане.

Запасите от фаги трябва да се правят пресни от единични плаки и да се съхраняват при 4 ଌ. За дезагрегиране на фаговите частици, запасите трябва да се затоплят до температурата на околната среда преди провеждане на експеримент.

С фаговите запаси трябва да се работи внимателно - не разклащайте енергично на вортекс или пипета.

Добавете 50 μl от вашата фагова проба към първата епруветка, след което добавете 50 μl фагов буфер към втората епруветка, която ще служи като отрицателна контрола за анализа на плака.

Използвайте асептична техника по време на всички манипулации с фаги и бактерии.

След това добавете 500 μl индикаторни бактерии към всяка адсорбционна тръба.

Бактериалните клетки ще се утаят на дъното на епруветка, ако седите на лед или на пейката за дълги периоди от време. Ако културата не се смеси преди отстраняването на аликвотна част за експеримента, няма да бъдат прехвърлени достатъчно бактериални клетки в епруветката за адсорбция. Трябва да има достатъчен брой бактериални колонии, образувани в мекия агар (т.е. тревна площ) за откриване на плаки. Използвайте вихров миксер, за да ресуспендирате внимателно индикаторните бактерии в хомогенна суспензия, преди да прехвърлите аликвоти в епруветките за адсорбция.

Смесете бактериалните клетки и фага, като леко разклатите епруветките.

Инкубирайте сместа фаг/бактерия за 15-20 минути (не повече от 30 минути) при температура, подходяща за индикаторния щам.

Пригответе плочи с хранителен мек агар и твърд агар: Докато се извършва адсорбцията, поставете две епруветки с мек агар (предварително разтопени и съхранявани при 55 ଌ) в нагревателен блок на лабораторната ви маса, настроена на 46-48 ଌ.

Разтопеният мек агар трябва да се уравновеси до температурата на нагревателния блок за 10-15 минути. Ако разтопеният мек агар престои повече от 15 минути, той ще започне да се втвърдява и ще образува бучки, когато се излее върху твърдия агар. Ако разтопеният мек агар престои по-малко от 10 минути, той ще бъде твърде горещ, когато се добави към сместа от фаги/бактерии, убивайки клетките гостоприемници преди посяването. Следователно една морава може да не се образува и да се открият малко или никакви плаки.

Пригответе допълнителни епруветки с мек агар, ако поставяте серийни разреждания на фаговия лизат.

Етикет около ръба на дъното (не на капака) на две плаки с твърд агар с хранителни вещества с най-малко вашето име, дата, тип среда за растеж и "фаг" или "контрол", съответстващ на адсорбционните епруветки.

Включете допълнителни плаки, обозначени с коефициента на разреждане, ако поставяте серийни разреждания.

Твърдите агарни плочи трябва да са напълно сухи без конденз на капака и предварително затоплени до стайна температура, преди да се добави мекият агар. Ако плочите се съхраняват при 4 ଌ, отстранете ги няколко часа или дори предния ден. Разпределете ги на малки, шахматно разположени купчини от не повече от 2-3 чинии и ги оставете да изсъхнат. Прекомерната влага в слоя на твърдия агар ще доведе до разреждане на мекия агар, позволявайки на фага да дифундира по-лесно през мекия агар по време на образуването на плака. В резултат на това размерът на плаката ще се увеличи.

Адсорбционни тръби с плочи една по една, както следва: Използвайте микропипетатор P1000, за да прехвърлите асептично сместа от фаги/бактерии (трябва да бъде приблизително 550 μl) в мека епруветка с агар, след което бързо я завъртете между дланите на ръцете си, за да смесите съдържанието. НЕ разклащайте тръбата, така че да се вкарат въздушни мехурчета. Като държите епруветката в лявата си ръка, отворете капака на плоча с твърд агар с дясната си ръка и незабавно изсипете цялото съдържание на епруветката върху повърхността на плоча с твърд агар. Преди да затворите капака, разклатете плочата внимателно, но бързо, за да разпространите разтопения мек агар по цялата повърхност на чинията, преди да има време да се втвърди. Избягвайте да пръскате разтопения мек агар върху стените на паничката на Петри. Затворете капака.

Повторете стъпка #9 за всички адсорбционни тръби, една тръба на време.

Поставете чиниите върху равна повърхност и ги оставете да стоят необезпокоявани, докато мекият агар се втвърди.

Обикновено 30 минути са достатъчни.

Обърнете чиниите за инкубация.

Множество плаки могат да бъдат подредени и залепени заедно, след което да се обърнат за инкубация.

След инкубация, плаките могат да бъдат проверени за плаки. Отрицателната контрола трябва да има само морава от бактерии (без дупки, показващи плаки). Плаките се различават по размер, форма и цялостен външен вид. Даден тип фаг може да бъде изолиран от хетерогенна смес от плаки чрез внимателно пробиване на центъра на една плака със стерилна клечка за зъби и прехвърляне на инокулума в стерилна микроцентрофужна епруветка, съдържаща 100 до 1000 μl бульон или фагов буфер. Този лизат може да бъде поставен в плаки, като се използва същата процедура, описана по-горе. Необходими са поне 3 до 6 последователни изолации с единична плака, за да се гарантира, че е получен чист фаг. Често лизатът трябва да бъде разреден в голям диапазон (10 -1 до 10 -10 ), за да се намери титър, който произвежда неприпокриващи се плаки върху плоча. Броят варира в зависимост от размера на плаката.

6. Процедура на плака с копия: Трансфер на клетки за скрининг на мутанти и ауксотрофи

Тази техника позволява сравнение на клетъчния растеж на първична плоча с вторични плаки, генерирайки средство за скрининг на клетките за избираем фенотип. Първо първичната или основната плака се инокулира с клетки или чрез разпръскване на разреждане, което произвежда единични колонии, или чрез прехвърлянето им в плака в пространствен модел, определен чрез маркировка на мрежата. Вторичните плаки, съдържащи среда с инхибитори на растежа или среда, в която липсва определено хранително вещество, се инокулират с клетки от колонии в първичната плака. Пространственият модел на колониите се възпроизвежда първо чрез притискане на парче кадифе към първичната плоча. Бактериалните клетки се придържат към кадифето, защото имат по-голям афинитет към кадифето, отколкото към агара. След това отпечатъкът от клетки върху кадифето се прехвърля върху множество вторични плочи с клетъчен растеж, отразяващ същия модел на колония като този на първичната плоча. С други думи, това е като да имате гумен печат, възпроизвеждащ модела на растеж от една плоча на друга. Тази техника е изгодна, защото позволява сравнително голям брой колонии да бъдат скринирани едновременно за много фенотипове в един експеримент.

Подгответе основната чиния: Етикет около ръба на дъното (не на капака) на агаровата чиния с поне вашето име, дата и вид среда за растеж.

Маркирайте решетка в долната част на плочата с поне две еднакво разположени вертикални линии и поне две хоризонтални линии на еднакво разстояние. Номерирайте получените квадратчета.

Използвайте предварително стерилизирана клечка за зъби, за да инокулирате всеки квадрат с клетъчна проба. За всяка проба нанесете центъра на квадрата. Не покривайте целия квадрат с клетки (Фигура 8) или в противен случай пробата ще прерасне при инкубиране и ще замърси околните квадрати.

Всеки квадрат ще бъде инокулиран с различна проба, получена или от бульонни култури, или от колонии в друга плака.

Обърнете и инкубирайте първичната плака, която ще се използва за инокулиране на различни вторични среди.

Инокулирайте вторични плочи: Подредете основната плоча и всички вторични плочи. С маркер направете ориентационен знак отстрани на плочите. Уверете се, че маркировката е от долната страна на всяка чиния, а не върху капака.

Вземете стерилна кадифена кърпа и я поставете върху цилиндричния блок (Фигура 9). Заключете кадифената кърпа на място с държача. Обърнете внимание на знака за ориентация на блока.

