Информация

Активност на глюкокиназата

Активност на глюкокиназата


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

От Solomon et al, 2013 ACC Synthetic biology и от този видеоклип:

Тук има 2 конкуриращи се реакции за глюкоза - една с glk като ензим и друга с gdh като ензим.

На графиката оста y е добивът на глюконат, а оста x е glk активност. Логично, тъй като активността на glk се увеличава, добивът на глюконат трябва да намалее.

Такъв е случаят с по -голямата част от графиката. Но защо първоначално има увеличение на производството на глюконат (когато активността на glk е някъде между 0,2 и 0,27)?


Първо нека да видим какво искат да постигнат тези момчета: Те искат да използват бактерии за направата на определени продукти. За да направят това, те искат да експлоатират бактериалния метаболизъм на етапи, при които няма алтернативни пътища. Една от тези стъпки е първата стъпка на гликолизата, когато глюкозата се фосфорилира до глюкозо-6-фосфат (G6P). При бактериите фосфорилирането се извършва по време на вноса на глюкоза в клетката чрез "фосфоенолпируват (PEP): въглехидратна фосфотрансферазна система", която използва фосфоренолпируват като източник на фосфати. Това има недостатъка, че в клетката почти няма свободна глюкоза, а най -вече G6P.

За да преодолее този проблем, групата експресира алтернативни транспортери (които транспортират глюкозата в клетката) и глюкокиназа (Glk), за да позволят на клетките да оцелеят. Тези стъпки отделят вноса и фосфорилирането на глюкозата и водят до свободна глюкоза вътре в клетката. Тази безплатна глюкоза вече може да се използва по различни методи. Той също така позволява гликолиза, тъй като Glk фосфорилира глюкозата, която след това влиза в пътя на гликолиза. Glk се поставя под различни промотори, за да се направят различни мутанти, за да се тества как различната експресия на Glk влияе върху жизнеспособността на клетките.

За да внесат друг ензим, който също метаболизира глюкозата, те използват глюкозна дехидрогеназа (Gdh), която се експресира от плазмид със силен, индуцируем от IPTG промотор. След това те използваха различни концентрации на IPTG, за да тестват ефекта върху производството на глюконат и клетъчната жизнеспособност (няма да се занимавам с това).

Фигурата по -горе е фигура 5 от хартията и показва ефекта от трите различни концентрации на IPTG, използвани за индуциране на експресията на Gdh. За 10 и 25 uM IPTG добивът на глюконат става все по-малък, колкото по-висока става Glk активността. Само намалената активност показва по -нисък добив. Това е напълно различно за най -високата концентрация, но тук клетките вероятно се объркват от високата експресия на Gdh (която също консумира много енергия).

В статията те не дават обяснение или поне обсъждат поведението на добива на глюконат при най -малката активност на Glk (бих искал да прочета коментарите на рецензентите по този въпрос). От данните бих очаквал по-високо производство. Възможно е по-ниското производство на енергия (ниските количества G6P означава малка гликолиза) да има отрицателни странични ефекти върху клетките. Възможно е също така, че Gdh се инхибира при по -ниски Glk активности от някои други вещества в клетката. Активността на Gdh например се инхибира от по-високи концентрации на нуклеотидтрифосфати (АТФ и т.н.), вижте тук. Тъй като Glk се нуждае от ATP като кофактор, би било възможно концентрацията на ATP при по-ниски Glk активности да има отрицателен ефект върху Gdh активността (моите собствени спекулации).

Или това е просто някакъв артефакт от експеримента. Това има някои точки, които могат да бъдат критикувани (бих искал да видя коментарите на рецензенти и тук). Първо лентите за грешки са доста големи, така че това също може да бъде малко по -различно. В текста те споменават, че данните са получени от

поне 2 паралелни култури в представителен експеримент

Очаквам още няколко повторения (поне три независими експеримента), което би направило данните по -надеждни. Тогава (и тази точка е много по -важна) те не могат да измерват активността на Glk и Gdh в една и съща култура поради ограничения в системата за откриване. Измерванията на активността на Glk използват свързана система, която в крайна сметка измерва промяната на концентрацията в NADH, докато Gdh използва NADPH като кофактор. И двете версии не могат да бъдат разграничени чрез измерване на спектър, така че измерванията на активността на Glk могат да се извършват само в нетрансфектирани клетки. Тъй като изразът променя условията в клетката (а ние не знаем как), бих очаквал поне някаква дискусия за него, но липсва.


Краткосрочен контрол на глюкокиназната активност: роля на регулаторен протеин

Глюкокиназата е една от четирите хексокинази, присъстващи в тъканите на бозайници. Той се експресира в два типа клетки, които трябва да реагират на промените в концентрацията на кръвната захар, чернодробните паренхимни клетки и β-клетките на панкреатичните островчета. Първите са отговорни за метаболизма и съхраняването на важна част от погълнатата глюкоза, докато вторите отделят инсулин в отговор на повишаване на нивото на кръвната захар. Една от основните характеристики на глюкокиназата е, че тя има относително нисък афинитет към глюкозата и показва положителна кооперативност за този субстрат, въпреки факта, че е монометен ензим. Освен това, за разлика от други хексокинази, той не се инхибира от микромоларни (физиологични) концентрации на глюкоза 6-фосфат, а от регулаторен протеин, който трансдуцира ефекта на фруктоза 6-фосфат и на фруктоза 1-фосфат. Целта на този преглед е да се опишат тези аспекти на регулирането на глюкокиназата.-Van Schaftingen, E., Detheux, M., Veiga da Cunha, M. Краткосрочен контрол на ролята на глюкокиназната активност на регулаторен протеин. FASEB J. 8: 414-419 1994.


