Информация

8.5: Рестрикционни ензими - Биология

8.5: Рестрикционни ензими - Биология


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ДНК може да бъде отрязана рестрикционни ендонуклеази (RE). Ендонуклеазите са ензими, които могат да хидролизират полимера на нуклеиновата киселина чрез разрушаване на фосфодиестер връзка между фосфата и пентозата върху гръбнака на нуклеиновата киселина. Това е много силна ковалентна връзка, докато по-слабите водородни връзки поддържат своите взаимодействия и двойно верижна връзка.

Както подсказва името, рестрикционните ендонуклеази (или рестрикционни ензими) са „ограничен” в способността им да режат или смилат ДНК. Ограничението, което е полезно за биолозите, обикновено е палиндромен ДНК последователности. Палиндромните последователности са една и съща последователност напред и назад. Някои примери за палиндроми: СЪСТЕЗАТЕЛНА КОЛА, ГРАЖДАНСКИ, МЪЖ, ПЛАНИРАНЕ НА КАНАЛ ПАНАМА. По отношение на ДНК има 2 вериги, които протичат антипаралелно една на друга. Следователно обратното допълнение на едната нишка е идентично с другата. Молекулярните биолози също са склонни да използват тези специални молекулярни ножици, които разпознават палиндроми от 6 или 8. Чрез използване на 6 или 8 фрези последователностите се появяват в големи участъци рядко, но често достатъчно, за да бъдат полезни.

Рестрикционните ензими хидролизират ковалентните фосфодиестерни връзки на ДНК, за да оставят или „лепкави/сплотени“ краища, или „тъпи“ краища. Това разграничение при рязането е важно, защото an EcoRI лепкавият край може да се използва за съвпадение на парче ДНК, изрязано със същия ензим, за да се залепи или лигира обратно. Докато ендонуклеазите разрязват ДНК, лигази присъединете се отново към тях. ДНК, усвоена с EcoRI могат да бъдат лигирани обратно заедно с друго парче ДНК, усвоено с EcoRI, но не на парче, смляно с SmaI. Друг тъп нож е EcoRV с последователност за разпознаване на GAT | ATC.

EcoRI генерира лепкави сплотени краища SmaI генерира тъпи краища

Ограничение на храносмилането


Рестрикционни ензими

Рестрикционните ензими, рестрикционните ендонуклеази или молекулярните ножици са ензими, произведени от бактерии, които могат да се нарязват между две нишки на ДНК в области, наречени места за разпознаване. Рестрикционните ензими са открити за първи път през Enterobacteria coli изследвания. Ограничителните ензими тип II (REs) са от особено значение в областите на молекулярно клониране, секвениране на гени и ДНК картиране, тъй като тази група може да отреже ДНК много близо до специфични места за разпознаване и не изисква енергия под формата на АТФ.


Тихоокеанска северозападна национална лаборатория, Ричланд, Вашингтон

A. Massey & Associates, Чапъл Хил, Северна Каролина

Тихоокеанска северозападна национална лаборатория, Ричланд, Вашингтон

A. Massey & Associates, Chapel Hill, Северна Каролина

Резюме

Учениците се запознават с рестрикционните ензими и симулират активността на рестрикционните ензими с ножица. Те също са запознати с рестрикционни карти и са помолени да направят прости прогнози въз основа на карта. Ограничителните ензими първоначално са открити чрез способността им да разграждат чужда ДНК. Рестрикционните ензими могат да разграничат ДНК, нормално присъстваща в клетката, и чужда ДНК, като например инфектираща ДНК на бактериофаг. Те защитават клетката от инвазия, като разрязват чужда ДНК на парчета и по този начин я правят нефункционална. Ограничаващите ензими изглежда се произвеждат изключително от прокариоти. Действието на рестрикционните ензими се въвежда и моделира в активността ДНК ножици. Идеята за повторно присъединяване на рестрикционни фрагменти и необходимостта от взаимно допълване в едноверижните „опашки“ са въведени в ДНК ножицата на активността. Рестрикционните ензими и ДНК лигазата играят главни роли в клонирането на ДНК. Откриването на рестрикционни ензими даде на учените начин да нарязват ДНК на определени парчета. Всеки път, когато дадено парче ДНК се отрязва с даден ензим, се произвеждат същите фрагменти. Тези определени части могат да бъдат събрани отново по нови начини. Измислена е нова фраза, за да опише ДНК молекула, която е сглобена от различни изходни молекули: рекомбинантна ДНК. След рестрикционно смилане фрагментите от ДНК често се разделят чрез гел електрофореза. Главата представя и отговори на въпроси за упражнения.