Блокът трябва да е със същия размер като дъното на паничка на Петри (диаметър 10,2 см). Трябва да се предлага със заключващ пръстен, който захваща кадифената кърпа към блока, докато копира покритието.

Кадифената кърпа (15,2 х 15,2 см квадрат) трябва да бъде предварително стерилизирана. Подредете 10 или 12 чисти квадрата, след което ги увийте в алуминиево фолио, след което ги поставете в автоклава при 121 ଌ на сух цикъл (настройка на гравитацията) за 30 минути. Преди да ги използвате в експеримент с реплика, уверете се, че са напълно сухи, като ги поставите в топла фурна за няколко часа. Имайте предвид, че кадифените квадратчета може да се наложи да бъдат премахнати с маскираща лента преди стерилизация.

Кадифените квадратчета могат да се използват повторно. След като използваните квадратчета от кадифе са били обеззаразени в автоклава, те трябва да се изплакнат с обикновена вода и да се стерилизират отново, както е описано по-горе.

Цилиндричният блок и скобата трябва да се дезинфекцират между употребите с кратко изплакване в 70% (v/v) етанол или 10% хлорна белина.

Отстранете капака и обърнете основната чиния. Подравнете маркировката за ориентация на плочата с маркировката на блока. Спуснете плочата така, че повърхността на агара да е в контакт с кадифената кърпа на цилиндричния блок. Леко, но равномерно натиснете надолу с върховете на пръстите си върху гърба на основната плоча и след това внимателно повдигнете основната плоча далеч от блока. Сменете капака на чинията.

Кадифеният отпечатък на клетки от първичната плоча може да се използва за инокулиране на приблизително 7-8 вторични плаки, преди да е необходимо да се направи отпечатък с ново кадифе.

Повторете стъпка #7 с всяка от вторичните плочи.

Като положителна контрола, последната плака в серията трябва да бъде агарова среда, в която трябва да растат всички тествани щамове. По този начин можете да потвърдите, че клетките са прехвърлени във всички вторични плочи в серията. В противен случай липсата на растеж върху определена тестова среда може да се припише на недостатъчен клетъчен трансфер, а не на фенотипа на щама.

За да се избегнат фалшиви положителни резултати, вторичните плочи трябва да бъдат подредени от най-малко към най-благоприятния субстрат. В противен случай хранителните вещества могат да се прехвърлят между плочите, което позволява на клетките да растат в неблагоприятна среда.

Обърнете чиниите и инкубирайте.

Забележка: Когато проверявате вторичните плочи за растеж, не забравяйте да правите разлика между растеж и отпечатък. Последното е отрицателен резултат.

7. Почистване на работното пространство

Изключете горелката на Bunsen, след което приберете всички консумативи, включително култури в плочи или в епруветки, допълнителни среди и други реагенти.

Не позволявайте стари култури, независимо дали са в чинии или в епруветки, да се натрупват на лабораторната маса или в складовите зони. Тези проби, които са известни източници на замърсяване като плесени и нежелани бактериални видове, трябва да бъдат изхвърлени веднага щом вече не са необходими.

Поставете замърсената лаборатория (ръкавици, накрайници за пипети, кърпички), стъклени съдове (епруветки, колби, бутилки) и опасни отпадъци (бактериални култури или фагови разтвори, използвани плаки) в подходящия контейнер за изхвърляне. При работа с непатогенни Е. coli щам (BSL-1), се генерират само неинфекциозни опасни отпадъци. При извършване на същите тези процедури с патогенни организми (BSL-2 или по-високи), се генерират опасни инфекциозни отпадъци. Независимо от класификацията на биологична опасност, опасните отпадъци трябва да бъдат автоклавирани или дезинфекцирани, преди да бъдат изхвърлени. Следвайте указанията, описани в BMBL (5-то издание), както и тези, предоставени от вашия институционален отдел за здраве и безопасност на околната среда за незабавното и правилно изхвърляне на биологични опасности, генерирани по време на експеримент.

Почистете работната зона с дезинфектант.

Измийте добре ръцете си с антисептичен сапун и топла вода, преди да напуснете лабораторията.

8. Представителни резултати

Техника на стрик-плоча. Примерно приложение за нанасяне на ивици е показано в Фигура 1. Тази процедура се използва за изолиране на бактериални колонии от смесени клетъчни култури и е една от най-важните техники за овладяване в микробиологията и молекулярната генетика. Всяка колония представлява популация от клетки, които са генетично идентични. За много приложения надолу по веригата е наложително да се започне или с една колония, или с чиста бактериална култура, генерирана чрез инокулиране на среда с клетки от една колония. Например, морфологията на отделните клетки в рамките на колония може да бъде инспектирана с помощта на светлинен микроскоп. Генетичната идентичност може да бъде присвоена чрез секвениране на малка субединица рибозомна РНК ген от геномна ДНК, изолирана от клетъчна култура, започната с една колония. А метаболитните характеристики могат да бъдат описани чрез подлагане на клетките на различни биохимични и физиологични анализи. Само чрез извършване на такива експерименти с чисти култури човек може да бъде сигурен в свойствата, приписвани на даден микроорганизъм. Резултатите не са затъмнени от възможността културата да е замърсена. Възможно е да възникнат технически грешки, ако стерилността на инструмента, използван за нанасяне на ивици на клетките през плочата, не се поддържа през цялата процедура. Забравянето да запалите примка или да вземете нова клечка за зъби между квадрантите, затруднява получаването на единични колонии. Някои бактериални видове не могат да бъдат изолирани в чиста култура, тъй като те зависят от кооперативна връзка с друг бактериален вид за определени изисквания за растеж. Наричани синтрофи, тези организми могат да се отглеждат само при условия на съвместно култивиране, така че колониите (ако се образуват) винаги ще се състоят от два или повече вида. Друго предизвикателство, срещано в лабораторията при извършване на процедурата с стрик-плоча с бактерии, получени от проби от околната среда, е, че клетките показват характеристики на растеж, които се отклоняват от традиционните лабораторни щамове, като напр. Е. coli. Такива бактериални щамове могат да произвеждат колонии, които са нишковидни (за разлика от стегнатите струпвания от клетки) с разклонения, които се разпространяват върху голяма част от агаровата плоча, калцирани и по този начин рефрактерни на проникване от инструмент за плоча с ивици или заобиколени от лепкава капсула така че отделните колонии не могат да се различат. Тези характеристики затрудняват пречистването на единични колонии чрез техниката на стрик-плоча.

Техника за изливане. С техниката за изливане на плочките колониите се образуват в агара, както и на повърхността на агаровата среда, като по този начин осигуряват удобно средство за преброяване на броя на жизнеспособните клетки в пробата. Тази процедура се използва в различни промишлени приложения. Например, за пречиствателна станция за отпадни води, която е отговорна за пречистването на течните отпадъци (напр. канализация, оттичане от дъждовни канали), генерирани от битови, търговски и промишлени имоти, както и селскостопански практики, е важно да анализира водата проби след екстензивния процес на пречистване. Пречистените отпадъчни води (непитейни води) се използват повторно по различни начини - за напояване на нехранителни култури в селското стопанство, за санитарно промиване в жилища и в промишлени охладителни кули - така че не трябва да има химическо и микробно замърсяване. Питейната вода (питейната вода) трябва да бъде пречистена в съответствие със стандартите на EPA и се тества с помощта на методи за микробиологично поставяне, които позволяват изброяване на специфични човешки патогени. Показани в Фигура 10 са бактериални колонии, получени от бактериални клетки, присъстващи във водна проба, събрана от обществена чешма. Малко вероятно е бактериалните патогени да произведат тези колонии предвид мерките за пречистване на питейната вода, но микробите са навсякъде и замърсяването дори от непатогенни щамове може да бъде само сведено до минимум, а не да се елиминира напълно. Като друг пример, фармацевтичната компания трябва да оцени степента на микробно замърсяване или бионатовареност на ново лекарство по време на производство, съхранение и транспорт. Чрез вземане на проби от лекарството по време на различни фази на процеса и поставяне на проби с помощта на процедурата за изливане, микробният товар или броят на замърсяващите бактерии могат лесно да бъдат определени. След това могат да бъдат разработени предпазни мерки за минимизиране или премахване на микробното замърсяване. Една от най-често срещаните технически грешки, които възникват при извършване на техниката за изливане на плочата, е недостатъчното смесване на пробата с разтопения агар, което води до слепване на колониите, което прави броя на плочките неточен. Друга често срещана грешка е изливането на разтопения агар, когато е твърде горещ, убивайки много от бактериалните клетки в пробата. Тази грешка също ще повлияе на точността на броя на плаките, давайки числа, които не представляват общия брой единици, образуващи колонии в пробата.

