Информация

Как да идентифицираме гените, необходими за образуването на биофилм

Как да идентифицираме гените, необходими за образуването на биофилм


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Това е само въпрос за домашна работа:

В: Да предположим, че има неизвестен набор от гени на E. coli, които са необходими за образуването на биофилм. Опишете генетичен експеримент, който бихте могли да извършите, за да се опитате да идентифицирате тези гени.

Единствената идея, която се сещам е:

  • Сравнете щамовете, които произвеждат биофилм, с щамовете, които не произвеждат биофилм. Гените на последователността, намират разлики, прекъсват гените в щамовете, произвеждащи биофилми, и потвърждават, че способността на биофилма е нарушена.

Има ли по -добър подход от този?


Можете да правите различни неща: Първо можете, както сами казвате, да секвенирате пълните геноми на щамовете от биофилм и да ги сравните с някои, които не образуват биофилми. Това може да ви даде представа кои гени участват, когато присъстват в „генома на биофилма“, но не и в другия. Доказателството би било да се разрушат тези гени чрез премахването или мутирането им или чрез техники за заглушаване на гени и да се види какъв е резултатът.

Възможно е също така, че само мутация в ген, който съществува в пробата и контролния геном, прави разликата. Тогава насочената на място мутагенеза би помогнала за идентифициране на важните гени.

Втората възможност е, че няма реална разлика в пробата и контролния геном и разликата за разработването на биофилм "просто" се крие в разликата в генната експресия. Тогава изолацията на РНК (само обща или само иРНК) би помогнала за намирането на включени гени. Ако околната среда има значение за развитието на биофилм, тогава биофилмът и контролните клетки би трябвало да не показват (или почти никаква) разлика в техните профили на генна експресия, когато се култивират при идентични условия. След това трябва да тествате генната експресия за различни условия на околната среда (включително тези, които благоприятстват развитието на биофилмите), за да намерите намесени гени.

Това сравнение на различните условия след това ще достави гени, които са уникално или по -силно експресирани в групата на биофилма, много гени, които са сравними по експресия с контролната проба, и някои гени, които имат по -ниска експресия от контролната. Сега си струва да разгледаме по -висшите (или уникални) и по -ниско експресираните гени, да разберем тяхната функция и след това да започнем да ги мутираме, за да проверим тяхната функция за образуването на биофилм.

Освен това има вероятност генът (ите), който е необходим за образуването на биофилм, да се намира на екстрахромозомния плазмид. Също така бих проверил плазмидите, присъстващи в биофилма и контролната проба, да ги подредя (ако има такива) и да видя кои гени те експресират. Функцията за образуване на биофилм може лесно да бъде тествана с проста трансформация.


Допълнение към отговора на Крис.

Ако нямате щам, който не произвежда биофилм, тогава ще трябва да проверите за гените, които участват в производството на биофилм (това важи за всеки фенотип).

В по -ранни времена хората са правили това чрез произволна мутагенеза с мутагени като EMS (етилметансулфонат) или UV. В днешно време е възможно да се изгради библиотека от целеви мутагени срещу всеки ген за напр. Библиотека на CRISPR-Cas нуклеази.


Идентифициране на гените на Streptococcus sanguinis, необходими за образуването на биофилм и изследване на тяхната роля във вирулентността на ендокардит

Streptococcus sanguinis е един от пионерите в бактериалната колонизация на зъбите и е един от най -разпространените видове в оралния биофилм, наречен зъбна плака. S. sanguinis също е най-често срещаният вид стрептококи от групата viridans, замесени в инфекциозния ендокардит. За да се изследва връзката на биофилм и ендокардит, ние установихме анализ на биофилм и изследвахме образуването на биофилм с библиотека на мутагенеза с маркировка на S. Sanguinis. Четири гена, които преди това не са били свързани с образуването на биофилм в никоя друга бактерия, purB, purL, thrB и pyrE, се предполага, че допринасят за образуването на биофилми in vitro в S. sanguinis. Чрез изследване на 800 мутанти за отслабване в модела на заешки ендокардит и за намаляване на образуването на биофилм in vitro, открихме някои мутанти, които са дефектни в биофилма и отслабени за ендокардит. Въпреки това, ние също идентифицирахме мутанти само с намалено образуване на биофилм или само със затихване в модела на ендокардит. Този резултат показва, че способността за образуване на биофилми in vitro не е свързана с вирулентност на ендокардит in vivo в S. sanguinis.

Фигури

Изследване на образуването на биофилм от ...

Изследване на образуването на биофилм от мутантни щамове с намалена вирулентност за ендокардит. SK36…

Образуване на биофилм от родител и ...

Образуване на биофилм от родителски и мутантни щамове в различни среди. SK36 и избран...

STM анализ на мутанти с дефект на биофилм...

STM анализ на дефектни биофилми мутанти. Избрани резултати от екрана на STM на маркиран с подпис...

Организация на предполагаемия биофилм...

Организация на предполагаемите гени на биофилм сред оралните стрептококови геноми. Локациите и…


Гени за биогенеза на пилус тип IV и тяхната роля в образуването на биофилм в агента за биологичен контрол Lysobacter enzymogenes OH11