Относителна активност на рестрикционни ензими в универсални и базални буфери

Нашите рестрикционни ензими са снабдени с оптимален универсален буфер (един от петте универсални буфера, посочени в синьо в таблицата по -долу). Относителната активност във всеки от другите универсални буфери се нормализира до оптималния буфер, където активността на всеки ензим в оптималния буфер се изразява като 100%. Стойностите в () показват буфери, които е вероятно да бъдат засегнати от звездна активност. За да се избегнат тези ефекти, се препоръчва използването на буфери, подчертани в синьо или розово.

Няколко специфични ензима (AccIII, BalI, BcnI, BglI, Bpu1102I, Cfr10I, Eco52I, NruI, PshBI, SnaBI, SspI, TaqI и VpaK11BI), всеки се доставя с базален буфер, специализиран за конкретния ензим. Съставите на тези базални буфери варират в зависимост от ензима.

Рестрикционен ензим Относителни дейности (%)
LМХКT + BSAбазал***
AatII & lt20 & lt20 & lt20 <20 100 120
AccI 20 100 & lt20 (& lt20) 160 80
AccII (260) 100 & lt20 20 200 160
AccIII (& lt20) (& lt20) 20 (80) (<20) 100
AfaI 60 60 40 60 100 100
AflII 20 80* & lt20 & lt20 140 120
AluI 100 100 & lt20 40 200 120
Aor13HI & lt20 20 & lt20 80 * 80 100
Aor51HI 80 100 & lt20 20 120 120
ApaI 100 <20 & lt20 <20 <20 120
ApaLI 100 20 <20 & lt20 120 120
AvaI (& lt20) 100 20 40 100 120
AvaII 80 100 <20 20 100 100
BalI 20 20 <20 & lt20 40 100
BamHI (<20) <20 40 100 (& lt20) 80
BanII (120) (120) 100 80 (100) 100
BcnI & lt20 20 40 60 60 100
BglI <20 <20 20 40 & lt20 100
BglII & lt20 20 100 (100) (60) 100
BlnI & lt20 20 40 100 20 120
BmeT110I <20 & lt20 20 100 & lt20 140
BmgT120I & lt20 <20 100 40 & lt20 240
Bpu1102I <20 & lt20 & lt20 40 60 100
BspT104I 100 60 & lt20 & lt20 100 120
BspT107I & lt20 20 80 100 20 100
Bsp1286I 100 20 & lt20 <20 60 100
Bsp1407I 20 60 20 20 100 100
BssHII 100 100 60 20 140 100
BstPI (& lt20) (60) 100 (100) (100) 100
BstXI & lt20 40 100 & lt20 & lt20 120
Bst1107I (& lt20) 60 100 100 40 100
Cfr10I (& lt20) (& lt20) (& lt20) 40 (20) 100
Кла 40 100 120 100 60 100
CpoI <20 <20 80 100 & lt20 100
Дра 100 100 60 100 80 80
EaeI 60 100 & lt20 <20 120 160
EcoO65I (20) (60) 60 * 40 40 100
EcoO109I 100 60 <20 & lt20 100 160
EcoRI (20) (100) 100 (120) (80) 120
EcoRV (<20) (40) 100 (120) (40) 100
EcoT14I (<20) (40) 100 120 (60) 100
EcoT22I <20 20 100 (140) (20) 120
Eco52I <20 & lt20 <20 & lt20 & lt20 100
Eco81I & lt20 100 & lt20 & lt20 100 160
FbaI (<20) (& lt20) (80) 100 (20) 100
Фоки (20) (60) & lt20 <20 (200) 100
HaeII 80 100 & lt20 80 140 100
HaeIII 60 100 100 60 100 100
HapII 100 60 & lt20 <20 100 80
HhaI 80 100 100 120 120 100
HincII 20 100 20 40 100 80
HindIII (60) 100 & lt20 200 (100) 80
HinfI 80 100 100 160 60 100
Hin1I 40 80* & lt20 20 60 160
HpaI <20 (40) 20 100 (80) 100
KpnI 100 60 & lt20 & lt20 (100) 80
MboI 20 40 60 100 40 100
MboII 100 60 & lt20 <20 60 100
MflI 100 80 & lt20 <20 80 100
MluI 60 60 100 (100) 60 100
MspI 80 80 & lt20 100 100 80
MunI (200) 100* <20 & lt20 160 100
MvaI (& lt20) (40) 80 100 (20) 120
NaeI 100 & lt20 <20 & lt20 100 120
NcoI (40) (60) 20 60* (60) 160
NdeI & lt20 40 100 100 80 100
NheI (120) 100 & lt20 <20 (160) 100
Не (& lt20) (& lt20) 20** & lt20 (& lt20) 100
NruI 0 & lt20 20 20 <20 100
NsbI 40 20 <20 60 100 100
PmaCI 100 80 & lt20 <20 100 100
PshAI 20 40 & lt20 100 60 160
PshBI (20) (40) 20 40 40 100
Psp1406I 20 60 <20 <20 100 100
PstI (& lt20) (60) 100 80 (20) 80
PvuI (<20) (20) (40) 80* (40) 120
PvuII (80) 100 40 & lt20 (40) 100
SacI 100 60 & lt20 & lt20 80 80
SacII 40 20 <20 <20 100 40
SalI <20 & lt20 100 (20) & lt20 120
Sau3AI (60) 80 100 & lt20 (80) 100
ScaI (& lt20) (& lt20) 100 (60) (& lt20) 100
SfiI (40) 100 <20 & lt20 100 100
SmaI & lt20 <20 & lt20 & lt20 100 100
Усмихнат & lt10 & lt20 100 40 & lt10 100
SnaBI (20) (40) & lt20 & lt20 (40) 100
SpeI (80) 100 80 100 (80) 100
SphI (20) (40) 100 120 (20) 100
Sse8387I (120) 60* & lt20 & lt20 (60) 100
SspI (& lt20) (60) 40 (100) (80) 100
StuI 60 100 60 80 140 100
TaqI 40 80 60 60 80 100
Tth111I (20) 80 40 100 (80) 120
Van91I <20 (20) 60 100 (60) 100
VpaK11BI & lt20 & lt20 60 (40) & lt20 100
XbaI <20 80* 20 <20 120 120
XhoI & lt20 60 100 160 60 100
XspI & lt20 60 <20 100 160 100