Техника на разстилане. Техниката за разпръскване на плочата е аналогична на процедурата за изливане на плоча в своята полезност като средство за извършване на жизнеспособни преброявания на плочките. Въпреки това, тъй като колониите, които се образуват с помощта на техниката на разпределената плоча, са равномерно разпределени по повърхността на агаровата среда, клетките от отделните колонии могат да бъдат изолирани и използвани при последващи експериментални манипулации (напр. бульонна култура). Три често срещани приложения, в които техниката за разпръскване е важен компонент, са експерименти за обогатяване, селекция и скрининг. И при трите приложения желаният клетъчен тип може да бъде отделен от сместа и по-късно подложен на произволен брой биохимични, физиологични или генетични тестове.

Ан експеримент за обогатяване включва поставяне на смесена култура върху среда или инкубиране на плаки в условия на околната среда, които благоприятстват растежа на онези микроорганизми в пробата, които демонстрират желаните метаболитни свойства, характеристики на растежа или поведение. Тази стратегия не инхибира растежа на други организми, но води до увеличаване на броя на желаните микроорганизми в сравнение с останалите в културата. По този начин, колониите, които се образуват върху плоча за обогатяване, вероятно проявяват фенотипни свойства, които отразяват желания генотип. Например, ако целта ви е да култивирате азотфиксиращи бактерии от проба от околната среда, съдържаща смес от повече от 1000 различни бактериални вида, тогава поставянето на пробата върху среда с дефицит на азот ще обогати тези бактерии, които могат да произвеждат това съединение от атмосфера, използваща метаболитни възможности, осигурени от набор от гени, необходими за фиксиране на азота.

А селекционен експеримент включва поставяне на смесена култура върху среда, която позволява да растат само тези клетки, които съдържат определен ген или набор от гени. Този тип експерименти са често срещани в лабораториите по молекулярна биология при трансформиране на бактериални щамове с плазмиди, съдържащи гени за устойчивост на антибиотици. Ако целта ви е да култивирате само рекомбинантни клетки или тези, които успешно поеха плазмида, тогава поставянето на пробата върху среда, която е допълнена с подходяща концентрация на антибиотика, ще изберете тези клетки, които проявяват резистентност към това конкретно лекарство.

А скрининг експеримент включва поставяне на смесена култура върху среда, която позволява на всички жизнеспособни клетки да растат, но клетките с желания генотип могат да бъдат разграничени от други клетки въз основа на техния фенотип. Отново този тип експерименти са често срещани в лабораториите по молекулярна биология при извършване на анализи за мутагенеза или клониране на гени в плазмиди. Класически пример, както е показано в Фигура 11, използва lacZ ген, кодиращ β-галактозидаза този ензим позволява на клетките да метаболизират X-Gal (5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-D-галактопиранозид), субстратен аналог на естествения му субстрат, лактозата. Разцепването на X-Gal от β-галактозидаза води до неразтворим син продукт. По този начин, ако среда съдържа X-gal и проба, съдържаща клетки с див тип (функционален) или мутант (нефункционален) lacZ ген се поставят върху тази среда, след това след инкубация клетки от див тип, носещи функционал lacZ генът ще се появи като синьо-пигментирани колонии, докато мутантни клетки с нефункционални lacZ генът ще се появи като непигментирани ("бели") колонии.

Технически проблем, който се среща най-често, когато за първи път се научите как да изпълнявате техниката за разпръскване, е неравномерното разпределение на клетките по повърхността на агара. При използване на въртящ се плот и стъклен прът, пробата може да се абсорбира твърде бързо, така че колониите да се образуват само близо до центъра на плочата. Когато правите метода Копакабана, стъклените перли се въртят, а не се разклащат по повърхността на агара. Следователно, много колонии растат по външния ръб на плочата. И в двата случая полученото разпределение на колониите не се възползва от цялата налична повърхност, така че клетките могат да се струпват заедно и да прераснат в припокриващи се колонии, което прави броя на плочките неточен или разграничаването на клетъчните типове е невъзможно.

Техника за наслагване с мек агар. Процедура, подобна на техниката за разпръскване, използвана за преброяване на бактериални колонии, може да се използва за изчисляване на броя на фагите. Докато между 30 и 300 бактериални клетки са разпръснати върху повърхността на агара за броя на плаките (cfu/ml), между 100 и 400 инфекциозни фагови частици се смесват с 10 8 до 10 9 клетки гостоприемници за броя на плаките (pfu/ml) в рамките на слой от мек агар, разпръснат по повърхността на твърд хранителен агар. Освен ако не е доказано друго, обикновено се приема, че една бактериална клетка се дели и натрупва голям брой генетично идентични клетки в един клъстер, наречен колония. Както беше обсъдено по-рано, това предположение не е валидно, когато клетките растат на групи (т.е. двойки, тетради, вериги или клъстери) или показват характеристики на растеж като капсули, които възпрепятстват образуването на единични колонии. Подобно предположение се прави за образуването на плака, тъй като всяка плака представлява активност на единичен фаг. Това твърдение е вярно само ако един фаг заразява една бактерия. Какво се случва, ако множество фагови частици заразят една бактерия? Този проблем се отнася до важен статистически параметър, който трябва да се вземе предвид при провеждане на експерименти с фаг - множественост на инфекцията (MOI) - описващ съотношението на инфекциозните фагови частици към броя на клетките гостоприемници в пробата. Тъй като някои клетки адсорбират повече от един фаг, докато други клетки адсорбират само един или никакъв фаг, популация от клетки гостоприемници трябва да бъде инфектирана при нисък MOI (𢙁), за да се сведе до минимум вероятността клетката да бъде заразена от повече от един фаг частица. Използването на единицата за образуване на плака (pfu) като функционална дефиниция избягва тези усложнения при извършване на преброяване на плаките за изчисляване на титъра на фаговия запас.

Както е показано в Фигура 12, морфологията на плаката варира за различните фаги. Някои фаги генерират малки плаки (панел А), докато други водят до големи плаки (панел Б). Редица променливи влияят на размера на плаката. Има технически причини, които допринасят за тази променливост. Например, пълната среда и плътният твърд агар подпомагат развитието на по-големи плаки, тъй като клетките гостоприемници могат да поддържат растежа на фага за по-дълъг период от време. Високата плътност на покритието на клетки-гостоприемници (㸐 9 cfu на плоча) ще доведе до намаляване на размера на плаката. Използването на по-ниски концентрации на мек агар ще увеличи скоростта на дифузия на фаговите частици в мекия агар и по този начин ще увеличи размера на плаките. Припомнете си, че тази повишена скорост на дифузия може да се случи неволно, ако плочите с твърди агар не са напълно сухи, така че кондензацията или излишната влага в съда разрежда мекия агар в наслагването. Този технически надзор ще доведе до непоследователни резултати по отношение на размера на плака за конкретен фаг.