ПЕРСПЕКТИВНА статия

  • 1 Програма за транслационни биомедицински науки, Висше училище, Охайо, Атина, Охайо, САЩ
  • 2 Diabetes Institute, Heritage College of Osteopathic Medicine, University Ohio, Athens OH, САЩ
  • 3 Катедра по биомедицински науки, Коледж по остеопатична медицина на наследството, Университет Охайо, Атина, Охайо, САЩ

Бета-клетките на панкреаса са единствените клетки в тялото, които могат да синтезират и отделят инсулин. Чрез процеса на стимулирана от глюкоза секреция на инсулин, бета-клетките освобождават инсулин в кръвообращението, стимулирайки GLUT4-зависимото усвояване на глюкозата в периферната тъкан. Инсулинът обикновено се секретира в импулси, които насърчават сигнализирането в черния дроб. Много преди диабет тип 2 да бъде диагностициран, бета-клетките стават свръхчувствителни към глюкоза, което води до нарушена пулсация и свръхстимулация на нивата на глюкоза на гладно. Получената хиперсекреция на инсулин може да причини лошо сигнализиране и клирънс на инсулина в черния дроб, което води до хиперинсулинемия и инсулинова резистентност. Продължителната свръхактивност може в крайна сметка да доведе до изтощение на бета-клетки и неуспех, в който момент започва диабет тип 2. За да се предотвратят или обърнат негативните ефекти от свръхстимулацията, бета-клетъчната активност може да бъде намалена. Клиничните проучвания разкриха потенциала на бета-клетъчната почивка да обърне новите случаи на диабет, но лечението няма трайни ползи. В тази перспектива предлагаме интервенция, която намалява свръхактивната глюкокиназна активност в бета-клетката. Глюкокиназата е известна като глюкозен сензор на бета-клетките поради високия си контрол върху секрецията на инсулин. Следователно, гликолитичната свръхактивност може да е причина за хиперинсулинемия в началото на заболяването и може да бъде намалена, за да се възстанови нормалното свързване на стимул-секреция. По -рано съобщавахме, че намаляването на глюкокиназната активност в преддиабетните миши островчета може да възстанови пулсацията и да засили секрецията на инсулин. Въз основа на тази контраинтуитивна констатация, ние преглеждаме значението на пулсиращата секреция на инсулин и подчертаваме как нормализирането на глюкозното усещане в бета -клетките по време на преддиабетна хиперинсулинемия може да възстанови пулсацията и да подобри глюкозната хомеостаза.


Резултати

Глюкокиназата взаимодейства с аргинин в β-клетките

За да се оцени степента, в която аргининът поддържа GSIS, NIT-1 β-клетките бяха предварително култивирани в среда, изчерпана с аргинин, за 30 минути. След това към средата се добавя глюкоза и се анализира инсулиновата секреция (фиг. 1а). Изчерпването на аргинин значително притъпява GSIS от NIT-1 β-клетки. Интересното е, че приложението на G6P индуцира дозо-зависима секреция на инсулин както със, така и без изчерпване на аргинин (Фиг. 1б). Увеличаването на вътреклетъчния G6P чрез прилагане на G6P беше потвърдено чрез масспектрометрия (допълнителна фигура 1а, б). По този начин аргининът е необходим за секрецията на инсулин в отговор на глюкоза, но не и на G6P, което показва, че аргининът може да играе роля за производството на G6P от GCK в β-клетки.

а, б Глюкоза-6-фосфат (G6P) спаси намаляването на секрецията на инсулин при липса на Л-аргинин в NIT-1 клетки. В присъствието на Л-ингинирана от аргинин, глюкоза и G6P секреция на инсулин. В отсъствието на Л-аргинин, само G6P (отворен кръг в б), но не и глюкоза (отворен кръг в а) индуцирана секреция на инсулин. Данните представляват средната стойност ± S.E. (н = 4). ° С Приготвяне на имобилизирани с аргинин магнитни наноперла 18 . Епоксидни групи върху FG перли се аминолизират от NH4OH и свързано с EGDE. Епоксидните групи бяха повторно аминолизирани с NH4ОХ. След това зърната се свързват с карбоксилни групи на Л-аргинин в DMF, съдържащ EDC, триметиламин и DMAP (допълнителна фиг. 1). д Глюкокиназата се свързва с Л- аргинин и глюкоза директно. Глюкокиназа, произведена в клетка HEK293, трансфектирана с глюкокиназа-НА експресионен вектор, се смесва с аргинин или имобилизирани с глюкоза перли, използвайки перли без аргинин или глюкоза като отрицателна контрола. И двете Л-аргинин и глюкоза свързват глюкокиназа-НА. д Глюкокиназа-НА, свързана с имобилизирана глюкоза, се елуира чрез Л-аргинин и глюкоза. Глюкокиназа-НА свързана с Л-аргининови мъниста се елуират от Л-аргинин, но не чрез глюкоза. е Глюкокиназата се локализира съвместно с инсулин в секреторната гранула, а не в ендоплазмения ретикулум (ER) и апарата на Голджи в NIT-1 клетките. Глюкокиназа (зелено), инсулин (магента), ER (магента, KDEL), цис- Голджи (пурпурно, GM130) и ядрото (синьо) бяха оцветени и обединените снимки бяха показани в долната част. Глюкокиназата показва висока колокализация с инсулин и по -малко колокализирана с ER и мрежата на Голджи, което показва, че глюкокиназата се локализира главно в секреторните везикули. Мащабна лента 20 μm.

По-рано демонстрирахме, че PFK1, PFK2 и HXK1 в клетъчния екстракт на HeLa са аргинин-свързващи протеини, използвайки технологията на имобилизирани с аргинин магнитни наногранули (фиг. 1в, допълнителна фигура 1 и реф. 18). Като се има предвид, че PFK1/2 и HXK1 са ензими на гликолиза 22,23, аргининът може да служи като ключов регулатор на гликолизата. По този начин, ние предположихме, че аргининът също свързва GCK и функционира като активатор на GCK в β-клетки. Когато се тества с помощта на имобилизирани с глюкоза или аргинин магнитни наноперла (фиг. 1в, допълнителна фигура 1 и реф. 18), GCK се свързва както с глюкоза, така и с аргинин (фиг. 1d). След това тествахме дали глюкозата и аргининът се конкурират за свързването на GCK с имобилизираните магнитни наногранули (фиг. 1д). GCK, свързан с имобилизирана глюкоза, се елуира от глюкоза и аргинин, въпреки че свързването на GCK с имобилизирания аргинин се конкурира по-малко от глюкоза (Фиг. 1e), което показва по-силно свързване на GCK с аргинин, отколкото с глюкоза. След това вътреклетъчната локализация на GCK беше анализирана с имунохистохимия в NIT-1 клетки (фиг. 1f). GCK сигналът се слива главно с инсулин в секреторните везикули и частично с проинсулин в ER в съгласие с предишния доклад 24,25.