Синьо: буфер, доставен с рестрикционния ензим
Розов: алтернативен буфер, препоръчан за употреба

*+0,01% BSA &rarr 100% AflII, EcoO65I, FokI, Hin1I, MunI, NcoI, PvuI, SplI, Sse8387I, XbaI
** + 0,01% BSA + 01% Triton X-100 & rarr 100% NotI
*** Съставите на базалните буфери са ензимно-специфични.


Рестрикционни ендонуклеази

С над 40 години предлагане на рестрикционни ензими на изследователската общност, NEB си спечели репутацията на лидер в ензимните технологии. Работейки непрекъснато, за да бъде достоен за това отличие, NEB се стреми да разработва ензими с най -висока чистота и несравнима ефективност.

Всички рестрикционни ензими на NEB са преминали към нова буферна система. Посетете NEBCutSmart.com за повече подробности.

Удобство

  • Флакон с 6X Purple Load Dye е включен в повечето рестрикционни ензими.
  • Над 210 рестрикционни ензима са 100% активни в един буфер & ndash CutSmart & trade Buffer.
  • >190 рестрикционните ензими са квалифицирани за спестяване на време, което означава, че можете да усвоите ДНК за 5-15 минути или безопасно да усвоите ДНК за една нощ.
  • Изберете от & gt280 рестрикционни ензими, най -голямата селекция, налична в търговската мрежа.

Производителност

  • Изберете рестрикционен ензим с висока точност (HF & reg), който е проектиран за намалена звездна активност, бързо разграждане (5-15 минути) и 100% активност в CutSmart буфер. Към всеки HF рестрикционен ензим е включен флакон с 6X Purple Load Dye.
  • Всички наши рестрикционни ензими преминават строги тестове за контрол на качеството, гарантиращи най-високи нива на чистота и последователност от партида до партида.

Използвайте Enzyme Finder, за да изберете рестрикционни ензими по име, последователност, надвес или тип.


8.5: Рестрикционни ензими - Биология

Примери за рестрикционни ензими от клас II

от
Haemophilus aegytius

от
Haemophilus influenzae Rd

Рестрикционни ензими се получават от много прокариоти и са изолирани около 1500 ензима с известни места за разпознаване на последователности. Назоваването на тези ендонуклеази следва система, предложена от Nathans и Smith. Всяко име съдържа поне една главна и две малки букви, последвани от римска цифра. Буквите са инициали на рода и вида на произход, а числото представлява броя на ензимите, открити в организма. (Исторически цифрата идентифицира протеиновия пик, в който ензимът се елуира по време на хроматография.) Допълнителна информация може да бъде добавена като буква. За Eco RI R показва конкретния щам на E. coli.