Размерът на плаката също е свързан с редица събития в клетката гостоприемник, включително ефективността на адсорбцията, продължителността на латентния период (период от време от фаговата адсорбция до лизис на клетката гостоприемник) и размера на избухването (броя на потомството, освободено от единична инфекция). Може да се наблюдава хетерогенна смес от размери на плаките, ако фаговите частици инфектират клетките гостоприемници в различни фази на бактериален растеж. Например, тези, които се адсорбират по време на ранна експоненциална фаза, правят по-големи плаки с повече фаг на потомство, отколкото тези, които адсорбират в късна експоненциална фаза. Като общо правило, литичният фаг произвежда ясни плаки, докато лизогенният фаг образува мътни плаки. Въпреки това, някои литични фаги произвеждат интересни модели като плаката "бико око", показана на Фигура 12В. Тези прозрачни плаки са заобиколени от мътен ореол, тъй като тези клетки на ръба на плаката не са напълно лизирани или може да са устойчиви на фагова инфекция. Моделът "биче око", наблюдаван при умерен фаг, е плака с мътен център, заобиколена от прозрачен пръстен. Тази морфология отразява MOI и физиологията на клетката гостоприемник по отношение на решението за лизис-лизогения. Когато клетките за първи път са заразени с фаг, MOI е ниска и клетките растат бързо, тъй като хранителните вещества са в изобилие заедно, това улеснява литичния растеж. Тъй като все повече и повече клетки се лизират, MOI се увеличава и се образува чиста плака. Лизогените в центъра на плаката обаче продължават да растат, тъй като са имунизирани срещу лизис, което води до прозрачна плака с мътен център.

Техниката на наслагване може да бъде модифицирана за анализи на плаки с еукариотни вируси. По същия начин бактериофагите образуват плаки върху морава от бактериални клетки в мек агар, еукариотните вируси образуват плаки върху монослой клетки, покрити с гел. Монослой е сливащ се лист от клетки, растящи една до друга върху повърхността на блюдо за култура, докосващи се един друг, но не растат една върху друга. За извършване на този тип анализ на плака, аликвоти от вируса се добавят към чувствителни монослоеве на еукариотни клетки. След това монослоят се покрива с хранителна среда на базата на агароза – този гел ограничава разпространението на вирусите на потомството, освободени от заразените клетки, към съседните клетки в монослоя. Съответно се получава сферична област или плака, която съдържа клетки, увредени от освобождаването на вириони. За да се подпомогне визуализацията на плаките, багрилата, които оцветяват живите клетки, могат да бъдат приложени върху клетъчната култура, осигурявайки контраст между инфектирани и неинфектирани клетки.

Техниката на наслагване с мек агар се използва за експерименти, различни от анализи на плака. Първо, важно е да запомните, че твърдият хранителен агар е поддържаща матрица, която позволява растежа на бактериите. Второ, мекият агар, използван за наслагването, може да има различен хранителен състав от твърдия агар. По този начин мекият агар може да служи като средство за анализ на бактериални щамове за различни характеристики на растеж или метаболитни свойства. Например, техниката на наслагване се използва за скрининг на бактериите за способността им да разграждат целулозата (Teather and Wood 1982). Единични колонии се отглеждат върху неселективна твърда агарна среда, след което мекият агар, съдържащ 0,1% (w/v) карбоксиметил целулоза (CMC) се разстила върху повърхността на твърдия агар. След инкубацията плаките се заливат с оцветяване, което позволява визуализиране на зоните на изчистване около колониите в мекия агар. Изчистването се причинява от хидролитични ензими, секретирани от бактериите, разграждащи целулозата в средата. Съвсем наскоро техниката на наслагване се използва за откриване на бактерии, които инхибират растежа на метаногенни археи, открити в търбуха на добитъка (Gilbert et al. 2010 г.). Бактериалните изолати от проби от околната среда се отглеждат върху хранителна среда с твърд агар, след което колониите се покриват с мек агар, съдържащ култура от метаногени. След инкубацията плаките се проверяват за зони на инхибиране на растежа около колониите. Този метод идентифицира бактериални щамове, които произвеждат инхибитори на метаногените в мекия агар.

Най-честите технически грешки, които възникват при техниката на наслагване с мек агар, са изливането на разтопения мек агар, когато е твърде горещ или твърде хладен. Ако е твърде горещо, бактериалните клетки, смесени в средата, ще бъдат убити преди посяването. Ако е твърде хладно, тогава мекият агар ще образува бучки, когато се излее върху твърдия агар. И в двата случая резултатите ще бъдат двусмислени или в най-добрия случай нечетливи.

Процедура с копие на плоча. Прехвърлянето на култури от един тип хранителна среда в друга за тестване на изискванията за растеж става доста трудоемко, ако има повече от няколко щама.Покриването на реплика е метод, който позволява едновременен скрининг на голям брой микроорганизми. Например, след мутагенизиране на култура от клетки от див тип, може да се разпръснат разреждания на културата, за да се получат блюда с единични колонии. Първичните плочи съдържат среда, която поддържа растежа на всички клетки, включително прототрофи от див тип, които синтезират всички съединения, необходими за растежа, и мутантни ауксотрофи, които носят генетична мутация в биосинтетичен път, което ги прави неспособни да синтезират определени съединения, необходими за растежа. Чрез поставяне на сместа от клетки върху пълна среда, липсващите хранителни вещества могат да бъдат поети от околната среда. За да се направи разлика между прототрофи и ауксотрофи, колониите могат да бъдат репликирани в минимална среда. Само прототрофите ще могат да растат. Тъй като пространственият модел на първичната плоча е запазен, сравнението на вторичната плоча с първичната плака позволява идентифициране на мутантни колонии. За да се определи кое съединение мутантите вече не са способни да синтезират, колониите могат да бъдат репликирани върху минимална среда, допълнена със специфични съединения (например, аминокиселини, източници на въглерод, витамини и т.н.). По този начин стотици колонии могат да бъдат скринирани едновременно, като се използва процедурата за копиране на плака. Една техническа грешка, която може да възникне, е използването на плочи с агар, които са твърде влажни, което води до размазване на колонии, замърсявайки всички култури в чинията. Това води до резултати, които са напълно ненадеждни. Друга техническа грешка е прилагането на твърде голям натиск при прехвърляне на клетки от кадифето към вторичните плочи. Отново, след инкубиране на вторичните плаки, получените колонии могат да се припокриват, произвеждайки фенотипове на растеж, приписвани на замърсяване, а не на ауксотрофия.

Не всички микробни видове от див тип са прототрофи, така че процедурата с копие на плочата може да се използва за едновременно скрининг на различни диви видове щамове за характерни изисквания за растеж. Както е показано в Фигура 13, "намазки" на клетки от четири различни Pseudomonas бактериални щамове се поставят в два екземпляра върху маркирана с решетка плака, съдържаща пълна среда, наречена YTA (панел А). След това щамовете бяха репликирани върху три вторични плочи (панели B, C и D), съставени от минимална среда (MSA), допълнена с различен източник на въглерод (съответно ацетамид, лактоза и глицин). Резултатите показват, че две от четирите Pseudomonas щамове (P. aeruginosa и P. stutzeri) не могат да растат на тези три въглеродни източника. Като контрола, щамовете се репликират върху четвърта плака с YTA среда, за да се потвърди, че клетките са прехвърлени по време на процедурата. Тъй като и четирите щама растат върху контролната плоча YTA, недостатъците на растежа, показани на предишните три плаки от серията, са надеждни. Резултатите от репликата са представени в таблица маса 1. Една често допускана грешка е интерпретирането на отпечатък от растеж върху вторична плоча като положителен резултат. Например, сравнете фенотипа на P. aeruginosa към това на P. stutzeri върху MSA+ацетамид (панел B). Последният показва отпечатък на растеж, което е отрицателен резултат и може да възникне, ако хранителните вещества от предишната плоча се прехвърлят с родителските клетки. Не настъпва нов клетъчен растеж, тъй като липсващите хранителни вещества не са достъпни за клетките на потомството. Лесно е да объркате отпечатъка с действителния растеж. Ако имате съмнения, експериментът трябва да се повтори, като се използва алтернативен метод, като нанасяне на клетки от първичната плоча върху вторичната среда.