Пилус тип IV (T4P) е широко разпространен в бактериите, но механизмът и функционалността му за биогенеза са изяснени само частично при ограничен брой бактериални видове. Тук, използвайки щам OH11 като моделен организъм, ние докладвахме за идентифицирането на 26 протеини на структурен или функционален компонент на T4P (SFC) в грам-отрицателните Lysobacter enzymogenes, който е биоконтролен агент, потенциално експлоатиращ Т4Р-медиирана потрепваща подвижност за противогъбична активност. Двадесет такива гени, кодиращи SFC, бяха индивидуално нокаутирани в рамката, за да създадат библиотека за изтриване на T4P SFC. Чрез използване на комбинирани фенотипни и генетични подходи, ние открихме, че 14 такива SFC, които се експресират от четири оперона, са от съществено значение за подвижността на потрепване. Тези SFC включват второстепенните пилини (PilEi, PilXi, PilViи FimTi), протеинът против прибиране PilY1i, платформеният протеин PilC, удължаването/екстракцията на АТФази (PilB, PilT и PilU) и комплекса PilMNOPQ. Сред тях мутация на pilT или pilU предизвикаха хиперпилиране, докато останалите 12 SFC бяха незаменими за образуването на пилус. Десет (FimTi, PilY1i, PilB, PilT, PilU и комплексът PilMNOPQ) на 14 -те SFC протеини, както и PilA, е доказано, че играят ключова роля в L. ензимогени образуване на биофилм. Като цяло, нашите резултати предоставят първия доклад за дисекция на генетичната основа на биогенезата на T4P и нейната роля в образуването на биофилм в L. enzymogenes в детайли, което може да служи като алтернативна платформа за изучаване на биогенезата на T4P и неговата противогъбична функция.

Това е визуализация на абонаментно съдържание, достъп през вашата институция.


2. C. albicans развитие на биофилм

Повечето от нашите познания за C. albicans образуването на биофилми произлиза от изследването на моновидови биофилми, които са характеризирани и в двете инвитро и in vivo системи и се състоят от четири отделни фази на развитие [9,11] (Фиг. 2). C. albicans образуването на биофилм започва с прилепването на кръгли дрождови клетки към твърда повърхност (в лабораторията често се използват малък силиконов диск, материалът на обикновени интраваскуларни катетри или полистиролова микротитърна плоча). Обикновено културата на C. albicans се прибавя към твърдата повърхност, за да започне фазата на прилепване (60 � минути) и нелепналите или хлабаво залепени клетки след това се отмиват, което води до образуването на основен слой от закрепващи дрожди (фиг. 2А). Този етап често се нарича стъпка на “seeding” и е от съществено значение за нормалното развитие на биофилма. Следващият етап от развитието на биофилм се състои от клетъчна пролиферация и ранна фаза на филаментация на залепналите клетки (Фиг. 2В). Това е последвано от узряване на биофилм, което води до сложна мрежа от няколко слоя полиморфни клетки, включително хифални клетки (вериги от цилиндрични клетки), псевдохифални клетки (елипсоидални клетки, съединени край до край) и кръгли дрожди, обвити в извънклетъчен матрикс , придавайки на биофилма плътен и структуриран вид, както и осигуряване на защита от химически и физически наранявания (Фиг. 2C). Зрял биофилм обикновено се образува до 24 часа и може да се визуализира с око като мътна повърхностна структура върху твърдата повърхност и под микроскоп, като организирана колекция от различни типове клетки. По време на тези етапи на развитие на биофилма, растежната среда се поддържа непрекъснато да се разклаща, за да се предотврати утаяването на свободно плаващи клетки на повърхността или непрекъснато протича върху биофилма, за да имитира условията на потока, често присъстващи в катетрите. Последната стъпка от развитието на биофилма се нарича етап на разпръскване, където някои кръгли дрождови клетки се разпръскват от биофилма към нови семена (фиг. 2D), това е най -слабо изучената фаза на C. albicans развитие на биофилм. Няколко модела на in vitro C. albicans се съобщава за образуване на биофилм, а проучванията са фокусирани върху анализа на влиянието на различните видове субстрати, хранителни среди и наличието на потоци или статични условия върху развитието на биофилм [14]. В лабораторията, C. albicans биофилмите могат да се развият върху няколко различни субстрата и в много различни видове среди, което показва присъща устойчивост на развитието на биофилма към широк спектър от условия на околната среда.

C. albicans жизнения цикъл на биофилма. А. Прилепване на кръгли дрождови клетки към повърхността. Б. Иницииране на образуване на биофилм, където клетките се размножават, за да образуват базален слой от залепени клетки. ° С. Съзряване на биофилма, където се развиват сложни слоеве от полиморфни клетки и се обвиват в извънклетъчен матрикс. Д. Дисперсия, където кръгли дрождови клетки напускат зрелия биофилм, за да засеят нови места.

Общо взето, C. albicans in vitro образуването на биофилм е корелирало добре с in vivo и ex vivo Модели на биофилми те следват подобен ход във фазите на развитие и също изглеждат архитектурно подобни на биофилмите, извлечени от пациенти с инфекции. Например, Кандида биофилми, получени от пациенти със стоматологичен протез и от пациенти с инфектирани интраваскуларни катетри, потвърждават наличието на дрожди, хифи и извънклетъчен матрикс [1]. Едно от предимствата на in vivo моделите е възможност за учене C. albicans образуване на биофилм в присъствието на имунната система на гостоприемника, което може да предостави допълнителни механистични прозрения за взаимодействията гостоприемник-патоген. Архитектурата на биофилма в моделите на централен венозен катетър на плъхове и зайци, моделите на постоянен уринарен катетър и моделите на стоматит на протеза на плъхове също е подобна на in vitro структура на биофилма, включваща множество дрождеви клетки в базалната област и хифи и извънклетъчен матрикс, простиращи се в целия биофилм [15�]. Вагинална лигавица in vivo миши модели (вагинална лигавица, инокулирана с C. albicans при живи мишки) и ex vivo модели (вагини, изрязани от евтаназирани мишки, които са инокулирани с C. albicans в плочи за тъканни култури) също показват подобни архитектури на биофилм с клетки от дрожди, хифи и извънклетъчен матрикс, очевидни в биофилмите, образувани върху слоевете на лигавицата [18]. Други животински модели за наблюдение на образуването на биофилм включват модели на устна лигавица на гризачи, орофарингеални, подкожни и рани от изгаряне [19,20]. Разработването на по-нови моделни системи е в ход и ще ни помогне да визуализираме временната и пространствената прогресия на инфекциите с биофилм при живи животни, използвайки биолуминесцентно изображение. Например наскоро оптимизиран кодон C. albicans луциферазният биорепортер беше използван при модел на вулвовагинална кандидоза за наблюдение на образуването на биофилм в реално време във вагиналния лумен [21]. Друго C. albicans моделите на биолуминесцентни биофилми включват орофарингеални, кожни, подкожни и имплантирани катетърни модели [22,23].