Рестрикционните ензими от различни организми могат да разпознават една и съща ДНК последователност. Ако ензимите разпознават едно и също място и се разцепват на същото място, те се маркират изошизомери. Такива, които разпознават един и същ сайт, но се разделят на различни позиции, са хетерошизомери или неошизомери.

Пример за изошизомер

от
Streptomyces phaeochromogenes

от
Bacillus sp. Бу 17091

Пример за хетероизошизомер или неошизомер

от
Xanthomonas malvacea ром

Изо- или хетероизосхизомерите добавят гъвкавост към експерименталния дизайн. Разходите, чувствителността към метилиране и видовете "краища" са съображения, както и буферните условия за оптимална активност.

Няколко буферни условия отговарят на почти всички рестрикционни ензими, но нито един буфер не позволява активността на всеки ензим. Доставчиците на ензими винаги осигуряват реакционен буфер (10x концентрат), който е оптимален за ензима. Компонентите на 1x буфера обикновено са 10-100 mM Tris при рН 7,3 до 8,5, различни нива на соли като KCl и NaCl (10 до 150 mM), 10 mM Mg (2+), 2 mM бета-меркаптоетанол. Понякога 0,01% Triton-X100 (детергент) и говежди серумен албумин се включват като стабилизатори. (Като алтернатива може да се използва желатин от свински кожи и предлага предимствата, че е устойчив на автоклавиране и струва около 1/15 колкото BSA.)

Тъй като рестрикционните ензими могат да изискват различни буферни условия, трябва да се използва някаква стратегия за извършване на двойни смилания. Предпочитаният метод е едновременно смилане с двата ензима в съвместим буфер. Този метод може да се използва дори ако един ензим не е напълно активен (например, 75% активен). Могат да се добавят повече от един ензим (например 1 U ензим А + 1,33 U ензим В) за еднаква ефективност на рязане. Има ограничения за излишния ензим поради повишения глицерол в реакцията, което може да намали специфичността на някои ензими.

Алтернативен метод е да се усвои с ензима "ниско сол", след което да се добави още буфер и ензима с "висока сол", за да завършите усвояването. Това очевидно удвоява времето, необходимо за храносмилане. В крайни случаи ДНК може да се утаи след едно разграждане и да се разтвори във втория разграждащ буфер. Разграждането се извършва при 37 градуса С, освен ако не е посочено друго за ензима.

Ако се използват неоптимални условия, може да възникне неспецифична или отслабена специфичност на разцепване или "звездна" активност. Условията, които насърчават звездната активност включват:


Рестрикционен ензим

Нашите редактори ще прегледат изпратеното от вас и ще решат дали да преразгледат статията.

Рестрикционен ензим, също наричан рестрикционна ендонуклеаза, протеин, произвеждан от бактерии, който разцепва ДНК на специфични места по молекулата. В бактериалната клетка рестрикционните ензими разцепват чужда ДНК, като по този начин елиминират инфектиращите организми. Рестрикционните ензими могат да бъдат изолирани от бактериални клетки и използвани в лабораторията за манипулиране на фрагменти от ДНК, като тези, които съдържат гени, поради тази причина те са незаменими инструменти на технологията на рекомбинантна ДНК (генно инженерство).

Бактерията използва рестрикционен ензим за защита срещу бактериални вируси, наречени бактериофаги или фаги. Когато фаг заразява бактерия, той вмъква своята ДНК в бактериалната клетка, така че да може да бъде репликирана. Рестрикционният ензим предотвратява репликацията на фаговата ДНК, като я разрязва на много парчета. Рестрикционните ензими са кръстени заради способността им да ограничават или ограничават броя на щамовете бактериофаги, които могат да заразят бактерия.

Всеки рестрикционен ензим разпознава кратка, специфична последователност от нуклеотидни бази (четирите основни химични субединици на линейната двуверижна ДНК молекула-аденин, цитозин, тимин и гуанин). Тези региони се наричат ​​последователности на разпознаване или места за разпознаване и са разпределени на случаен принцип в цялата ДНК. Различните бактериални видове произвеждат рестрикционни ензими, които разпознават различни нуклеотидни последователности.