Л-Аргининът стимулира производството на G6P и секрецията на инсулин

Фигура 1 колективно показва, че аргининът насърчава GSIS чрез директно взаимодействие с GCK. Като следваща стъпка анализирахме дали аргининът променя активността на GCK в NIT-1 β-клетките. Администриране на глюкоза или Л-аргинин към NIT-1 клетки повишава G6P, но стереоизомер д-аргининът не успява да увеличи G6P (фиг. 2а). Интересното е, че индуцирането на инсулинова секреция, разглеждано като разлика в секрецията на инсулин при 0,5–1,5 минути при 7 mmol/l глюкоза, е по -бързо след Л-прилагане на аргинин в сравнение с д-аргинин (фиг. 2б). Л-Аргининът стимулира инсулиновата секреция по -силна от д-аргинин в присъствието на глюкоза, но не и в отсъствие на глюкоза (без аргинин и фиг. 2в, г). GCK обвързан с Л-аргининът се елуира от Л-аргинин, но не от д-аргинин, показващ само това Л-аргинин взаимодейства с GCK (фиг. 2д). Взети заедно, Л-аргинин стереоспецифично свързва GCK, увеличава съдържанието на G6P и насърчава секрецията на инсулин. Трябва да се отбележи, че глюкозо-независимата секреция на инсулин може да бъде стимулирана и от двете Л- и д-аргинин, който вероятно се дължи на UGGT1, друг аргинин-свързващ протеин, който се свързва и с двете Л- и д-аргинин (допълнителна фигура 2a-d) 26 .

а Л-Аргинин (2 mmol/l) и глюкоза (7 mmol/l) стимулират производството на G6P в NIT-1 β-клетки, но стереоизомер д-аргинин (2 mmol/l) не индуцира производството на G6P. Данните представляват средната стойност ± S.E. (н = 6). б Един mmol/l Л-индуцираната от аргинин инсулинова секреция е малко повече от един mmol/l д-аргинин действа в NIT-1 β-клетките. Л- или д-аргинин са приложени на Л-нарушени с аргинин NIT-1 клетки. Данните представляват средната стойност ± S.E. (н = 3). *стр < 0,05 (н = 6). ° С В присъствието на глюкоза, Л-аргинин стимулира инсулиновата секреция повече от д-аргинин. При липса на глюкоза и двете Л- и д-аргинин стимулира секрецията на инсулин по подобен начин. Данните представляват средната стойност ± S.E. (н = 3). *стр & lt 0,05 (н = 6). д Един mmol/l Л-аргинин увеличава глюкозо-зависимата инсулинова секреция. Данните представляват средната стойност ± S.E. (н = 3). *стр & lt 0,05 (н = 6). д Глюкокиназа, свързана с Л-аргинин, но не се свързва с д-аргинин. Трябва да се отбележи, че UGGT1 се свързва с Л- и д-аргинин (допълнителна фигура 2а и справка 26).

Три глутаматни остатъка участват в сигнализирането на аргинин

За идентифициране на остатъците в GCK, които са необходими за свързване с Л-секреция на аргинин и инсулин, стимулирана от Л-аргинин, пет мутанта на GCK (Y214C, E256K, A456V, E157T и E443Δ) бяха приготвени и анализирани (Фиг. 3 и Допълнителна Фиг. 3). Остатъците бяха избрани въз основа на мутации на пациента MODY2 11,26,27,28,29,30 и предишната ни статия, показваща взаимодействието на катионната аминокиселина аргинин с кисел глутамат 26. Див тип и свързан с E443Δ GCK Л-аргинин силно свързващ се с Л-аргинин почти не се наблюдава за E256K и E157T GCK мутанти (Фиг. 3а и Допълнителна Фиг. 3а, б). Когато секрецията на инсулин в отговор на Л-аргинин е сравнен за всичките пет мутанта, секрецията на инсулин е нарушена за три GCK мутанта, а именно E256K, A456V и E443Δ (фиг. 3b). По този начин остатъкът E256 изглежда е критичен и за двете Л-свързване с аргинин и Л-индуцирана от аргинин инсулинова секреция. От друга страна, остатъкът E443 е необходим за Л-индуцирана от аргинин инсулинова секреция, но не и за свързване на Л-аргинин към GCK. Въпреки че E443Δ не беше достатъчен за предотвратяване на свързването на Л-аргинин към GCK, ние отбелязахме, че има група от Е остатъци (E442 и E443) в С-крайната област на GCK 26. Използвайки данни за структурата на GCK (ref. 31, PDB-1V4S и 1V4T), ние предвидихме триизмерната позиция на тези три E остатъка (E256, E442 и E443) върху GCK протеина (допълнителна фигура 3c, d) и открихме че тези остатъци създават структура, подобна на порта, която може да служи като свързващ джоб за Л-аргинин. Следователно, ние направихме троен мутант E256/442/443R (Фиг. 3e–g) и открихме, че този GCK мутант показва подчертано увреждане на свързването на аргинин (Фиг. 3e), увеличаването на G6P от Л-аргинин (фиг. 3е) и индуцирана от аргинин инсулинова секреция (фиг. 3ж). Взети заедно, E256, E442 и E443 остатъци от GCK участват в Л-свързване с аргинин и секреция на инсулин.

а Глюкокиназните мутанти E256K, E440/442/3R и E442* показват намалено свързване с Л-аргинин-имобилизирани мъниста, когато се анализират няколко глюкокиназни протеини (допълнителна фигура 2б). б NIT-1 клетки, експресиращи мутанти на E256K, E443Δ и A456V-глюкокиназа, показват намалена инсулинова секреция в отговор на Л-аргинин в сравнение с тези, експресиращи WT глюкокиназа. Данните представляват средната стойност ± S.E. (н = 3, а и б). ° С, д Три глутаматни остатъка от E256, E442 и E443 на глюкокиназа са разположени в близост и образуват портална структура за свързване на Л-аргинин въз основа на структурните данни на протеина глюкокиназа (PDB-1V4S 31). Нарушено свързване на аргинин (д), Производство на G6P (е) и секрецията на инсулин (g) в NIT-1 клетки, експресиращи E256/442/443R мутантна глюкокиназа. Данните представляват средната стойност ± S.E. (н = 3). *стр & lt 0,05 (н = 6, е и g).

Нарушена секреция на инсулин при пациенти с E442* MODY2

Проверихме 489 японски пациенти с MODY за вариантите на GCK, които включват E442 и E443, и идентифицирахме субект с вариант GCK E442* (допълнителни фигури 3a, S4a и справки 27,28,29). Когато се тества субект с GCK E442* вариант (фиг. 4a, b и допълнителна фигура 4b) и двама други здрави субекта, субектът E442* показва по-ниска стойност за оценка на хомеостатичния модел на β-клетка (фиг. 4а) . Пациентът с вариант на GCK E442* показва по -ниска секреция на инсулин по време на гладно. В тест за толерантност към аргинин, вариантът E442* показва по-ниско съотношение С-пептид към глюкоза (реф. 32 и фиг. 4б), което показва нарушена секреция на инсулин в отговор на аргинин. Когато се експресират в NIT-1 клетки, E442* и подобни E442/443R GCK мутанти показват намалена аргинин-индуцирана инсулинова секреция (фиг. 4в), GSIS (допълнителна фиг. 4в) и нива на G6P в присъствието на аргинин (фиг. 4г). Нашите данни от субекта на GCK E442* и подобни мутанти, изследвани в NIT-1 клетки, предполагат това Л-аргинин модулира GCK-зависимата инсулинова секреция, което не е очевидно от група мутации, изследвани от проучването на Pueyo 16 .