Ролята на Mss11 в Candida albicans образуване на биофилм

Candida albicans е опортюнистичен човешки патоген, който може да образува биофилм върху биотични или инертни повърхности като епител и клинични устройства. В това изследване ние изследваме образуването на ° С. албикани биофилм чрез създаване на ключова генно-центрирана мрежа, базирана на взаимодействие протеин-протеин (PPI) и набори от данни за генна експресия. Започвайки от ° С. албикани Cph1 и Efg1, транскрипционни фактори, свързани с морфогенезата на образуването на биофилм, мрежа изяснява сложния клетъчен процес и прогнозира потенциално неизвестни компоненти, свързани с образуването на биофилм. Впоследствие анализирахме функциите на Mss11 сред тези идентифицирани протеини, за да тестваме ефективността на предложения изчислителен подход. MSS11-изтритите мутанти бяха сравнени с щам от див тип, което показва, че мутантът е дефектен при образуването на зрял биофилм и частично намалява вирулентността на ° С. албикани в модел на заразена мишка. Накрая беше проведен ДНК микрочипов анализ за идентифициране на потенциалните целеви гени на ° С. албикани Mss11. Резултатите от това проучване изясняват сложното взаимодействие на гени или протеини по време на процеса на образуване на биофилм ° С. албикани, подкрепящи прилагането на подход на системна биология за изследване на гъбичната патогенеза.

Това е визуализация на абонаментно съдържание, достъп през вашата институция.


Методи

Бактериални щамове и условия на растеж

Бактериалните щамове, използвани в това проучване, са изброени в Таблица S1. Запасите във фризера се съхраняват в 25% глицерол при -80 o C.

Бактериите се култивират в бульон за мозъчно-сърдечна инфузия (BHI), модифицирана среда M9 с екстракт от дрожди и глюкоза (MM9-YEG), 74 триптичен соев бульон без среда за растеж на декстроза (TSB-D) или лизогенен бульон (LB, за свръхекспресия на протеини) ). Добавя се агар (1% w/v) за твърда среда и желатин (3% w/v) се добавя където е посочено. За селекция са използвани антибиотици в следните концентрации: хлорамфеникол (10 μg/mL), еритромицин (20 μg/mL), фузидова киселина (25 μg/mL), гентамицин (100 μg/mL), канамицин (50 μg/mL) , спектромицин (250 μg/mL) и тетрациклин (5 μg/mL). Когато е необходимо за индукция, феромонният пептид cCF10 се добавя до крайна концентрация от 10-50 ng/mL. Антибиотици и желатин са закупени от Sigma. Компонентите за растежна среда са закупени от Difco.

Плазмиди и олигонуклеотиди

Плазмидите и олигонуклеотидите, използвани в това изследване, са изброени в таблица S1. Олигонуклеотидите са закупени от Invitrogen. PCR се провежда с помощта на PfuUltra II Fusion HS ДНК полимераза (Agilent Genomics). Рестрикционни ензими са закупени от New England Biolabs. Всички конструкции бяха потвърдени с помощта на Sanger секвениране (Eurofins). Плазмидите се трансформират в химически компетентни E. coli за размножаване и свръхекспресия на протеини, и се използва електропорация за въвеждане на плазмиди в E. faecalis.

Конструктите за свръхекспресия за пречистване на протеини бяха конструирани чрез сливане bph варианти на С-терминалния маркер на хексахистидин (Н6), кодиран върху вектора pET28b+. bph без нативния стоп кодон се амплифицира с помощта на праймери JW109/JW110. Ампликони, кодиращи мутациите Y85A, N87A и D105A, бяха генерирани с помощта на мегапримери. Първият PCR беше извършен с JW110 и олигонуклеотид, съдържащ желаната мутация (Y85A, JW115 N87A, JW116 D105A, JW117) с геномна OG1RF ДНК като матрица. Тези продукти бяха използвани във втора реакция за усилване на алела с пълна дължина с JW109. Мутацията W70A е конструирана с помощта на PCR с припокриващо се удължаване. Два продукта бяха амплифицирани от геномна OG1RF ДНК, използвайки олиго двойки JW109/JW130 и JW114/JW110 и смесени в друга реакция с праймери JW109/JW110. Всички алели с пълна дължина се смилат с NcoI-HF/XhoI и се лигират до pET28b+.

Безмаркерният делеционен щам Δbph е генериран с помощта на алелен обмен и контраселекция, както е описано по -горе, 75 запазвайки непокътнати първия и последните три кодона на bph отворена рамка за четене. Конструкцията за алелен обмен (pJW270) е генерирана чрез усилване на геномни региони, обграждащи bph с олиго JW133/134 и JW135/136 съответно. PCR продуктите се усвояват с EcoRI-HF, лигират се, след това се усвояват с BamHI-HF/SphI-HF и се лигират до pCJK218 75, третиран със същите рестрикционни ензими. Изтриването беше потвърдено чрез PCR и секвениране.

Тетрациклин-резистентно производно на феромон-индуцируемия pCIE вектор 76 е конструирано чрез замяна на касетата с резистентност към хлорамфеникол с кодиращ SpeI/EcoRI фрагмент tetM за генериране на pCIE-tet (pJW8). Мястото за мулти-клониране на pCIE-tet беше заменено с олигонуклеотидна касета (JW29/30), кодираща уникални BamHI/HincII-SalI/EcoRV/PvuI/NheI рестриктазни ензимни сайтове, което води до pCIEtm (pJW76). Пълна дължина bph алел и местно свързващо място на рибозома се амплифицират от геномна ДНК, използвайки JW163/93. The bph точкови мутанти (W70A, Y85A, N87A, D105A) бяха конструирани в гръбнака на pCIEtm, използвайки мегапримери, както е описано по -горе за pET28b+ конструкциите, с изключение на обратния праймер в първия PCR беше JW93, предният праймер във втория PCR беше JW163, а втората PCR беше направена с дивия тип bph изразна конструкция като шаблон. Мегапримерните PCRs бяха третирани с DpnI за отстраняване на матрична ДНК. Всички PCR продукти се смилат с BamHI-HF/PvuI-HF и се лигират до pJW76.