Когато рестрикционната ендонуклеаза разпознава последователност, тя прониква през молекулата на ДНК, като катализира хидролизата (разцепване на химическа връзка чрез добавяне на водна молекула) на връзката между съседни нуклеотиди. Бактериите предотвратяват разграждането на собствената им ДНК по този начин, като прикриват своите последователности на разпознаване. Ензимите, наречени метилази, добавят метилови групи (-СН3) към аденинови или цитозинови бази в рамките на разпознаващата последователност, която по този начин е модифицирана и защитена от ендонуклеазата. Рестрикционният ензим и съответната му метилаза съставляват системата за рестрикция-модификация на бактериален вид.

Традиционно се разпознават четири типа рестрикционни ензими, обозначени като I, II, III и IV, които се различават главно по структура, място на разцепване, специфичност и кофактори. Ензимите от тип I и III са сходни по това, че както рестрикционната, така и метилазната дейност се осъществяват от един голям ензимен комплекс, за разлика от системата от тип II, в която рестрикционният ензим е независим от своята метилаза. Ограничителните ензими от тип II също се различават от типове I и III по това, че те разцепват ДНК на специфични места в разпознаващото място, останалите разцепват ДНК на случаен принцип, понякога стотици бази от разпознаващата последователност. Няколко хиляди рестрикционни ензими тип II са идентифицирани от различни видове бактерии. Тези ензими разпознават няколкостотин различни последователности, обикновено с дължина от четири до осем бази. Рестрикционни ензими от тип IV разцепват само метилирана ДНК и показват слаба специфичност на последователността.

Рестрикционните ензими са открити и характеризирани в края на 60-те и началото на 1970-те от молекулярните биолози Вернер Арбер, Хамилтън О. Смит и Даниел Нейтънс. Способността на ензимите да отрязват ДНК на точни места позволи на изследователите да изолират съдържащи ген фрагменти и да ги рекомбинират с други молекули на ДНК-т.е., за клониране на гени. Имената на рестрикционните ензими произлизат от рода, вида и обозначенията на щама на бактериите, които ги произвеждат, например ензимът ЕкоRI се произвежда от Ешерихия коли щам RY13. Смята се, че рестрикционните ензими произхождат от общ протеин на предците и са еволюирали, за да разпознават специфични последователности чрез процеси като генетична рекомбинация и генна амплификация.

Редакторите на Encyclopaedia Britannica Тази статия е последно преработена и актуализирана от Кара Роджърс, старши редактор.


Ограничителни ензими: Видове & Примери

Една от най -важните стъпки в молекулярната биология, особено молекулярната генетика и анализ, е изолирането на ДНК от човешкия геном и създаването на много копия от него. Сега тези копия могат да се използват за по-нататъшен анализ от всякакъв вид.

Ключово събитие в развитието на методологията на молекулярната генетика е откриването на рестрикционните ензими, известни още като Рестрикционни ендонуклеази.

Въведение

А рестрикционен ензим е вид нуклеазен ензим, който е способен да разцепи двуверижна ДНК. Ензимите могат да разцепват ДНК на произволни или специфични последователности, които се наричат сайтове за ограничение. Местата за разпознаване са палиндромни по произход, тоест те са последователностите, които се четат еднакво напред и назад.

Тези рестрикционни ензими се произвеждат естествено от бактерии. Бактериалните видове го използват като форма на защитен механизъм срещу вируси. При бактериите обаче рестрикционните ензими присъстват като част от комбинирана система, наречена система за промяна на ограниченията. Бактериалните видове модифицират собствената си ДНК с помощта на ензими, които я метилират. Този конкретен процес на метилиране на бактериална ДНК я предпазва от разцепване от нейните собствени рестрикционни ендонуклеази.

Видове

Има два различни вида рестрикционни ензими:

  1. Екзонуклеази: рестрикционните екзонуклеази са основно отговорни за хидролизата на крайните нуклеотиди от края на ДНК или РНК молекула или от 5’ до 3’ посока или от 3’ до 5’ посока, например – екзонуклеаза I, екзонуклеаза II и др.
  2. Ендонуклеаза: рестрикционни ендонуклеази разпознават определени базови последователности (рестрикционни места) в молекулата на ДНК или РНК и катализират разцепването на вътрешната фосфодиестерна връзка за exEcoRI, Hind III, BamHI и др.