Оценка на хомеостатичен модел на β-клетка (HOMAβ, а) и съотношението С-пептид към глюкоза (б) бяха редуцирани при субект с мутация на Е442* глюкокиназа в сравнение с две контроли с WT глюкокиназа. По -ниският HOMAβ показва намалена способност за отделяне на инсулин след състояние на гладно (а). Съотношението С-пептид към глюкоза е един от маркерите, демонстриращи ефективност на инсулиновата секреция 32 (б). ° С Л-индуцираната от аргинин инсулинова секреция е намалена в NIT-1 клетки, които експресират E442* и E442/3R мутантна глюкокиназа чрез трансфектиране с pCDNA-GCK-HA и инсулинови експресионни вектори. д Производство на G6P в отговор на Л-аргинин се редуцира в NIT-1 клетки, които експресират E442* и E442/3R мутантна глюкокиназа чрез трансфектиране с pCDNA-GCK-HA и инсулинови вектори. Данните представляват средната стойност ± S.E. (н = 3). *стр < 0,05 (н = 6).

Аргининът предпазва GCK от убиквитиниране и разграждане

След това се обърнахме към механизъм, чрез който свързването на аргинин с GCK повишава нивата на G6P в β-клетките. Отбелязахме, че GCK има убиквитин взаимодействащ мотив (UIM 33,34) в С-терминала 35,36 близо до остатък E442. Не наблюдавахме никаква разлика в общите убиквитинирани протеини в лизатите в присъствието или отсъствието на аргинин, когато убиквитинираните протеини бяха открити с помощта на експресионен вектор на убиквитин-Myc (Фиг. 5а). Въпреки това, убиквитинираният GCK се наблюдава само след изчерпване на аргинина (фиг. 5а), което показва, че аргининът предотвратява убиквитинирането на GCK. Като се има предвид, че нивото на аргинин в кръвта намалява по време на (продължително) гладуване, освобождаването на аргинин от GCK може да увеличи медиираната от убиквитин протеолиза на GCK, когато наличността на глюкоза и необходимостта от секреция на инсулин са намалени по време на гладуване. Дванадесетчасовото третиране на NIT-1 клетки с протеазомен инхибитор MG132 повишава нивото на WT GCK приблизително десет пъти, но не променя нивото на E256K мутантния протеин (фиг. 5b). Инсулиновата секреция, индуцирана от Л-аргининът също се повишава в присъствието на MG132 в NIT-1 клетки, експресиращи WT GCK, но не и тези, експресиращи E256K (допълнителна фигура 5а). Данните показват, че

90% от WT GCK се разгражда за 24 часа в подкрепа на хипотезата, че изчерпването на аргинин ускорява разграждането на GCK чрез убиквитиниране. Изглежда обаче, че наличието на ниски нива на GCK е достатъчно за увеличаване на секрецията на инсулин в отговор на Л-аргинин, показващ, че директното взаимодействие между Л-аргинин и GCK рязко повишава GSIS (допълнителна фиг. 5b, c). След това, за да разгледаме как се ускорява убиквитинирането на GCK в отсъствието на аргинин, ние тествахме ролята на цереблон, единствената убиквитин лигаза на Е3, индуцируема от лекарството (талидомид и неговите аналози, имуномодулиращи имидни лекарства) сред повече от 500–1000 убиквитин Е3 лигази при хора 19,20,21. В клетките на HEK293, в които цереблонът е бил нокаутиран, открихме, че цереблонът е незаменим за наблюдение на убиквитиниране на GCK (фиг. 5в и допълнителна фиг. 5г). С помощта на анализ на мутагенезата се установява, че два лизинови остатъка от К458 и К459 са отговорни за цереблон-зависимото убиквитиниране, което се редуцира с аргинин (Фиг. 5г). Мутацията на K458/459R предотвратява убиквитинирането в отсъствието на аргинин, което показва, че тези остатъци са отговорни за аргинин-зависимо убиквитиниране от 26 лизинови остатъка в GCK (фиг. 5d). Когато клетките на HEK293 бяха трансфектирани с GCK, убиквитин и цереблон експресионни вектори, и двете експресии на GCK, определени от Western blot и съдържанието на G6P намаляха за 4 часа при изчерпване на аргинин в WT експресиращи клетки, докато и двете нива останаха непроменени в E256K експресиращи клетки (фиг. 5д , е). В допълнение, ЛПоказано е, че -аргинин намалява взаимодействието между GCK и цереброн (фиг. 5g). Освен това, Л-аргинин стимулира активността на GCK in vitro (фиг. 5h и допълнителна фиг. 5д). Взети заедно, изглежда, че церебронът се свързва с GCK в отсъствието на аргинин и убиквитинира GCK, докато приложението на аргинин дисоциира GCK от цереблон и насърчава фосфорилирането на глюкозата от GCK за индуциране на инсулинова секреция (допълнителна фигура 5f).

а Аргининът инхибира убиквитинирането на глюкокиназа. NIT-1 клетките бяха трансфектирани с убиквитин-Myc експресионен вектор и подложени на изчерпване на аргинин. Екстракти от лизат, контрол и глюкокиназа-IP се визуализират с анти-Myc антитяло. б Двадесет и четири часа инкубиране с протеазомен инхибитор MG132 предотвратява намаляването на WT глюкокиназата, но има малък ефект върху експресията и нивото на убиквитиниране на E256K мутантна глюкокиназа. ° С Убиквитинирането на глюкокиназа-HA се наблюдава в WT HEK293 клетки, но не и в цереброн KO HEK293 клетки. Редукцията на цереблон в цереблон KO клетки е показана в допълнителна фигура 5а. д K458 и K459 остатъци от глюкокиназа са необходими за аргинин-редуцируемо и цереброн-зависимо убиквитиниране в отсъствието на аргинин. NIT-1 клетки, трансфектирани с WT, E442* или K458/459R, глюкокиназни експресионни вектори заедно с церебрлон-FLAG и убиквитин-Myc експресионни вектори се инкубират в среда, изчерпана с аргинин. Изчерпването на аргинин намалява протеина глюкокиназен протеин (д) и дейност (е). Данните представляват средната стойност ± S.E. (н = 3). *стр & lt 0,05 (н = 6). g Аргининът инхибира взаимодействието на глюкокиназа и цереблон. з Аргининът увеличава производството на G6P чрез рекомбинантния глюкокиназен протеин в безклетъчната система. (н = 6).