Фигура 1. Пример за единични колонии върху чиния. Розовите сфери близо до центъра на плочата са колонии от Serratia marcescens, грам-отрицателна, пръчковидна протеобактерия от семейство Enterobacteriaceae. Поради предпочитанията си към влажна среда, този микроорганизъм обикновено се среща в ъглите на ваните, в мивките, в фугите за плочки и върху завесите за душ. S. marcescens лесно се разпознава, тъй като произвежда червеникав пигмент, наречен продигиозин. Колониите в тази плака се генерират с помощта на техниката на стрик-плоча, като единични колонии се появяват в четвъртия квадрант след инкубация при 30 ଌ за 24 часа. Останалите три квадранта показват сливащ се растеж, при който клетките, отложени върху повърхността на агара, се развиват в припокриващи се колонии.

Фигура 2. Инструменти, използвани за техниката на стрик-плоча. Отгоре надолу са показани клечки за зъби (сплескани, а не кръгли), телена примка, пластмасова примка за еднократна употреба и дървени пръчки. Клечките за зъби обикновено се прехвърлят в малка стъклена чаша с широкия край надолу, след което се покриват с фолио, когато се автоклавират, за да се стерилизират преди употреба. Дървените пръчици се прехвърлят в 18 mm епруветки, след което се автоклавират за стерилизиране преди употреба.

Фигура 3. (A) Техника на стрик-плоча, използваща квадрантния метод. Предварително стерилизиран контур, пръчка или клечка за зъби се използва за разпределяне на пробата върху една четвърт от повърхността на агара с бързо, плавно движение назад и четвърто от ръба към центъра на чинията. Това действие се повтаря за всеки от четирите квадранта на плочата. След инкубацията растежът на клетките се появява по пътя на инструмента, използван за отлагане на клетките върху плочата. Механичното разделяне на клетките в смесена проба с помощта на тази техника трябва да доведе до единични колонии в четвъртия квадрант (вж. Фигура 1 за пример). Единичните колонии се наричат ​​колониеобразуващи единици (cfu). (B) Когато се използва метална примка за нанасяне на ивици, тя трябва да бъде стерилизирана с пламъка на горелка на Bunsen преди контакт с инокулума или агаровата среда. Припомнете си, че най-горещата част на пламъка е върхът на синия конус. Като държите дръжката на инструмента, поставете жицата в пламъка на около 3-4 инча от контура. Оставете го достатъчно дълго, за да се нажежи до червено. Преместете жицата, така че пламъкът да се приближи до контура. Уверете се, че металната примка е охладена, преди да докоснете инокулума.

Фигура 4. Техника за изливане. (A) Малък обем от пробата (между 0,1 до 1,0 ml) се разпределя асептично в празна, но стерилна паничка на Петри с помощта на серологична пипета от 5,0 ml. (B) Разтопен агар, уравновесен до температура от приблизително 48 ଌ, след това се излива в паничката на Петри с пробата. След затваряне на капака плочата се върти внимателно, за да се смесят пробата и разтопения агар. Агарът се оставя да се втвърди за около 30 минути, след което плаките се обръщат за инкубиране.

Фигура 5. Техника за разпръскване на плочата с грамофон и разпръсквач за стъкло. След като агаровата плоча се постави върху въртяща се плоча, малък обем от пробата (0,1 до 0,2 ml) се разпределя асептично в центъра на плаката с помощта на микропипетка. Разпръсквачът се стерилизира, като се потапя в чаша с етанол, след което се прекарва през пламъка на горелката на Bunsen, за да се запали излишният етанол. Преди да влезе в контакт с пробата, разпръсквачът трябва да се охлади, като се докосне до агара близо до ръба на чинията. Разпръсквачът се движи внимателно напред-назад през пробата през плочата, докато въртящата се плоча бавно се върти. Това действие позволява постепенно, но равномерно разпръскване на пробата по повърхността на агара. След затваряне на капака, плочата трябва да бъде поставена на плота неподвижна за най-малко 5 минути, за да позволи на пробата да се абсорбира напълно в агара, преди да обърнете плаката за инкубиране.

Фигура 6. Техника на разстилане със стъклени мъниста (метод Копакабана). Стъклени перли, които са били предварително стерилизирани в автоклав, се изсипват върху повърхността на плоча с агар, разположена на плота. Малък обем от пробата (100 до 150 μl) се разпределя асептично в центъра на агара с помощта на микропипетка. При затворен капак на плочата се използва хоризонтално разклащащо движение за леко преместване на зърната напред-назад през плочата 6 до 7 пъти, разпръсквайки пробата. Това действие се повтаря след завъртане на плочата 60°. Разклащащото се движение се повтаря за трети път след друго завъртане на 60°. След като пробата се абсорбира напълно в агаровата среда, зърната се изсипват в чаша, съдържаща 10% белина. След това плочите се обръщат за инкубация.

Фигура 7. Техника за наслагване с мек агар, използвана за изолиране и изброяване на фаг въз основа на образуването на плаки (наричано още анализ на плаки). (A) Наличието на фаг може да бъде открито като зони на изчистване или плаки върху сливаща се суспензия от бактериални колонии, растящи в мекия агар. Фаг Т4 е вирулентен, двуверижен ДНК фаг, който инфектира своя гостоприемник, Ешерихия коли, което кара клетките гостоприемник да лизират и освобождават потомствения фаг. След множество кръгове на инфекция и лизис, съседните Е. coli клетките в непосредствената област около оригиналната заразена клетка гостоприемник изчезват, оставяйки плака, съдържаща милиарди Т4 фагови частици. Фаг Т4 произвежда плаки с приблизително 1 mm в диаметър. В този експеримент, 200 μl от 10 -5 разреждане на 2 x 10 8 pfu/ml запас от фаг Т4 се смесват с приблизително 300 μl от Е. coli индикаторни клетки, приготвени като експоненциално растяща, аерирана култура при 37 ଌ. Както фагът, така и бактериите се добавят към епруветка с мек агар EHA, смесват се, след което се изсипват върху повърхността на плоча с EHA твърд агар. Имайте предвид, че в този случай не е било необходимо да се позволява на фагите и бактериите да се адсорбират преди посяването. След оставяне на мекия агар да се втвърди необезпокояван в продължение на 20 минути, блюдата се обръщат и се инкубират при 37 °С за 24 часа. (B) При липса на инфектиращи фагови частици, бактериалният растеж води до мътна суспензия от клетки в мекия агар, в която не се виждат отделни колонии. Вместо това, в този случай равномерна морава от бактериални клетки Е. coli, образува се в целия мек агаров слой.

Фигура 8. Подготовка на първична плоча (мастър) с бактериални проби. За да поддържате пробите организирани, дъното на плочата може да бъде маркирано в решетка и получените квадратчета да бъдат номерирани. На всяка извадка може да се присвои квадрат върху решетката. Показани са примери за правилни срещу неправилни модели на инокулация. В идеалния случай малък брой клетки се прехвърлят в центъра на квадрата, като се използва стерилен инструмент за инокулация, като клечка за зъби, за да се "попие" пробата (клетка №4). Често срещани грешки при инокулацията, като тези, изобразени в клетка №5 („кръпка“) и клетка №6 („пълнеж“), водят до свръхрастеж на бактериални проби след инкубация, като следователно замърсяват съседните квадрати.