История

Първият рестрикционен ензим, който беше открит, беше Hind II през 1970 г. През 1978 г. Даниел Натанс, Вернер Арбер и Хамилтън О. Смит бяха удостоени с Нобелова награда за физиология или медицина.

Рестрикционна ензимна номенклатура

Самото име на рестрикционните ензими се състои от три части:

  1. Съкращение от рода и вида на организма до 3 букви, например- Eco за Escherichia coli, идентифицирано с първата буква E, от рода и първите две букви, co, от вида.
  2. Следва буква, номер или комбинация от двете, за да се обозначи щамът на вида.
  3. Римска цифра за обозначаване на реда, в който различните системи за ограничаване-модификация са открити в един и същ организъм или щам сам по себе си.

Класификация на рестрикционни ендонуклеази

Въз основа на идентифицираните типове последователности, естеството на разрезите, направени в ДНК, и ензимната структура, има три класа:

  1. Ограничителни ензими тип I,
  2. Ограничителни ензими тип II, и
  3. Рестрикционни ензими тип III.

А. Ограничителни ензими тип I

  • Рестрикционни ензими тип I притежават както рестрикционни, така и модификационни дейности. В този случай ограничението ще зависи от статуса на метилиране на целевата ДНК последователност.
  • Разцепването се извършва на почти 1000 двойки основи далеч от мястото на ограничение.
  • Структурата на мястото за разпознаване е асиметрична. Състои се от 2 части. Една част от мястото за разпознаване се състои от 3-4 нуклеотида, докато другата съдържа 4-5 нуклеотида. Двете части са разделени от неспецифичен спейсер от около 6-8 нуклеотида.
  • За своята функция, рестрикционните ензими тип I изискват S-аденозилметионин (SAM), АТФ и Mg 2+
  • Те са съставени от 3 субединици, специфична субединица, която определя мястото на разпознаване, рестрикционна субединица и субединица за модификация.

Б. Рестрикционни ензими тип II

  • Два отделни ензима медиират рестрикцията и модификацията. Отсега нататък ДНК може да се разцепи при липса на модифициращи ензими. Въпреки че целевата последователност, идентифицирана от двата ензима, е еднаква, те могат да бъдат пречистени отделно един от друг.
  • Нуклеотидите се отцепват само на мястото на рестрикция. Разпознаващата последователност е ротационно симетрична, наречена палиндромна последователност. Специфичното палиндромно място може да бъде или непрекъснато (напр., KpnI идентифицира последователността 5´-GGTACC-3´), или не непрекъснато (например, BstEII разпознава последователността 5´-GGTNACC-3´, където N може да бъде всеки нуклеотид)
  • Те изискват Mg 2+ като кофактор, но не и АТФ.
  • Те са необходими при генетично картографиране и реконструкция на ДНК in vitro само защото идентифицират определени места и се разцепват само на тези места.

Как работят:

  • Рестрикционните ензими тип II първо установяват неспецифичен контакт с ДНК и се свързват с тях под формата на димери.
  • След това целевата последователност се открива чрез комбинация от два процеса. Или ензимът дифундира линейно/ плъзга се по ДНК последователността на къси разстояния или скача/ скача на дълги разстояния.
  • След като се установи целевата последователност, в ензима, както и в ДНК, настъпват различни конформационни промени. Тези конформационни промени от своя страна активират каталитичния център.
  • Фосфодиестерната връзка се хидролизира и продуктът се освобождава.

Структури на свободни, неспецифични и специфични ДНК-свързани форми на BamHI

C. Тип III рестрикционен ензим

  • Ензимите от тип III разпознават и метилират една и съща ДНК последователност. Те обаче разцепват почти 24-26 базови двойки.
  • Те са съставени от две различни подединици. Разпознаването и модифицирането на ДНК се извършват от първата субединица- ‘M ’ и нуклеазната активност се оказва от другата субединица „R“.
  • Разцепването на ДНК се подпомага от ATP, както и от Mg 2+, докато SAM е отговорен за стимулиране на разцепването.
  • Само една от веригата на ДНК е разцепена. Въпреки това, за да се счупи двойно-верижната ДНК, са необходими две места за разпознаване в противоположни посоки.

Звездна дейност

Някои рестрикционни ензими са способни да разцепват местата за разпознаване, които са подобни, но не идентични с определената разпознаваща последователност при нестандартни реакционни условия (ниска йонна сила, високо рН).