Генериране на Tn библиотека с масив

Подредената Tn библиотека е получена от подредена библиотека, генерирана по-рано, 30 която се поддържа като замразени запаси в 2D баркодирани тръби (Micronic) в Центъра за геномика на Университета в Минесота. Мутанти с Tn инсерции в гени, отбелязани като хипотетични/неизвестни (н = 1052) или в междугенни региони (н = 894) бяха избрани за включване в тази библиотека заедно с 11 контролни мутанта. Отделни клонове се получават с помощта на автоматизиран манипулатор за епруветки XL20 (BioMicroLab) и се инокулират в 96-ямкови плаки, съдържащи BHI/10% глицерол. Библиотечните изходни култури се отглеждат за една нощ и се замразяват при -80 o C. Пълният списък на мутантите в библиотеката е предоставен в допълнителни данни 1.

Анализи на биофилм и прикачване

Екранът на биофилма на подредената Tn библиотека се провежда, както е описано по -горе, с малки модификации. 23,25,77 Всички инкубации се провеждат при 37 o C в статична овлажнена камера. Използван е репликиращ щифт (Boekel Scientific) за инокулиране на 96-ямкови плаки, съдържащи 100 μL пресен TSB-D със замразените щамове Tn библиотека, и тези плаки се отглеждат за една нощ. На следващата сутрин репликиращият щифт се използва за прехвърляне на инокулум от култури за една нощ в 96-ямкови плаки, съдържащи 100 μL пресен TSB-D, които се инкубират при 37 o С в продължение на 6 часа. Едновременните контролни експерименти бяха проведени в отделна плоча. За измерване на оптична плътност при 600 nm (OD) беше използван модулен четец на микроплаки (Turner Biosystems).600) и след това се отстраняват планктонните култури. Плаките се промиват три пъти с двойно дестилирана вода, като се използва машина за измиване на плочи (Biotek), изсушават се и се оцветяват със 100 μL сафранин (0.01% w/v). Излишният сафранин се отстранява чрез измиване на плочата три пъти с двойно дестилирана вода. OD450 се измерва за количествено определяне на оцветен с сафранин биофилмов материал и стойностите на индекса на биофилма се изчисляват като съотношението на оцветен с сафранин материал към клетъчната плътност (OD450/OD600) нормализиран към биофилм, произведен от OG1RF. Всички други анализи на биофилм се извършват, както е описано по-горе, като се използват култури за една нощ, отглеждани в TSB-D плюс антибиотици и cCF10, и плаките се инокулират при разреждане 1: 100.

Мутанти с отрицателни стойности на индекса на биофилма бяха изключени от по -нататъшен анализ. Други мутанти на OG1RF_10987 и OG1RF_11802 нямат редуциран биофилм на този екран и се наблюдава общ дефект на растежа за мутанта на OG1RF_11756 Tn на позиция 183636. Мутантите, избрани за по -нататъшен анализ, се получават от плочите на библиотеката и се проверяват за чувствителност към еритромицин, за да се осигури загуба на съдържащия транспозаза плазмид, използван при генерирането на библиотеки. Трети OG1RF_10435-Tn мутант в подредената библиотека съдържа вмъкване 82,9% в гена и е намалил производството на биофилм в 6-часовия екран на биофилм (допълнителни данни 2). Не успяхме обаче да изолираме чувствителен към еритромицин клон на този мутант, така че той беше изключен от по-нататъшен анализ.

За да се измери прикрепянето към микротитърни плаки, 1 mL аликвоти от култури за една нощ (за Tn мутанти) или култури от логарифни фази, субкултивирани от щамове, отглеждани за една нощ (за bph комплементация) се гранулират в настолна центрофуга (9615 × g за 1 min), промива се с 1 обем буфериран с калиев фосфат физиологичен разтвор (KPBS), ресуспендира се в 100 μL KPBS и се добавя към 96-ямкова плака, която се инкубира при 37 ° С за 1 h. Клетъчна плътност (OD600), прикрепена биомаса (OD450) и стойности на индекса на прикачване (OD600/OD450) бяха измерени, както е описано за анализите на биофилм.

Прикрепването към сърдечните клапи на свинете беше извършено, както е описано по-рано с малки модификации. 36,37 прасета бяха принесени в жертва за други цели в лабораторията за експериментална хирургия в университета в Минесота (номер на протокол 1803A35699, одобрен от Комитета за институционална грижа и употреба на университета в Минесота). Сърцата бяха незабавно изрязани и поставени в охладен физиологичен разтвор, а клапаните бяха отстранени в рамките на 24 часа след жертвоприношението на животните. Парчетата на клапана бяха получени с помощта на 6 мм инструмент за биопсия (Acuderm Inc.) и бяха прехвърлени в 24-ямкова плака (Corning), съдържаща 2 mL DMEM/5% FBS/gent100. Вентилите, които не са използвани веднага, се замразяват при -80 o C в DMEM/5% FBS/gent100, допълнен с 10% DMSO. Преди употреба клапите се инкубират за една нощ в DMEM/5% FBS/gent100 при 37 o C/5% CO2, промива се 3 х в KPBS и се поставя в 48-ямкова плака с 1 mL DMEM (1 клапанна част на ямка). Ямките се инокулират с 5 × 10 7 бактерии и се инкубират при 37 o C/5% CO2 в продължение на 3 часа, след което клапаните се промиват 3 пъти в KPBS и се прехвърлят в 15 mL конични епруветки, съдържащи 5 mL KPBS. Пробите се обработват с ултразвук с помощта на ултразвуков апарат QSonica Q500 (1,6 mm връх, 20% амплитуда, 10 s включено/20 s изключено за общо 2 минути импулсно време), за да се отстранят свързаните с тъканите бактерии, и аликвоти се разреждат в KPBS и се нанасят за изброяване CFU/mL. За да се контролира размерът на клапана, стойностите на CFU/mL се нормализират към теглото на всеки клапан. Ние потвърждаваме, че сме спазили всички етични разпоредби за тези експерименти.