Фигура 9. Техника на реплики, използвана за прехвърляне на клетки от първични към вторични плаки за фенотипни екрани. Маркировката на първичната плоча се подравнява с маркировката върху покрития с кадифе блок, след което се спуска, за да позволи на повърхността на агара да влезе в контакт с кърпата. Клетките се прехвърлят от плочата към кадифето чрез леко, но равномерно натискане на основната плоча с върха на пръстите. Това действие ще остави отпечатък от клетъчните проби върху кадифето в същия пространствен модел като основната плоча. Същата процедура се използва за прехвърляне на клетки от кадифето към вторична плоча. До 7-8 вторични плаки могат да бъдат инокулирани, като се използва същият отпечатък на първична плочка върху кадифето. Последната плоча, инокулирана от кадифето, трябва да служи като положителна контрола. Това трябва да бъде среда, която поддържа растежа на всички тествани щамове, осигурявайки достатъчен клетъчен трансфер през цялата серия плочи. След инкубацията, вторичните плаки могат да бъдат инспектирани и оценени за растеж срещу липса на растеж. По този начин множество бактериални щамове могат да бъдат скринирани едновременно на няколко растежни среди в един експеримент.

Фигура 10. Примерен резултат с помощта на техниката за изливане. Проба от 1,0 ml вода, събрана от обществена чешма за пиене, се разпределя в стерилна празна паничка на Петри. След това разтопеният, но охладен YTA се излива в съда с пробата. Агарът съдържа също 100 μg/ml циклохексимид за предотвратяване на растежа на дрожди и плесени, които може да са присъствали във водната проба. След леко завихряне за смесване, плочата се поставя върху равна повърхност и агарът се оставя да се втвърди напълно. Плаката се инкубира при 37 °С в продължение на 48 часа. Показан е резултатът от този експеримент. Обърнете внимание на разликата във външния вид на повърхностните колонии, които са големи и с кръгла форма, спрямо подповърхностните колонии, които са много малки и с неправилна форма, тъй като втвърдената среда инхибира разпространението на колонията в подповърхността.

Фигура 11. Примерен резултат с помощта на техниката на разпръснатата плоча. "Методът на Копакабана" беше използван за поставяне на смес от клетки Е. coli за скрининг експеримент. В този случай растежната среда (LB) съдържа X-Gal, така че тези клетки, експресиращи функционален ензим β-галактозидаза, образуват сини колонии, докато тези клетки с мутация в lacZ ген и по този начин не могат да експресират функционален ензим β-галактозидаза, образуват бели колонии. Често наричани "син/бял екран", двата типа колонии могат лесно да бъдат разграничени една от друга на една и съща чиния.

Фигура 12. Примерен резултат от анализ на плака с помощта на техника за наслагване с мек агар. Показани са плаки, образувани върху щама гостоприемник Mycobacterium smegmatis mc 2 155 (ATCC 700084) от два различни фага: (A) разрушители на микобактериофаг и (B) микобактериофаг MSSS. Тези фаги са изолирани от студенти в лабораторния курс MIMG 103L на UCLA през пролетта на 2010 г. M. smegmatis е непатогенна Actinobacterium и принадлежи към семейство микобактерии, което включва няколко патогени, за които е известно, че причиняват сериозни заболявания като туберкулоза (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) и проказа (M. leprae). Приблизително 50 μl от 10 -2 разреждане на Destroyers и 10 -3 разреждане на MSSS всяко бяха инкубирани с 500 μl от M. smegmatis за 20 минути при 37 ଌ, след което се смесва с MBTA (мек агар) и се излива върху плочи с MHA (твърд агар). След оставяне на мекия агар да се втвърди необезпокояван в продължение на 20 минути, блюдата се обръщат и се инкубират при 37 °С в продължение на 48 часа. Обърнете внимание на отделните морфологии на плаките, произведени от всеки фаг. Разрушителите (A) образуват малки (среден диаметър приблизително 1 mm), ясни плаки, характерни за литичен фаг, докато MSSS (B) развива големи плаки "биче око" с ясни центрове, заобиколени от мътен ореол (среден диаметър приблизително 3,2 mm) . Мъгливият пръстен може да се състои от бактерии, които са устойчиви на фагова инфекция. Този модел е различен от този, образуван от лизогенен фаг, който произвежда мътни плаки.

Фигура 13. Примерен резултат с помощта на процедура за копиране. Четири Pseudomonas щамове (P. aeruginosa, P. putida, P. fluorescens и P. stutzeri) бяха тествани в два екземпляра за растеж върху три различни въглеродни източника: ацетамид, лактоза и глицин. (A) Първичната плака е пълна среда (YTA), инокулирана с четирите щама, както е посочено. След инкубиране при 30 ଌ за 24 часа, всичките четири щама растат върху YTA. Първичната плоча се използва за копиране на плоча върху минимална среда (MSA), допълнена с един източник на въглерод: ацетамид (B), лактоза (C) и глицин (D). Последната плака от серията беше положителна контролна YTA плака (E). Както е показано, щамовете показват променливи модели на растеж след инкубация върху вторичните плаки. Имайте предвид, че понякога е трудно да се направи разлика между растеж и отпечатък от клетки. Например, сравнете отпечатъка, генериран от P. stutzeri върху трите MSA плаки до липса на растеж на същите три плаки от P. aeruginosa. И двете са отрицателни резултати в сравнение с моделите на растеж, показани от P. putida и P. fluorescens. Въпреки това, всички щамове растат върху положителната контролна плоча, потвърждавайки, че клетките са прехвърлени във всички вторични плаки в серията. Резултатите от този експеримент са представени в таблица маса 1.

 YTA (основно)MSA + ацетамидMSA + лактозаMSA + глицинYTA (контрол)
P. aeruginosa+---+
P. putida+++++
P. fluorescens+++++
P. stutzeri+---+

Маса 1. Резюме на резултатите от репликата на покритието. Растежът е посочен като знак плюс (+), а липсата на растеж е представена като знак минус (-). YTA е пълна среда (триптонов агар с дрожди), а MSA е минимална среда (агар с минимални соли). MSA плочите бяха допълнени с един източник на въглерод, както е посочено.


Дискусия

Метаболитните обменни взаимодействия възникват често между клетките, които растат в близост една до друга, тъй като метаболитите непрекъснато се освобождават от клетките по различни причини, като препълване на метаболизма, възстановяване на метаболитите, as wellਊs  export to�meta0x00x000 . При бактериите подгрупа от такива обмени на метаболити са от кооперативен характер в смисъл, че всички партньори по обмен печелят от тази ситуация (Oliveira et al., 2014), докато за по-голямата част от еукариотните организми стратегиите за обмен на метаболити остават неясни. Въпреки че дрождевите ауксотрофи са жизнеспособни в добавени и богати среди (Mülleder et al., 2012), при отсъствието на добавки с аминокиселини, те не успяват да допълнят метаболитните дефицити в няколко двойки или по-висок порядък в експерименти за съвместна култура (Фигура 1A B , [Müller et al., 2014 Shou et al., 2007]), ясна разлика с бактериалните изследвания, където подобни експерименти са били ефективни (Foster and Bell, 2012 Freilich et al., 2011 Harcombe, 2010 Pande et al. ., 2014 Ramsey et al., 2011 Vetsigian et al., 2011). Това доведе до спекулации, че дрождите може, за разлика от много бактериални видове, да нямат необходимия капацитет за износ, за да позволят обмен на междинни метаболити, свързани с растежа, като аминокиселини и нуклеобази (Shou et al., 2007). Анализирайки екзометаболома в колонията, ние обаче бихме могли да открием необходимите метаболити в действителност, открихме, че клетките в колонията са заобиколени от богат екзометаболом. Открихме също, че дрождите ефективно използват хранителните вещества, когато са налични, до степен, че разчитат единствено на тези извънклетъчни метаболити. Този резултат предполага, че обменът на метаболити между съвместно растящи дрождени клетки е често срещан по природа, поради което липсата на комплемент в експериментите за съвместна култура може да отразява ограничение на самия експеримент, а не да представлява капацитета за обмен на метаболити на дрождевите клетки.