РЕЗУЛТАТИ

GK-маркиран GK е каталитично активен, когато се експресира в MIN6.

Преходна трансфекция на MIN6 с GK, маркиран с GFP или в NH2- или COOH-терминалът се свързва с имунореактивност към GK при 62–64 kDa, както се очаква, и със 7- до 10-кратно увеличение на GK активността, потвърждавайки, че GFP-маркираният GK е каталитично активен (Фиг. 1А). Тъй като флуоресцентната микроскопия показа голяма междуклетъчна хетерогенност в експресията на GFP след преходна трансфекция, ние генерирахме стабилни неклонални клетъчни линии чрез G418 селекция. GK активността, предоставена от GK, маркирана с GFP, е стабилна по време на ранните пасажи (& ltp9), но намалява в по-късните пасажи (Фиг. 1Б). По същия начин човешката GK-иРНК намалява с прогресивно преминаване (пет до осем пъти между р9 и р19). Експресията на ендогенна (миша) GK-иРНК е подобна в GK GFP и GFP GK клетъчни линии (съответно 125 и 93%), както в нетрансфектираната MIN6. Афинитетът на GK към глюкоза (mmol/l) е сходен в екстракти от GK GFP и GFP GK клетки (8.9 ± 0.3 и 8.9 ± 0.8, съответно), както при MIN6 свръхекспресиращ не маркиран GK с аденовирусен вектор (8.5 ± 0.6). По подобен начин се увеличава с GKA (32) в клетъчните линии (2.3 ± 0.3 и 2.1 ± 0.1), както в нетрансфектирания MIN6 (2.8 ± 0.3), което показва, че GFP етикетът не компрометира афинитета към глюкозата или активирането от GKA .

Ефекти от активирането на GK и свръхекспресията върху инсулиновата секреция.

Индуцираната от глюкоза инсулинова секреция е подобна в GK GFP и GFP GK клетъчни линии, както при нетрансфектиран ранен пасаж MIN6 (Фиг. 2А). Инсулиновата секреция в β-клетки зависи от активността на GK (36) и от диференцираното състояние, което в MIN6 намалява с преминаването (37). Клоналните клетъчни линии, трансфектирани само с GFP, се считат за неподходяща контрола, тъй като показват по -голямо увеличение на ниските Км хексокиназа с увеличаване на преминаването от GFP GK клетъчните линии, което показва по -голяма дедиференциация (резултатите не са показани). Обратно, нетрансфектираният ранен пасаж MIN6 може да представлява по-диференцирано състояние от GFP GK клетъчните линии, което би могло да обясни подобната глюкозо-индуцирана инсулинова секреция (Фиг. 2А). За да се изследва ефектът от активността и концентрацията на GK върху инсулиновата секреция независимо от броя на преминаванията или диференцираното състояние на MIN6, ние сравнихме ефекта от титрираната аденовирусна свръхекспресия на немаркиран GK с фармакологично активиране на GK. Докато свръхекспресията на GK има малък ефект върху секрецията на инсулин, независимо от концентрацията на глюкоза (фиг. 2А), GKA предизвика голяма стимулация при 3 mmol/l глюкоза (фиг. 2Б). Подобни резултати са получени, когато се определя инсулиновата секреция в миши островчета. GKA предизвика 2,6-кратна стимулация (P & lt 0.01), докато свръхекспресията на GK (потвърдена чрез имуноблотинг) няма значителен ефект (фиг. 2° С).

Подклетъчно местоположение на GK химери, маркирани с GFP в MIN6 и хепатоцити.

Колокализацията на GK с инсулинови гранули в панкреатичните β-клетки е показана чрез имунофлуоресцентна микроскопия (38–41) (Фиг. 3А), електронна микроскопия (38,41) и субклетъчно фракциониране (31). За да се определи дали GKP-маркиран GK се колокализира с инсулинови гранули, GFP GK клетъчни линии и MIN6 клетки, временно трансфектирани с GFP GK, се оцветяват за инсулин (червено) и се визуализират чрез конфокална микроскопия. Ендогенният GK показва ясна колокализация с ендогенен инсулин (Фиг. 3А), докато GFP GK преходно изразена показва незначителна колокализация (фиг. 3Б) и стабилно експресираният GFP GK показва частична колокализация с инсулин (фиг. 3° С).

Когато GK GFP и GFP GK конструкциите бяха временно трансфектирани в хепатоцити, и двата протеина се натрупват в ядрото по време на инкубация с 5 mmol/l глюкоза (резултатите не са показани), което показва, че GFP етикетът не пречи на свързването с ядрения GKRP, в съгласие с предишни констатации с NH2-терминален GFP етикет (42).

Ефект на MG132 върху експресията на GK химери, маркирани с GFP.

Тествахме дали намаляването на експресията на трансгена в късните пасажи може да бъде предотвратено чрез инхибиране на протеозомната деградация с помощта на MG132. MG132 няма ефект нито при нетрансфектиран MIN6, нито при MIN6, свръхекспресиращ белязани GK, но повишава активността на GK и имунореактивността (64 kDa) в GK GFP клетъчните линии (Фиг. 4А). За да проверим дали това повишаване на активността на GK и имунореактивността се дължи на инхибиране на разграждането на протеини, ние определихме ефекта на MG132 в присъствието на циклохексимид за инхибиране на протеиновия синтез. Въпреки че активността на GK намалява в присъствието на циклохексимид, това намаление не е предотвратено от MG132, изключвайки ефект върху разграждането на протеините (Фиг. 4Б). MG132 причинява голямо увеличение на човешката GK иРНК в GFP GK клетъчните линии (100- до 200-кратно) (Фиг. 4° С). Това беше премахнато от транскрипционния инхибитор, актиномицин D (фиг. 4° С), което показва, че MG132 повишава експресията на трансген. MG132 е използван в останалата част от изследването за увеличаване на експресията на трансген.

Фармакологично активиране на GK.