CPRG анализ

Щамовете се отглеждат за една нощ в TSB-D, допълнен с еритромицин и се разреждат до OD600 = 0,05 в прясна среда с еритромицин и 25 μg/mL CPRG. Културите се инкубират статично при 37 o С. Клетъчната плътност се измерва при OD630и CPRG хидролизата се определя количествено като OD570 от супернатанта на културата, след като клетките бяха отстранени чрез центрофугиране (17 000 х g за 2 минути). Съотношението на OD570/630 беше начертана за оценка на хидролизата спрямо клетъчния растеж.

Анализи на желатиназа

Културите се отглеждат за една нощ в TSB-D и се забелязват върху агарови плочи TSB-D, допълнени с 3% желатин (w/v). Плочите се инкубират при 37 ° С за една нощ за растеж на колониите и след това при 4 ° С за развитие на зоната. Плаките бяха изобразени на ProteinSimple Cell Biosciences FluorChem FC3 имиджър. Щамовете се считат за желатиназо-положителни, ако около колонията се развие непрозрачна зона.

Пречистване на eDNA и полизахариди

eDNA се събира от култури, както е описано по -горе 16 с модификации. Културите за една нощ се разреждат 1:50 в прясна среда плюс антибиотици и cCF10 и се отглеждат в продължение на 4 часа. 1 mL клетки се гранулират чрез центрофугиране (17 000 × g за 2 минути) и супернатантите се прекарват през 0.22 μm филтър на спринцовка. ДНК се утаява с помощта на изопропанол и етанол и се ресуспендира в 10 mM Tris -HCl рН 8.0. Двуверижната ДНК се определя количествено с помощта на комплекта за анализ на dsDNA Quant-iT PicoGreen (Thermo Fisher Scientific) съгласно инструкциите на производителя. Културите се разреждат и посяват за количествено определяне на CFU/mL и стойностите се изразяват като флуоресценция на CFU/mL.

Полизахаридите бяха изолирани, както е описано по-горе, 25 отделени с помощта на естествена електрофореза от полиакриламиден гел и оцветени с помощта на Stains-All (Sigma). Показаните изображения са представителни изображения от три независими експеримента. Геловете са изобразени в скали на сиво върху BioRad Gel Doc EZ Imager.

Изразяване и пречистване на протеини

производни на pET28b+, кодиращи варианти на Bph-H6, се трансформират в E. coli BL21 (DE3) клетки и отглеждани в LB/канамицин. Културите се отглеждат при 37 o C на подова шейкър на платформа Innova 2300 (New Brunswick Scientific) при 150 об / мин до OD600 0,4-0,6, след което 1,5 тМ изопропил β-d -1-тиогалактопиранозид (IPTG) се добавя за индуциране на протеинова експресия за 3 часа. Клетките се събират чрез центрофугиране (6371 × g за 10 минути) и ресуспендирани в лизисен буфер (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,01% Triton X-100, 20 mM имидазол, 100 μg/mL лизозим, 1 mM UPMSF/mL10). Клетките се счупват чрез ултразвук в ледена баня с помощта на соникатор QSonica Q500 (1,6 mm връх, 40% амплитуда, 10 s включено/20 s изключено за общо 2 минути импулсно време), а клетъчните остатъци се гранулират чрез центрофугиране (30 000 × g за 15 минути). Супернатантите се прехвърлят в епруветки, съдържащи предварително промита никелова NTA смола (Qiagen) и се инкубират с ротация при 4 o C. Смолата се промива 3 пъти с промивен буфер (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.01% Triton X -100, 20 mM имидазол) и протеините се елуират (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 250 mM имидазол). Фракциите се анализират за чистота, използвайки трис -глицин SDS -PAGE и се диализират срещу 2 L буфер, съдържащ Tris -HCl рН 7,5, 150 mM NaCl. Протеините се съхраняват при -20 o C в диализен буфер плюс 50% глицерол (v/v).

Структурни прогнози и фосфатазни анализи

Bph аминокиселинната последователност беше използвана като вход за Phyre2 55 и PaperBLAST. 57 В Pymol бяха импортирани подравнения с високо доверие. 78 Всички структурни изображения са генерирани с помощта на Pymol. За in vitro фосфатазни анализи, пречистените варианти на Bph-H6 (1 μM) се смесват с посочените субстрати (100 μM) в 96-ямкова плака, съдържаща 100 μL реакционен буфер (20 mM Tris-HCl рН 7.5, 150 mM NaCl и 10 mM от посочения двувалентен метален катион) на ямка. Реакциите се инкубират при 37 ° С в продължение на 1 час. 4.2% амониев молибдат в 4 М НС1 и 0.045% малахитово зелено (по 20 μL всяка) се добавят към всяка ямка, последвана от 1.4 μL 1% тритон. Абсорбция при 640 nm (А640) се измерва с помощта на четец за плаки BioTek Synergy H1. А640 стойностите се нормализират до контроли само за субстрат и свободният фосфат се определя количествено спрямо стандартна крива. Експериментите с точкови мутанти на Bph-H6 и двувалентни катиони бяха проведени паралелно, така че контролните реакции са същите.