Изошизомери, неошизомери и изокаудомери

  • Изошизомери са рестрикционните ензими, които разпознават и разцепват на едно и също място за разпознаване. Например, SphI (CGTAC/G) и BbuI (CGTAC/G) са изошизомери един на друг.
  • Неошизомери са рестрикционните ензими, които разпознават едно и също място и имат различен модел на разцепване. Например, SmaI (GGG/CCC) и XmaI (G/GGCCC) са неошизомери един на друг.
  • Изокаумери са рестрикционните ензими, които разпознават малко различни последователности, но произвеждат едни и същи краища. Например, Sau3a и BamHI изобразяват лепкав край на 5’-GATC-3 ’, въпреки че и двата имат различни последователности на разпознаване.

Модели на разцепване

Моделите на разцепване на HindIII, SmaI, EcoRI и BamHI са описани по-долу. Повечето ензими разпознават последователности с дължина от 4 до 6 двойки основи. Те обаче могат да бъдат с дължина до 8 базови двойки.

Процесът на разцепване на ДНК от рестрикционния ензим завършва с образуването на лепкави или тъпи краища.

Фрагментите с тъп край могат да бъдат свързани с фрагмента на ДНК само с помощта на линкери и адаптори.


Тихоокеанска северозападна национална лаборатория, Ричланд, Вашингтон

A. Massey & Associates, Chapel Hill, Северна Каролина

Тихоокеанска северозападна национална лаборатория, Ричланд, Вашингтон

A. Massey & Associates, Chapel Hill, Северна Каролина

Институционално влизане
Влезте в Wiley Online Library

Ако преди това сте получили достъп с личния си акаунт, моля, влезте.

Купете една глава
  • Неограничен преглед на статията/главата в PDF и всички свързани добавки и фигури.
  • Статия/глава може да бъде отпечатана.
  • Статия/глава могат да бъдат изтеглени.
  • Статия/глава може не бъдат преразпределени.

Резюме

Учениците се запознават с рестрикционните ензими и симулират активността на рестрикционните ензими с ножица. Те също са запознати с рестрикционни карти и са помолени да направят прости прогнози въз основа на карта. Рестрикционните ензими първоначално са открити чрез способността им да разграждат чужда ДНК. Рестрикционните ензими могат да разграничават ДНК, нормално присъстваща в клетката, и чужда ДНК, като например инфектиране на ДНК на бактериофаг. Те защитават клетката от инвазия, като разрязват чужда ДНК на парчета и по този начин я правят нефункционална. Изглежда, че рестрикционните ензими се произвеждат изключително от прокариоти. Действието на рестрикционните ензими се въвежда и моделира в активността ДНК ножици. Идеята за повторно присъединяване на рестрикционни фрагменти и необходимостта от взаимно допълване в едноверижните „опашки“ са въведени в ДНК ножицата на активността. Рестрикционните ензими и ДНК лигазата играят главни роли в клонирането на ДНК. Откриването на рестрикционни ензими даде на учените начин да нарязват ДНК на определени парчета. Всеки път, когато дадено парче ДНК се изрязва с даден ензим, се получават същите фрагменти. Тези определени части могат да бъдат събрани отново по нови начини. Нова фраза е измислена, за да опише ДНК молекула, която е била събрана от различни изходни молекули: рекомбинантна ДНК. След рестрикционно смилане, фрагментите на ДНК често се разделят чрез гел електрофореза. Главата също така представя отговори на въпроси за упражнения.


8.5: Рестрикционни ензими - Биология

Резюме на статията:

Какво представляват рестрикционните ензими?

Рестрикционните ензими или да се използва правилното им наименование, рестрикционните ендонуклеази са вид ензим, който има способността да „изрязва“ молекулите на ДНК. Те често се наричат ​​"генетични ножици".

Рестрикционният ензим разпознава уникална последователност от нуклеотиди в ДНК веригата, която обикновено е с дължина между четири и шест базови двойки. Безплатната ДНК верига има същата последователност, но в обратна посока, като по този начин се гарантира, че и двете нишки на ДНК се отрязват на едно и също място.

Къде се намират рестрикционните ензими?

Рестрикционните ензими се намират в много различни щамове бактерии и тяхната биологична цел е да участват и подпомагат активно в защитата на клетките. Тези ензими предотвратяват и "ограничават" (оттук и името им) всяка чужда, т.е. вирусна ДНК, която може да влезе в клетката, като я унищожи. Клетката гостоприемник има вградена рестрикционно-модификация система, която метилира собствената си ДНК на места, специфични за съответните й рестрикционни ензими, като по този начин я предпазва от саморазцепване.