Предишни ензимни кинетични проучвания върху пречистени слети GST-GK протеини показаха, че V62M и G72R мутанти имат по-ниски С0.5 за глюкоза, отколкото див тип GK и не са активирани от GKA (24,25). Определихме афинитета към глюкозата на GFP V62M и GFP G72R в клетъчни екстракти от клонални клетъчни линии, предварително култивирани с MG132 (виж по -горе). И двата мутанта имаха по-ниско С0.5 за глюкоза от див тип (див тип, 9,0 ± 1,0 V62M, 5,2 ± 0,4 G72R, 4,6 ± 1,0 mmol/l) и нито един от тях не е бил значително активиран от GKA (32) (фиг. 5А° С). Няма ефект на MG132 върху афинитета към глюкозата (фиг. 5д).

GK активност и имунореактивност на GFP V62M и GFP G72R в клонални клетъчни линии.

Каталитичната активност и GK имунореактивността на мутантите бяха определени в клоналните клетъчни линии GFP V62M и GFP G72R и сравнени с две клонални клетъчни линии, експресиращи див тип GFP GK (WT3B и WT10B). GK активността, имунореактивността и иРНК се определят след предварителна култура със или без MG132, което причинява голямо увеличение на трансгенната иРНК, GK протеина и активността (Фиг. 6А° С). GFP V62M и GFP G72R имат по-ниска GK активност от клонингите от див тип (Фиг. 6д), когато се експресира спрямо имунореактивност или иРНК (фиг. 6Е и Ф). Няма значителна разлика в GK имунореактивността спрямо нивата на тРНК за двата мутанта в сравнение с клонове от див тип, което предполага нестабилност на каталитичната активност, но не и имунореактивен протеин.

Изследвания на преходна трансфекция с GFP V62M и GFP G72R.

Съотношението активност към имунореактивност също беше определено след преходна трансфекция на MIN6 с променливи количества плазмиди на GFP GK (див тип), GFP V62M и GFP G72R (Фиг. 7А и Б). Графиците на GK активност срещу имунореактивност показват по-ниско съотношение активност към имунореактивност както за GFP V62M, така и за GFP G72R в сравнение с GFP GK от див тип (Фиг. 7° С), което е в съответствие с констатациите от клоналните клетъчни линии.

Ефектът на GKA (35) върху секрецията на инсулин се определя в MIN6, които са или нетрансфектирани, или преходно трансфектирани с GFP конструкции. GKA се увеличи (P & lt 0,05) инсулинова секреция при 5 mmol/l глюкоза при всичките четири тествани състояния (нетрансфектирани, 1,7 ± 0,2 до 2,7 ± 0,1 GFP GK, 1,8 до ± 0,1 до 3,6 ± 0,1 GFP V62M, 1,7 ± 0,1 до 3,0 ± 0,1 и GFP G72R , 1,5 ± 0,1 до 3,7 ± 0,2 μg · h −1 · mg протеин -1).

Стабилизиране на GK чрез чернодробни PFK2/FDP2 и GKRP.

GK свързващите протеини PFK2/FDP2 и GKRP модулират GK активността съответно в β-клетките на панкреаса и черния дроб. Затова тествахме дали мутантите показват променено активиране или стабилизиране, когато тези протеини са хетерологично експресирани в MIN6 клетки. Експресията на PFK2/FDP2 с помощта на аденовирусен вектор в клоналните клетъчни линии повишава активността на GK в дивия тип клонинги и в GFP V62M, но не и в GFP G72R или в нетрансфектираните клетки (Фиг. 8А). Липсата на ефект в нетрансфектираните клетки може да се дължи на насищащ ефект на ендогенния PFK2/FDP2 върху ендогенния GK.

Свръхекспресията на чернодробния GKRP протеин води до малко, но значително увеличение на GK активността в дивия тип GFP GK, но не и в мутантните клетъчни линии или в нетрансфектиран MIN6 (Фиг. 8Б). Взаимодействието на мутантите с GKRP също се тества чрез преходна трансфекция на GFP конструкции в хепатоцити. За разлика от GFP GK, който се натрупва в ядрото при 5 mmol/l глюкоза и се премества в цитоплазмата при 25 mmol/l глюкоза, нито GFP V62M, нито GFP G72R се натрупват в ядрото при 5 mmol/l глюкоза (фиг. 8° С).


Съдържание

Глюкокиназата (GK) в чернодробните клетки фосфорилира глюкозата, подготвяйки я за включване в гликоген или за гликолиза. During periods of ample glucose supply, most GK activity can be found in the peripheral cytoplasm where glycogen synthesis is occurring. [5] As the glucose supply declines during periods of fasting, GK activity in the cytoplasm diminishes. GKRP participates in this modulation of GK activity and location by binding free cytoplasmic GK as glucose levels decline, and moving it into the nucleus, where it is held in reserve in an inactive form. [6] As glucose and insulin levels rise, as during digestion of a meal, GK is released from GKRP and moves back to the cytoplasm, where much of it associates with the bifunctional enzyme. [7]

In hepatocytes of various mammals, GKRP has always been found in molar excess of the amount of GK, but the GKRP:GK ratio varies according to diet, insulin sufficiency, and other factors. Free GKRP shuttles between the nucleus and the cytoplasm. It may be attached to the microfilament cytoskeleton. [8]

GKRP competes with glucose to bind with GK, but inactivates it when bound. In conditions of low glucose, GKRP then pulls the GK into the nucleus. Rising amounts of glucose coming into the hepatocyte prompt the GKRP to rapidly release GK to return to the cytoplasm.

GKRP itself is subject to modulation. Fructose and sorbitol can both be converted to fructose-1-phosphate, which inhibits GKRP and frees GK. [1] Fructose 6-phosphate binds to the same site of GKRP, but enhances the ability of GKRP to bind and inactivate GK. In contrast, phosphorylation of GKRP by AMP-activated protein kinase, induced by elevated levels of AMP, reduces its capacity to inactivate GK. [9]

A presence and role of GKRP in other organs and tissues beyond the liver remains uncertain. Some researchers have finding small amounts of GKRP, or at least RNA coding for it, in small amounts in certain rat lung cells, in pancreatic islet cells, and in periventricular neurons of the hypothalamus in rats, [10] but physiological function and significance in these organs are unknown.