Клетъчно фракциониране, протеинова електрофореза и Western блот

За генериране на протеинови лизати на E. faecalis, културите за една нощ се разреждат до OD600 0,05 в прясна среда и се инкубира при 37 o C (46 o C за експресия на Ace протеин). В точки от време, посочени на фиг. 4а, еквивалентът на 1 mL клетки при OD600 = 1.0 се пелетира в настолна центрофуга (9615 × g за 2 минути). Бяха извършени Western блотове с проби, събрани на 2 и 4 часа, а оцветяването с Pro-Q Diamond беше направено върху проби, събрани на 4 часа. Пелетите се ресуспендират в 100 μL буфер (10 mM Tris (рН 8.0), 1 mM EDTA, 25% захароза, 15 mg/mL лизозим) и се инкубират при 37 ° С в продължение на 30 минути. Тази суспензия се смесва директно с 2 × буфер за проби Laemmli (BioRad) за цели клетъчни лизати или се центрофугира (17 000 × g за 1 мин), за да се отдели пелетата (протопласт) от супернатантата (екстракт от клетъчна стена). Секретираните протеини в супернатанта на културата се утаяват чрез смесване на 1 обем супернатанта с 0,25 обема охладена 100% трихлороцетна киселина върху лед. Утаените протеини се пелетират в настолна центрофуга при 4 o C (17 000 × g за 10 минути) и се промива два пъти с ацетон. Пелетите се изсушават и ресуспендират в буфер за лизис на урея (8 М карбамид, 20 тМ Трис -НС1 рН 7,5, 150 тМ NaCl). Протеините се анализират чрез SDS -PAGE, използвайки 10% трис -глицинови гелове. Пробите се смесват с 2× Laemmli буфер и се нагряват при 95 o С преди зареждане. Геловете бяха пуснати при 110 V, оцветени с Coomassie, оцветени и изобразени на BioRad Gel Doc EZ Imager.

Откриването на фосфопротеини беше извършено с Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain (ThermoFisher Scientific). Пълноклетъчните лизати се разделят на необработени и третирани фракции, които се третират с хлороформ и метанол съгласно инструкциите на производителя. Пробите се разделят чрез SDS -PAGE, оцветяват се и се обезцветяват, като се използва модифициран протокол, описан по -горе. 79 Изображенията са заснети с помощта на 600 nm канал на Licor Odyssey FC Imaging System (LI-COR Biosciences). След това гелът се оцветява с Coomassie и се изобразява.

За Western блотове, протеините бяха прехвърлени в нитроцелулозни мембрани (Protran, Sigma-Aldrich), използвайки буфер на Towbin (0,05% SDS, 5–20% метанол). Мембраните се блокират, като се използва 1% мляко, разтворено в KPBS, допълнено с 0.01% Tween-20 (KPBST, рН 7.4). Първични антитела (1:20 000 анти-Ace и анти-SA80, 1:10 000 анти-EbpC и anti-PrgB) и вторични антитела (1:20 000 хрянова пероксидаза (HRP)-кози анти-заек, Invitrogen #65-6120) разреден в KPBST. Сигналът е разработен с помощта на хемилуминесцентен субстрат SuperSignal West Pico (Thermo Scientific), а изображенията са получени с помощта на хемилуминесцентен филтър на Licor Odyssey FC Imaging System. Неизрязаните Western блотове са показани на допълнителни фигури. 6–9. Всички проби за даден Western блот са получени от същия експеримент и обработени паралелно.

Масспектрометрия

Културите за една нощ се разреждат в прясна среда и се култивират в продължение на 4 часа, в който момент се приготвят клетъчни лизати за гел електрофореза, както е описано по-горе. Резените гел бяха изрязани от оцветени с Coomassie трис-глицинови SDS-PAGE гелове с острие за бръснене и бяха изпратени в Центъра за масови спектрометрия и протеомика на Университета в Минесота за анализиране на трипсин в гел и протеомичен анализ чрез LC/MS –MS на LTQ Orbitrap Velos масспектрометър. Всички MS/MS проби бяха анализирани с помощта на Sequest (само XCorr) (Thermo Scientific, версия IseNode в Proteome Discoverer 2.2.0.388) за търсене E. faecalis OG1RF протеини, приемащи храносмилателния ензим трипсин с толерантност на фрагмент йонна маса от 0,100 Da и толерантност на родителски йони 50 ppm. Скелето (версия Scaffold_4.8.9, Proteome Software Inc.) беше използвано за валидиране на MS/MS-базиран пептид (& gt77.0% вероятност, FDR & lt 1.0% чрез локално FDR на скелета) и протеин (& gt97.0% вероятност, FDR & lt 1.0 %, поне два идентифицирани пептида) идентификации. Вероятностите за протеини са зададени от алгоритъма на Protein Prophet. 80 Процента на общите спектри бяха сравнени между OG1RF и Δbph проби за идентифициране на най -разпространените диференциално експресирани протеини.

Криви на растеж и анализи за чувствителност към антибиотици

Нарастването в среда, допълнена с глюкоза или аргинин, се извършва с помощта на полусинтетична среда, описана по -горе. 52 Щама се отглежда в TSB-D, гранулиран в настолна центрофуга (9615 × g за 2 минути) и се промива в полусинтетична среда. Клетките се разреждат до начален OD600 от 0,05 в 200 μL базова среда или среда, допълнена с 1% глюкоза или 1% аргинин в 96-ямкова плака, която беше запечатана с Microseal B PCR запечатващ филм (Bio-Rad). OD600 измерванията бяха направени на интервали от 15 минути в продължение на 15 часа в четец за плаки BioTek Synergy H1. За тестове за чувствителност към антибиотици, щамовете се отглеждат в TSB-D и се коригират до OD600 = 0,05 в 200 μL двукратни разреждания на антибиотици (най-високи концентрации: цефокситин, 512 μg/mL оксацилин, 64 μg/mL) в 96-ямкова плака. 15 h кривите на растеж се провеждат, както е описано по-горе, и крайният OD600 стойността за всяко условие е разделена на OD600 на необработената култура.

Спряжение

Култури за донори и реципиенти за една нощ се отглеждат в TSB-D или TSB-D/tet, разреждат се 1:10 в пресен TSB-D без антибиотици и се инкубират при 37 ° С в продължение на 1 час. Cells were mixed at a 1:9 donor:recipient ratio in a microfuge tube. At indicated time points, aliquots were removed, diluted in KPBS supplemented with 2 mM EDTA, and plated on selective antibiotic agar plates.