Как се използват рестрикционните ензими в биотехнологиите?

Във връзка с биотехнологията, рестрикционните ензими се използват за разрязване на ДНК на по-малки вериги, за да се изследват разликите и приликите в дължината на фрагмента между индивидите, като например при полиморфизъм на дължината на ограничителния фрагмент (RFLP) или при клониране на гени. Такива техники са били използвани, за да се определи, че индивиди или групи от индивиди имат отличителни различия в генните последователности и моделите на ограничаване на разцепването в специфични области на генома. Основата за ДНК отпечатъци е взета от тези знания. Процесите на RFLP и клониране на гени зависят от използването на електрофореза с агарозен гел, за да се позволи пълно и точно разделяне на фрагментите на ДНК.

Какви видове рестрикционни ензими съществуват?

Има три различни типа рестрикционни ензими, наречени просто тип I, тип II и тип III.

Тип I. рестрикционни ензими отрязват ДНК на произволни места, отдалечени на 1000 или повече базови двойки от мястото за разпознаване.

Тип III рестрикционни ензими, нарязани на приблизително 25 базови двойки от мястото за разпознаване.

Рестрикционните ензими тип I и тип III изискват енергия под формата на аденозин трифосфат (АТФ) и могат да съществуват като по-големи ензими, състоящи се от множество субединици.

Въпреки това, Тип II ензими, като тези, които се използват предимно в биотехнологиите, нарязват ДНК в рамките на разпознатата последователност, без да е необходим АТФ, и са по -малки и по -малко сложни от типове I и III. Рестрикционните ензими от тип II получават специфични имена според това от кои бактериални видове са изолирани. Като пример, рестрикционният ензим тип II, изолиран от Е. Coli, е наречен EcoR1.

Ограничителните ензими от тип II са в състояние да създадат два различни типа нарязване, което зависи от това дали отрязват и двете нишки в центъра на разпознаващата последователност, или всяка нишка по -близо до единия край на разпознаващата последователност. Първият разрез ще генерира „тъпи краища“, без нуклеотидни надвеси, докато вторият разрез генерира „лепкави“ или „сплотени“ краища, поради факта, че всеки получен фрагмент от ДНК има надвес, който комплиментира останалите фрагменти. И двата вида се използват широко в биотехнологиите, особено в областта на молекулярната генетика и процесите на инженерно протеиново производство.

Биотехнологията използва способността на рестрикционните ензими да разцепват надеждно и прецизно ДНК в специфични последователности, което доведе до широкото използване на тези генетични инструменти в много техники на молекулярната генетика. Рестрикционните ензими могат да се използват за картографиране на ДНК фрагменти или на целия геном, като по този начин се определя специфичният ред на сайтовете на рестрикционните ензими в генома. Рестрикционните ензими също често се използват за проверка на идентичността на специфичен фрагмент от ДНК, въз основа на известната последователност от сайтове на рестрикционни ензими, която той съдържа.

Изключително важно използване на рестрикционни ензими е генерирането на рекомбинантни ДНК молекули. Това са молекули на ДНК, които се състоят от гени или фрагменти от ДНК от два различни организма. Обикновено малка кръгла ДНК молекула, известна като плазмид, получена от бактерии, се свързва с друго парче ДНК от друг интересен ген.

Рестрикционни ензими тип II се използват в няколко точки по време на този процес. Те се използват за смилане на ДНК от експерименталния организъм, за да се подготви ДНК за клониране. След това бактериален плазмид или бактериален вирус се разцепва с ензим, който дава съвместими краища. Тези съвместими краища могат да бъдат затъпени без надвес или да имат допълващи се надвесени последователности. ДНК от гена, който представлява интерес, се комбинира с ДНК от плазмида или вируса и двата типа ДНК са свързани с ензим, наречен ДНК лигаза.

За автора / Допълнителна информация:

Важен отказ от отговорност: Всички статии на този уебсайт са само за обща информация и не са професионален или експертен съвет. Ние не носим никаква отговорност за коректността или автентичността на информацията, представена в тази статия, или каквато и да е загуба или нараняване в резултат на това. Ние не подкрепяме тези статии, нито сме свързани с авторите на тези статии, нито носим отговорност за тяхното съдържание. Моля, вижте нашия раздел за отказ от отговорност за пълни условия.


Гледай видеото: Koje namirnice pomažu u jačanju imuniteta? (Декември 2022).