За да заобиколим комбинирането на две или повече култури, ние избрахме подход на синтетичната биология и използвахме стохастичната загуба на плазмиди, за да въведем постепенно метаболитните дефицити в произволна комбинация от първоначално единична клетка. Прогресивната загуба на прототрофия позволява на клетките да поддържат клетъчния растеж на базата на обмен на метаболити, което води до общност със 73% ауксотрофия, която се увеличава до 97% при добавка с най-ограничаващия метаболит, урацил. Въпреки доминиращия си ауксотрофен състав, общността на SeMeCo може да поддържа див тип като екзометаболом, метаболитна ефективност, както и клетъчна жизнеспособност, което предполага, че този тип сътрудничество е стабилно физиологично свойство. Следователно капацитетът за износ и внос на естествени метаболити на дрождите е напълно достатъчни, за да поддържат съвместния растеж на базата на обмена на метаболити.

Създаването на SeMeCos също не беше улеснено от смесването на ауксотрофите в комбинация от по-висок ред. Това е в съответствие с идеята, че загубата на повече метаболитни гени намалява биохимичните способности и не добавя нови. Вместо това ключът на системата SeMeCo е да позволи прогресивното самоустановяване на общността, започвайки от единичната клетка (Фигура 2). Следователно регулаторните системи за метаболитна обратна връзка не инхибират износа на метаболити като цяло, но предотвратяват съвместния съвместен растеж, когато вече предварително установените съвместни култури са смесени (Müller et al., 2014 Shou et al., 2007). Възможна роля на тези механизми може би би могла да предотврати разпространението на чужди, потенциално измамни клетки, които произлизат от конкурентна дрождена колония. Бихме могли да повторим поведението, което е в полза на такова предположение, като поставим в SeMeCo клетъчна култура, притежаваща същия генотип като често срещана (HIS3 LEU2 ura3Δ MET15) и рядко (неговия3Δ leu2Δ URA3 MET15) генотип (Фигура 5А), наблюдавахме, че и двата генотипа бързо се изчерпват от предварително установения SeMeCo, независимо от честотата на съответния генотип в SeMeCo (Фигура 5—фигура добавка 1).

Изучаването на генотипния състав на SeMeCo предполага, че има определен набор от взаимодействия, лежащи в основата на свойствата на сътрудничещата общност, която поддържа подобен състав на популацията, включващ осем възпроизводимо концентрирани метаботипа, когато са установени независимо. Това показва, че този количествено дефиниран състав на общността е най-ефективен в метаболитното сътрудничество. Това откритие може да затвори важна празнина в разбирането на еволюцията на многоклетъчността. Ако определен състав е най-ефективен при кооперативния растеж, предимство при избора може да бъде осигурено от всякакъв вид физическо свързване, което може да поддържа партньорите за сътрудничество в определеното равновесие и би освен това осигуряват допълнителна защита срещу нахлуването на измамни типове клетки. Всъщност данните за екзометаболома предполагат, че броят на обменните взаимодействия на метаболити между съвместно растящите клетки може да бъде значителен. Екзометаболомът на колонията съдържаше огромен набор от биомолекули, включително по-голямата част от аминокиселини (Фигура 1C) (Castrillo et al., 2007 Paczia et al., 2012 Silva and Northen, 2015). Констатацията, че дрождевите клетки предпочитат усвояването пред синтеза на аминокиселини и урацил, дори когато са генетично прототрофни, показва, че обменните взаимодействия ще се установят лесно, след като клетъчната среда придобие критична концентрация на метаболити. Това има значение за тълкуването на метагеномни изследвания и експерименти с измама/благодетел, тъй като поради тази причина не може да се заключи от генетичното присъствие или отсъствието на един метаболитен път, или от проследяването на синтеза на един метаболит, колко други метаболити също се разменят.

Дори без селективно налягане, както дивия тип дрожди  , така и SeMeCo  установиха богат на аминокиселини екзометаболом на минимална среда (Фигура 1C) и участваха в усвояването на метаболити 1E (фигура 1E). Това предполага, че тези характеристики са естествено свойство на дрождите и повдига въпроса защо естествените дрождени съобщества не са съставени от съвместно растящи, генетични, ауксотрофи. За да се отговори на този въпрос, трябва да се има предвид, че притежаването на метаболитни гени в генома не е равно на това, че пътят е постоянно активен. Всъщност прототрофите могат гъвкаво да превключват от самосинтез към усвояване на аминокиселини (Фигура 1). Поради това, че са генетично прототрофни, дава по-високо ниво на метаболитна гъвкавост, тъй като прототрофните клетки могат да активират повторно синтетичен път, когато е необходимо. За разлика от SeMeCo, генотипът на клетката в естествена общност не отразява по същество нейния метаботип или нейната метаболитна роля в  . Освен това естественият жизнен цикъл на дрождите включва образуването на ендоспори, които са важни за издържането на гладуване и за разпространението между местообитанията. Без прототрофен генотип, една спора вече не може да създаде колония самостоятелно, тъй като генетичната ауксотрофия би прекъснала жизнения цикъл на дрождите. Второ, само част от естествения жизнен цикъл на дрождите протича при експоненциален растеж, който изисква изобилно снабдяване с въглехидрати и азот. Поддържането на прототрофен генотип както в S. pombe и в S. cerevisiae диви изолати (Jeffares et al., 2015 Liti et al., 2009) следователно е напълно съвместим с наличието на сложни механизми за обмен на аминокиселини и нуклеотиди.

Констатацията, че тези клетки напълно преминават от самосинтеза към поглъщане на хистидин, левцин, метионин и урацил, след като тези метаболити бъдат осигурени, има директни последици върху изследванията, използващи дрожди, първичен еукариотен модел организъм в изследвания в геномен мащаб. По-голямата част от генетичните експерименти с дрожди се провеждат в ауксотрофни щамове, изискващи състави с добавки с аминокиселини или богата среда. По този начин важни части от биосинтетичния метаболизъм (биосинтезата на аминокиселини може да представлява до 50% от метаболитния поток към биомасата) може да са останали безмълвни в значително количество експерименти с функционална геномика. По този начин ефектите от метаболитните–генетични взаимодействия върху клетъчната физиология могат значително да надхвърлят сегашните ни познания и могат да бъдат открити при преминаване към минимални хранителни добавки. В този контекст SeMeCos са лесни за работа, установяват се бързо и са лесни за анализ и следователно представляват ефективна и широко приложима еукариотна моделна система за изследване както на кооперативността, така и на ефектите от метаболизма в лабораторията.

В обобщение, използвайки хистидин, левцин, метионин и урацил като моделни метаболитни пътища за обменяеми метаболити, ние открихме, че S. cerevisiae клетките предпочитат поглъщането на тези хранителни вещества пред техния самосинтез и поддържат богат на аминокиселини екзометаболом в пространството на извънклетъчните колонии, индикатори  за продължаващ междуклетъчен �. Въпреки дрожди е известно да се провали в компенсиране на ауксотрофността на двойки и по-висока за съвместно култивиране експерименти, & # x000a0cells & # x000a0did & # x000a0successfully & # x000a0enter & # x000a0a & # x000a0state & # x000a0of & # x000a0 метаболитен кооперативно растеж при използване стохастичен плазмид разделяне, така че една клетка може прогресивно да се развие в сложна хетерогенна  общност. Съставени от ауксотрофни клетъчни типове, които са нежизнеспособни сами по себе си, общностите на SeMCo успяха да преодолеят метаболитните дефицити и да поддържат концентрации на метаболити и здравина, подобни на клетките от див тип. Освен това сътрудничеството е наложило различни метаболитни роли на допринасящите клетки. По този начин прогресивното формиране на общността разкрива, че дрождите притежават пълен капацитет за обмен на анаболни метаболити при подходящи за растежа количества и лесно установяватਊ неклетъчно-автономен метаболизъм в рамките на сложни, но дефинирани общностни структури.