Microscopy

E. faecalis biofilms were grown on Aclar fluoropolymer substrates essentially as described previously. 15,24 Overnight cultures were diluted 1:50 in TSB-D medium supplemented with 50 ng/mL cCF10 and cultured for 6 h in a 24-well polystyrene plate (Corning) at 100 rpm on a MaxQ 2000 tabletop shaker (Thermo Scientific). Cells were stained with 10 μg/mL Hoechst 33342 (Molecular Probes/Thermo Fisher Scientific), and images were captured with a Zeiss AX10 wide-field microscope using Zen2 (blue edition) software with a ×20 0.8-numerical-aperture objective. Images were imported as grayscale and false-colored (LookUp Table: cyan) using Fiji 81 and cropped to 500 × 500 pixels using GIMP (https://www.gimp.org/).

Статистически анализ

For experiments where numerical values are presented, individual data points from three independent biological replicates are shown. Error bars indicate standard error of the mean. Statistical significance was assessed using analysis of variance (ANOVA) with corrections for multiple comparisons by controlling the false discovery rate. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism. For assays where qualitative images are shown, experiments were performed in triplicate, and representative images are shown.


Advances in scientific research: Инвитро и in vivo biofilm detection methods

Many in vitro and in vivo methods have been used for a better understanding of the biology of biofilms and their detection. Colorimetric assays are the most widely used ones and commonly applied in studies related to the development and susceptibility of biofilms to drugs and the quantification of specific biofilm structures (Shukla and Rao 2017 ). These methods, although requiring significant amounts of time and a high number of trained staff, are important allies in identifying biofilm formation and for a better understanding, mainly of the susceptibility of biofilms to anti-biofilms and antimicrobial compounds, which can assist in the development of new methods of diagnosis and treatment that can be useful in clinical practice (Qu и др. 2017 г.). The main in vitro and in vivo tests used by the academic community are listed in Table 1 and described below.


Future perspective

We are only beginning to understand the biology of commensal bacteria such as S. epidermidis and their function in the maintenance of human health. Current microbiome studies will allow us to first understand and identify the ‘players’ that utilize the human skin as their ecological niche. It is unclear whether each species has a particular role in maintenance of and integrity of the skin structure or, possibly, immune development [2]. Second, the utilization of newer technologies will enable investigators to further probe each stage of biofilm formation to identify new strategies to inhibit biofilm formation on biomaterials. Many strategies, some very successful, have addressed inhibiting the initial adherence step of biofilm formation. Although vaccines against staphylococcal targets have proven to be problematic, multivalent vaccines against S. epidermidis should certainly target factors that are important for adherence to biomaterials. A virtually untapped area of staphylococcal biofilm research has been the identification of factors that are responsible for biofilm maturation. These maturation processes may include tower formation or the shift from a primarily aerobic metabolism to a microaerobic/anaerobic condition. It is hypothesized that inhibition of maturation may facilitate increased phagocytosis by the innate immune system or susceptibility to antibiotics. Newer technologies, such as laser capture microdissection microscopy, are needed to address the heterotypic nature of biofilms and study the single cell/regional response(s) to the nutrient and oxygen gradients that are generated by biofilms [123]. It is hypothesized that phenotypic variation is a byproduct of maturation and metabolic status of the biofilm. Importantly, future studies need to address the function/role of PIA-, Aap-, Bhp- or Embp-dependent S. epidermidis biofilms. Are all of these biofilms clinically relevant and recalcitrant to the innate immune system and the bactericidal action of antibiotics? Finally, further studies are required to address the interaction of PGA and other biofilm accumulation factors (PIA, Aap, Embp and Bhp) as the loss of PGA appears to dampen the anti-innate immune system properties of a PIA-dependent biofilm [7].

Executive summary

Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus epidermidis is a commensal bacterium living on the skin of humans. It is a significant cause of biomaterial-related infections.

Biofilm synthesis is a primary virulence factor. Staphylococcal biofilm is recalcitrant to host innate immune response and antibiotic treatment therefore, treatment of S. epidermidis infections frequently requires removal of offending device.

Genome structure of S. epidermidis

The genomes of two S. epidermidis isolates have been sequenced, ATCC12228 and RP62A.

The genome sequence reflects the ecological niche (skin) of S. epidermidis by encoding genes related to osmoprotection.

За разлика Staphylococcus aureus, S. epidermidis produces few virulence factors. Most are related to biofilm synthesis or resistance to host innate immune system.

Most clinical S. epidermidis isolates are part of a large clonal complex defined as CC2.

S. epidermidisbiofilm formation

Lack of virulence of S. epidermidis За разлика S. aureus may be related to ease of transmission from host to host.

Many virulence factors produced by S. epidermidis, including phenol-soluble modulins and the three-component antimicrobial peptide-sensing system, help to mediate resistance to the innate immune system.

Biofilm formation in staphylococci is typically viewed as a four-step mechanism: adherence, accumulation, maturation and detachment.

A factor complicating experimental analysis of S. epidermidis biofilm formation is that not all isolates encode factors demonstrated to augment biofilm formation, including icaADBC, aap, embp и bhp.

Adherence to biomaterials is mediated by both nonspecific and specific interactions. Specific adhesins include the bifunctional adhesins/autolysins AtlE/Aae and the MSCRAMM proteins SdrG, SdrF and Embp.

The best studied accumulation factor is polysaccharide intercellular adhesin (PIA) synthesized by gene products of the icaADBC оперон. icaADBC is transcriptionally regulated by multiple factors, demonstrating that PIA synthesis is tied to metabolic status of the bacterium.

S. epidermidis strains have also been isolated from clinically relevant infections that do not synthesize PIA, suggesting that other factors can replace PIA in the biofilm accumulation phase. Aap and Bhp are two identified proteins that can function in this role.