GKRP was originally discovered in rat liver. GKRP was found to serve a similar function in livers of mice and humans as well as other animals. [11] Cats are unusual in lacking GK activity, and have also been found to lack GKRP, though the genes for both GK and GKRP can be identified in the feline genome. [12]

Many mutant forms of human GK are associated with impaired or amplified insulin secretion or action, resulting in higher or lower blood glucose levels, and either diabetes (MODY2) or hyperinsulinemic hypoglycemia, respectively. Some of these variants have altered interaction with GKRP, which may contribute to the hyperglycemia. [13] [14] [15] [16]

The glucokinase of "knockout mice" who lack GKRP has a reduced expression and is entirely found in the cytoplasm. The knockout mice do not respond rapidly to glucose, exhibiting impaired glucose tolerance. [17] Mutations of the GKRP gene (GCKR) in humans have been sought as possible causes of monogenic diabetes (MODY), but no examples have yet been discovered. However, variant forms of GCKR have been found to be associated with small differences in levels of glucose, insulin, triglycerides, C-reactive protein, and higher or lower risks for type 2 diabetes mellitus. [18] [19] [20] [21]

Activators of GK are being investigated as possible medicines for type 2 diabetes. One of the mechanisms of activation may be protection from binding by GKRP. [22]


Molecular mechanism of catalysis: critically dependent on sulfhydryl groups

The sulfhydryl groups of several cysteines surround the glucose binding site. All except cys 230 are essential for the catalytic process, forming multiple disulfide bridges during interaction with the substrates and regulators. At least in the beta cells, the ratio of active to inactive glucokinase molecules is at least partly determined by the balance of oxidation of sulfhydryl groups or reduction of disulfide bridges.

These sulfhydryl groups are quite sensitive to the oxidation status of the cells, making glucokinase one of the components most vulnerable to oxidative stress, especially in the beta cells.


Correlation Between the Presence of GCK and Glucose Response by Cells Contributing to Glucose Homeostasis

Many different, functionally specialized glucose sensing cell types have evolved to assure blood glucose is maintained within a narrow, physiologically safe range of 4𠄸 mM. These cells complement each other in providing continuous measure and adjustment of the concentration of glucose in blood. We hypothesize that GCK is the primary glucose sensor utilized for maintaining glucose homeostasis, i.e., GCK is responsible for sensing blood glucose not only by β-cells but also by other cells involved in regulating blood glucose. In the case of α-cells, a recent and striking advance was made by specifically deleting GCK from the α-cells in mice, the deletion resulting in substantial loss of glucose induced suppression of glucagon release (Basco etਊl., 2018). The resulting hyperglucagonemia causes overactive glucagonogenesis, consistent with metabolism of glucose by GCK having a central role in α-cell function in glucose homeostasis. The authors conclude that glucose sensing is by GCK and that downstream signaling in α-cells is similar to that of β-cells: increased glucose increases the [ATP]/[ADP] ratio leading to closure of ATP-regulated K + channel and membrane depolarization. In α-cells, however, depolarization leads to voltage-dependent inactivation of voltage-gated Na + channels involved in action potential firing. Diminution of action potential height decreases activation of the P/Q Ca 2+ channels that mediate Ca 2+ entry, and this decreases glucagon release. Note that Le Marchand and Piston (2012), have provided evidence that glucose induced suppression of glucagon secretion does not involve decreased intracellular [Ca 2+ ].

Pancreatic δ-cells respond to increased glucose by releasing somatostatin which acts locally as a paracrine inhibitor of insulin and glucagon release rather than a systemic hormone (Boden etਊl., 1981, Gylfe, 2016 Rorsman and Huising, 2018). Glucose sensing by δ-cells most likely involves GCK for sensing as indicated by substantial expression of the gene as measured by single cell RNA-seq. It should be noted that pancreatic α-, β-, and δ-cells have a common progenitor cell (Sosa-Pineda etਊl., 1997 Gradwohl etਊl., 2000 Chung and Levine, 2010) which could help explain the obvious similarities in their glucose sensing pathways. δ-cells also respond directly to a physiological amino acid mixture independently of glucose, perhaps the consequence of membrane depolarization caused by sodium co-transport being sufficient to reach the threshold for secretory response (Boden etਊl., 1981 Rorsman and Huising, 2018).

Similar GCK-dependent sensing paths have been proposed for glucose excited (GE) and glucose inhibited (GI) neurons of the CNS. Dunn-Meynell etਊl. (2002) reported that GCK mRNA is expressed in norepinephrine neurons of locus ceruleus, and in hypothalamic neuropeptide Y, pro-opiomelanocortin, and γ-aminobutyric acid neurons. Moreover, in GE neurons intracellular Ca 2+ oscillations were inhibited and in GI neurons Ca 2+ oscillations were stimulated by four selective GCK inhibitors. Lamy etਊl. (2014) studied GLUT2-expressing excitatory neurons (GE) in the nucleus of tractus solitarius of the vagus nerve. These neurons form a distinct population of hypoglycemia-activated neurons. The authors concluded that glucose is sensed through GCK because hypoglycemia decreases energy state and increases [AMP]. Increased [AMP] then activates AMP-dependent protein kinase and this suppresses a K + leak current, hyperpolarizes the cells, and increases afferent electrical activity. Similar results have been presented for GI neurons of the hypothalamic arcuate nucleus (Burdakov etਊl., 2005 Routh, 2010 Hussain etਊl., 2015). There are a large number of different types of neurons for which glucose sensitivity has been reported (Levin etਊl., 2004 Jordan etਊl., 2010 Thorens, 2012 Lamy etਊl., 2014 Steinbusch etਊl., 2015, 2016) and in most of these neurons glucose sensing appears to be through GCK, although orexin neurons of the hippocampus are apparently an exception (see section on alternate glucose sensors).

GCK has also been implicated in glucose sensing in the anterior pituitary gland of rat and monkey (Zelent etਊl., 2006 Sorenson etਊl., 2007). GCK activity was measured spectrophotometrically in whole pituitary extracts and identified as a generalized cytoplasmic staining co-localized in cells with follicle-stimulating hormone (FSH) or luteinizing hormone (LH). In addition to gonadotropes, GCK was observed in a minor subpopulation of corticotropes and thyrotropes (Sorenson etਊl., 2007). It is puzzling, however, that in gonadotropes of the cynomolgus monkey GCK appeared to be clearly confined to cytosolic substructures, tentatively identified as Golgi complex (Sorenson etਊl., 2007). Pulsatile stimulation of the gonadotropes FSH and LH is mediated by GNRH released from GNRH neurons of the preoptic nucleus, which in turn are regulated by hypothalamic Kisspeptin neurons. GNRH receptor activation results in phospholipase C activation, IP3 mediated ER-calcium release causing secretion of the hormones (Stojilkovic etਊl., 2005). It remains to be tested whether, and if so how, glucose might influence these cells as they control puberty and/or reproduction. Nutrient supply profoundly influences reproductive biology, and GCK-dependent glucose regulation at the level of the pituitary might play a hitherto not considered role. Note that in the case of gonadotropes, glucose sensing might influence the release of FSH and/or LH which would impact glucose homeostasis directly чрез sex steroids or indirectly through increased nutrient consumption due to the pubertal growth spurt or pregnancy.