  • Съставки за медийни рецепти (вижте страницата с медийни рецепти)
  • стерилни, полистиролни петриеви блюда. 100 x 15 mm е най-често срещаният размер, но размерите 60 и 35 mm също работят
  • стъклен контейнер, който ще побере поне два пъти по-голям обем от вашата медия
  • алуминиево фолио за покриване на контейнера за носители или пластмасова обвивка, ако използвате микровълнова фурна
  • автоклав, тенджера под налягане, микровълнова печка или котлон за стерилизиране на вашата среда (вижте страницата за стерилизиращи течности)
  • термоустойчиви ръкавици, горещи ръце или държачи за работа с горещи контейнери
  • 70% етилов или изопропилов алкохол
  • домакински почистващ препарат, 10% белина или дезинфекционни кърпички за почистване на работната ви зона
  • градуиран цилиндър за измерване на вода
  • везна за претегляне на твърди съставки
  • инструменти за работа с твърди съставки (като лодки за претегляне и лопатки или хартиени чинии и лъжици)

Бележки по биология за обратните мутации | Генетика

Посочената по-долу статия предоставя бележки за обратната мутация.

Когато мутация промени дивия тип нормален генотип в мутантен тип, както е по-често, събитието се нарича предна мутация. Това е в контраст с обратните мутации, при които мутантният генотип се променя в оригиналния див тип. В микроорганизмите ауксотрофите, връщащи се към прототрофи, се откриват лесно чрез поставяне на клетки от първоначално ауксотрофния щам върху минимална среда.

В бактериофаг Т4 rll мутантите (щамове, които причиняват бърз лизис на клетки-гостоприемници) често се връщат към дивия тип rll + щам. Известно е, че в Drosophila редица рецесивни мутантни гени се връщат към дивия тип, макар и с по-малка честота от предните мутации. Способността на мутантните гени да се връщат предполага, че мутацията поне в някои случаи не е постоянен, необратим процес.

Обратните мутации могат да възникнат по различни начини. При истинска обратна мутация, оригиналната последователност от базови двойки от дивия тип може да бъде възстановена. По този начин, ако GC двойка от дивия тип последователност бъде заменена с AT двойка, за да произведе права мутация, истинска обратна мутация може отново да замести GC двойка в тази позиция.

Понякога може да се вмъкне различна базова двойка на мястото на променената двойка, която е довела до предната мутация. По този начин, когато GC се заменя с AT, връщането може да се дължи на заместване с CG вместо GC. Това произвежда обратен фенотип, въпреки че неговата последователност се различава от дивия тип в единична базова двойка.

Понякога привидно обратна мутация се дължи на втора супресорна мутация, която потиска ефекта на първичната мутация, така че фенотипът изглежда като дивия тип. Може да има интрагенна супресия, когато втората мутация се появи в гена, носещ първата мутация, но в различно място. Или потискането може да бъде интергенно (екстрагенно), когато втората мутация е в различен ген.

И при двата типа потискане, втората супресорна мутация произвежда функционални продукти на гена, който носи първата или първичната мутация. Например да предположим, че ген А не е в състояние да произвежда протеин А поради мутация. Супресорна мутация в същия или в различен ген може да доведе до производството на протеин А, като по този начин обърне мутацията в ген А.

В случай на междугенна супресия, терминът супресорен ген означава гена, който има втора мутация, потискаща първичната мутация в друг ген. Продуктите на супресорните гени обикновено са компоненти на транслационната система, като супресорните молекули често са tRNA молекули.

При интрагенна супресия връщането към нормалния фенотип може да бъде причинено от делеция и вмъкване на единични нуклеотиди в същия ген. По този начин, ако рамката на четене на триплетите се измести поради еднократно изтриване, причиняващо първична мутация, рамката ще бъде възстановена, ако се случи едно вмъкване на мястото на втората мутация.

Само триплетите между делецията и вмъкването биха добавили неправилни аминокиселини, останалата част от веригата би била нормална. Ако мястото на втората мутация е близко до първата, броят на грешните аминокиселини ще бъде малък и ще се получи функционален протеин с пълна дължина.

Интергенното потискане от супресорни гени се дължи на промени в процеса на транслация. Повечето от супресорните гени са резултат от мутации в гените на tRNA и техните продукти са мутантни tRNA молекули. Има супресорни гени за мутации във всеки от трите крайни кодона на веригата, а именно кехлибар (UAG), охра (UAA) и опал (UGA).

Обикновено кехлибар, охра и опал са безсмислени мутации, разположени на места в съобщението и водят до фрагменти от полипептидни вериги. Супресорният ген за всяка безсмислена мутация позволява вмъкване на аминокиселина на мястото на безсмисления кодон и веригата не се прекъсва. Потискането на мутанти, завършващи веригата, се осъществява чрез четене на безсмисления кодон, сякаш е сетивен кодон.

Например, един вид кехлибарен супресор вмъква аминокиселината тирозин срещу безсмисления кодон UAG. Супресорният ген произвежда мутантна тирозин-специфична tRNA. Нормалната тирозинова тРНК има антикодон GUA и разпознава триплетите UAC и UAU в иРНК. Антикодонът в мутантната tRNA се променя на CUA, който се сдвоява с UAG и тирозинът се вмъква вместо веригата, завършваща преждевременно.

Друг пример илюстрира интергенното потискане в E. coli. Първична кехлибарена мутация в E. coli е променила базов триплет в безсмислен кодон UAG. Някои други клетки на E. coli, носещи същата мутация, имат интергенна кехлибарена супресорна мутация в ген, кодиращ серинова tRNA.

Супресорният ген произвежда мутантни tRNA молекули с променен антикодон, който може да разпознае AUG. По този начин супресорният ген може да вмъкне серин на мястото на безсмисления триплет AUG и могат да се образуват полипептидни вериги с пълна дължина. И двата UAG и UGA супресорите действат чрез промяна на антикодона в специфична tRNA и производство на мутантни супресорни tRNA. Механизмът на потискане на UAA не е напълно известен.

Генът за потискане на кехлибар също обяснява появата на условни мутанти в Т4 бактериофага. Установено е, че кехлибарените мутанти на Т4 растат върху един щам на E. coli (наречен разрешителен гостоприемник), но не и в друг щам (наречен ограничителен гостоприемник).

Това се дължи на факта, че разрешаващият щам на E. coli носи гена за потискане на кехлибар, който обръща ефекта на мутацията на кехлибар. Клетките на E. coli, които нямат кехлибарен супресорен ген, също показват кехлибарена мутация.


Как се идентифицират ауксотрофите в експеримент с реплика?

Кликнете, за да прочетете пълния отговор. Тогава как правите репликационно покритие?

Техниката включва натискане на диск, покрит с кадифе, и след това отпечатване на вторични плочи с клетки в колонии, отстранени от оригинала чиния от материала. Обикновено има голям брой колонии (приблизително 30-300). реплика с покритие поради трудността при разпределянето на всеки поотделно върху отделен чиния.

Знайте също, какво е ауксотрофен маркер? Ан ауксотрофен маркер след това се дефинира като алел от див тип на ген, който кодира ключов ензим за производството на есенциален мономер, използван в биосинтезата, Някои примери за често използваните ауксотрофни маркери в S. cerevisiae са URA3, LYS2, LEU2, TRI1, HIS3, MET15 и ADE2 (1).

Следователно, какво е ауксотроф и прототроф?

&xiά&nu&omega "да увеличи" &tau&rho&omicron&phiή "подхранване") е неспособността на организма да синтезира определено органично съединение, необходимо за растежа му (както е определено от IUPAC). Ан ауксотроф е организъм, който проявява тази характеристика ауксотрофни е съответното прилагателно.

Как бихте разграничили ауксотрофите и прототрофите в бактериална популация?

Ан ауксотроф изисква органичен растежен фактор, но а прототроф не, защото може да синтезира всички органични растежни фактори, от които се нуждае.


Гледай видеото: Практикум по микробиологии. Среды. Посев. Оценка колоний. Дисковая проба (Декември 2022).