Little is known regarding the maturation phase of staphylococcal biofilm synthesis, but some data suggest that arginine catabolism is important. Phenotypic variation may be a by-product of biofilm maturation and tower formation.

Dispersal of both S. aureus и S. epidermidis biofilms is agr зависим. Въпреки това, в S. epidermidis, dispersal is related to synthesis of phenol-soluble modulins and δ-toxin, whereas S. aureus dispersal is related to protease production.

Poly-γ-DL-glutamic acid

Poly-γ-DL-glutamic acid is a virulence factor not found in S. aureus that protects S. epidermidis against high salt concentrations in addition to mediating resistance to antimicrobial peptides and phagocytosis.


Инхибиране на Pseudomonas aeruginosa Biofilm Formation by Traditional Chinese Medicinal Herb Herba patriniae

New antimicrobial agents are urgently needed to treat infections caused by drug-resistant pathogens and by pathogens capable of persisting in biofilms. The aim of this study was to identify traditional Chinese herbs that could inhibit biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa, an important human pathogen that causes serious and difficult-to-treat infections in humans. А luxCDABE-based reporter system was constructed to monitor the expression of six key biofilm-associated genes in P. aeruginosa. The reporters were used to screen a library of 36 herb extracts for inhibitory properties against these genes. The results obtained indicated that the extract of Herba patriniae displayed significant inhibitory effect on almost all of these biofilm-associated genes. Quantitative analysis showed that H. patriniae extract was able to significantly reduce the biofilm formation and dramatically altered the structure of the mature biofilms of P. aeruginosa. Further studies showed H. patriniae extract decreased exopolysaccharide production by P. aeruginosa and promoted its swarming motility, two features disparately associated with biofilm formation. These results provided a potential mechanism for the use of H. patriniae to treat bacterial infections by traditional Chinese medicines and revealed a promising candidate for exploration of new drugs against P. aeruginosa biofilm-associated infections.

Декларация за конфликт на интереси

The authors declare that they have no competing interests regarding the publication of this paper.

Фигури

Изрази на algU , algA…

Изрази на algU , algA , pslM, и bdlA in medium with water…

(a) Inhibition of biofilm production…

(a) Inhibition of biofilm production of PAO1 by H. patriniae extract. The control…

Photograph of exopolysaccharide production on…

Photograph of exopolysaccharide production on Congo red plates. (a) Without H. patriniae .…

Swarming motility of PAO1. (a)…

Swarming motility of PAO1. (a) PAO1 grown with H. patriniae was at right…


Подкрепяща информация

S1 Fig. Comparative analysis of becA-R biofilm gene cluster from Б. mallei ATCC23344, Б. pseudomallei 1026b, and Б. thailandensis E264.

The becA-R gene cluster from the sequenced genomes of Б. mallei ATCC23344 (top), Б. pseudomallei 1026b (middle), and Б. thailandensis E264 (bottom). Genes for becA-R на Б. pseudomallei 1026b, Bp1026b_I2907-Bp1026b_I2927 (becA-Р) are aligned with BMA0027-BMA0048 from Б. mallei ATCC and Б. thailandensis E264 BTH_I0520-BTH_I0537. Coding sequences are depicted by arrows per positive or negative strand orientation and sizes of genes and intergenic regions are to scale. The results of BLASTN annotations with minimum identity of 60% and threshold E-value of 1E-3 are aligned to regions of similarity. Red bars depict sequence inversions and blue bars depict direct homology in a color density gradient.

S2 Fig. Comparative analysis of bce-I и bce-II gene clusters from Б. pseudomallei и Б. vietnamiensis G4.

The cepacian biosynthesis (bce-I и bce-II) gene clusters from the sequenced genomes of Б. pseudomallei 1026b (top) and Б. vietnamiensis G4 (bottom). (A) Genes for bce-I на Б. pseudomallei 1026b, Bp1026b_II1966-Bp1026b_II1956 are aligned with Bcep1808_4200-Bcep1808_4210 from Б. vietnamiensis G4. (B) Genes for bce-II на Б. pseudomallei 1026b, Bp1026b_II1796-Bp1026b_II1807 are aligned with Bcep1808_4471-Bcep1808_4480 from Б. vietnamiensis G4. Coding sequences are depicted by arrows per positive or negative strand orientation and sizes of genes and intergenic regions are to scale. The results of BLASTN annotations with minimum identity of 60% and threshold E-value of 1E-3 are aligned to regions of similarity. Red bars depict sequence inversions and blue bars depict direct homology in a color density gradient.

S3 Fig. Growth curves of Б. pseudomallei 1026b biofilm mutants.

Overnight cultures were grown in LB and cultures were adjusted to a final OD600 0.1. Bacteria were grown at 37°C with shaking. Readings were taken every hour (A-D).

S1 Таблица. Biofilm-defective transposon mutants identified in primary screen.

Columns presented are the old NCBI gene locus, new NCBI gene locus, K96243 gene locus, gene description as found in burkholderia.com [38], gene locus, and if the gene was noted to have increased gene expression in a recent transcriptomic study [66]. Gene loci in bold represent transposon mutants that are predicted to be the first gene in an operon and were studied in detail.

S2 Таблица. Strains and plasmids used in the study.

S3 Table. Percent nucleotide and amino acid identities of the becA-R biofilm exopolysaccharide gene clusters from Б. pseudomallei 1026b as compared to Б. mallei ATCC2334, Б. thailandensis E264, and Б. cenocepacia J2315 exopolysaccharide gene clusters.

S4 Table. Percent nucleotide identity of the bce-I и bce-II gene clusters from Б. pseudomallei 1026b compared to Б. vietnamiensis G4, Б. cenocepacia J2315, Б. thailandensis E264, and Б. mallei ATCC23344.

S5 Table. Публикувано Б. pseudomallei genes that contribute to biofilm formation.

The asterisk indicates that a transposon insertional mutant was identified in the screen described in the current study.


Гледай видеото: العلاج الجيني في أوروبا وفرصه المستقبلية. المستقبل الآن (Декември 2022).