A case can also be made that GCK is the glucose sensor for cells in the adrenal gland which secrete epinephrine and corticosteroids to counteract hypoglycemia. Three lines of evidence support this contention. A rather mild form of hypoglycemia, observed clinically, later found to be caused by an activating mutation of GCK (M197 T?), was initially diagnosed as adrenal insufficiency. The patient was treated for 12 years with a maintenance dose of 10 mg cortisol to ameliorate hypoglycemia symptomatology (Morishita etਊl., 2017). After reevaluation of the original diagnosis, steroid treatment was discontinued because hypertension had developed and adrenal insufficiency was discounted. It is noteworthy that this particular GCK mutation increases activity of the enzyme only moderately as indicated by a thorough kinetic analysis (Sayed etਊl., 2009). It is therefore not unreasonable to hypothesize the clinical presentation resulted from complex additive effects of GCK activation that involved altered glucose sensing by both pancreatic α- and β-cells as well as cells of the adrenal gland. This interpretation is strengthened by a recent demonstration of GCK mRNA in mouse adrenal glands (see Supplement figure in Steinbusch etਊl., 2016) and immunohistochemical data indicating GCK is present in cells of the human adrenal gland (online Human Atlas showing histochemical staining of GCK).

These examples illustrate that each cell type having a role related to blood glucose levels expresses GCK and there is evidence that glucose is sensed through the activity of GCK. Our hypothesis predicts that all utilize similar metabolism to couple GCK activity to energy state and their metabolic response to changes in glucose concentration closely approximate those in pancreatic α- and β-cells and in glucose sensing neurons. The mechanism and metabolism related to glucose sensing is similar for all of the cells, while differences in coupling of energy state to membrane permeability, specific hormone and/or neurotransmitter released determining outcome and role in glucose/energy metabolism regulation. Examples of how similar changes in energy state elicit different cell specific responses have been presented for β-cells, α-cells, and glucose sensing neurons.

It is also important that GCK is absent or very low in cells and tissues that do not serve as glucose sensors as defined. These cells express hexokinase instead of GCK and the higher affinity for glucose (0.05𠄰.2 vs 1.5� mM, (Cárdenas, 2004)) results in cellular metabolism being insensitive to changes in glucose concentration in the physiological ranges found in different species. Zelent etਊl. (2006), for example, measured expression of GCKmRNA in islets of Langerhans (pancreas), pituitary, adrenal gland, whole brain, acinar pancreas, liver, skeletal muscle, adipose tissue, lung, kidney, and spleen. Of these, GCK mRNA was expressed in substantial amounts in the islets of Langerhans, pituitary, and liver with only trace amounts in the other tissues. Even more telling is that in brain, GCK mRNA is expressed in only a very small fraction of neurons and then only in neurons that respond to changes in physiological glucose concentrations (see Hussain etਊl., 2015 De Backer etਊl., 2016).


Въведение

Glucokinase (GK) * activity is a major determinant of β cell glucose metabolism and insulin secretion (Sweet et al., 1996 Matschinsky et al., 1998 Matschinsky, 2002). Thus, a complete model of its regulation is central to our understanding of glucose homeostasis and the pathogenesis of diabetic disease states. To maintain physiological glucose responsiveness, GK activity needs to be constrained within a very narrow range (Wang and Iynedjian, 1997 Matschinsky et al., 1998). Regulation of GK expression in β cells has been widely studied and is induced mainly by glucose, although it can be modulated by other factors, including insulin (Leibiger et al., 2001 Matschinsky, 2002). Posttranslational regulation of GK has only more recently been described, and the mechanisms involved in this mode of regulation are not well known. Recent studies have shown that low levels of glucose cause an association of GK with secretory granules (Toyoda et al., 1999 Stubbs et al., 2000 Rizzo et al., 2002) and that this association correlates with a decrease in GK activity (Rizzo et al., 2002). Prolonged exposure to high glucose (>20 min) causes dissociation of GK from the granule along with conformational changes associated with activation. Glucose-stimulated GK regulation is blocked by inhibitors of insulin secretion, and insulin by itself can rapidly (<2 min) induce similar changes to GK localization and activity (Rizzo et al., 2002). This suggests that minute-to-minute regulation of GK activity and localization occurs through receptor-mediated signaling and not by interaction between glucose and GK.

The molecular mechanism of GK association with secretory granules and the processes that modulate this association are unknown. To address the mechanism of GK association with secretory granules, we examined the role of nitric oxide synthase in this regulation. Neuronal nitric oxide synthase (nNOS) is activated by a rise in intracellular calcium, which is a known response of β cells to glucose or insulin stimulation (Aspinwall et al., 2000) and nNOS is also known to be localized on insulin secretory granules (Lajoix et al., 2001). Nitric oxide (NO) has also been shown to have a stimulatory affect on glucose-stimulated insulin secretion from both cultured β cell lines and pancreatic islets (Smukler et al., 2002 Kaneko et al., 2003). However, these findings are highly controversial, and an inhibitory effect on insulin secretion has also been shown using a variety of experimental approaches. (Salehi et al., 1996 Lajoix et al., 2001 Henningsson et al., 2002). This controversy points to the need for more careful consideration of potential targets for NO in the regulation of glucose-stimulated insulin secretion in order to understand the role of NO synthase (NOS) in β cell function. GK is one potential target for regulation by NO, since GK contains several cysteines that have been shown to be critical for maintaining catalytic activity (Tiedge et al., 2000).


Loss of function mutations cause diabetes

Over 190 of these mutations reduce the functional efficiency of the glucokinase molecule. Heterozygosity for alleles with reduced enzyme activity results in a higher threshold for insulin release and persistent, mild hyperglycemia. This condition is referred to as maturity onset diabetes of the young, type 2 (MODY2).

Homozygosity for GCK alleles with reduced function can cause severe congenital insulin deficiency resulting in persistent neonatal diabetes.

Gain of function mutations cause hyperinsulinemic hypoglycemia

As of 2004, 5 mutations have been found to enhance insulin secretion. Heterozygosity for gain of function mutations reduces the threshold glucose that triggers insulin release. This creates hypoglycemia of varying patterns, including transient or persistent congenital hyperinsulinism, or fasting or reactive hypoglycemia appearing at an older age.


Гледай видеото: НЕЗАМЕНИМЫЙ ВИТАМИН ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ - ВИТАМИН В7 (Декември 2022).