Информация

PCR ефективност или добив на ДНК с единичен праймер

PCR ефективност или добив на ДНК с единичен праймер


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Как да се изчисли броят на молекулите на ДНК, синтезирани след 'n' не. цикли с единичен грунд (или само преден грунд или обратен праймер)? Има ли някаква формула за изчисляване на добива на ДНК след такъв PCR?

Да предположим, че задавам PCR реакция за 100 шаблонни ДНК молекули за 30 цикъла, само с един праймер - преден праймер за целевия ген. Колко ДНК молекули ще се генерират в края на 30 цикъла. Всички останали условия остават същите.

Благодаря.


Технически, ако използвате само 1 праймер, това вече няма да бъде PCR.

Но това ще се случи, ако имате 100 шаблонни ДНК молекули (изградени от верига А и допълнителна верига В) и изобилие от праймер (да речем, 10x или 1000 молекули):

  1. В първия цикъл праймерите ще се свържат с шаблонна ДНК, но само с една верига (например А)
  2. ДНК полимеразата ще удължи тези праймери, създавайки допълнителни комплекси В '. Някои вериги B' ще бъдат по-къси от шаблона, защото ДНК pol не е перфектна
  3. Комплексът ДНК-праймер ще се стопи в началото на цикъл 2
  4. В началото на цикъл 2 праймерните молекули отново ще се свържат към шаблона, отново към нишките А и процесът продължава

Тъй като няма стъпка, където се копира нишка А, този процес ще бъде линеен, а не "верижна реакция". При всеки цикъл ще получите едно и също количество нишки B'.

Трудно е да се каже колко B' молекули ще получите на всеки цикъл, но в края на 30 цикъла това ще бъде в най-добрия случай 30 пъти от първия цикъл. Не забравяйте обаче, че ДНК полимеразата се разгражда и цикъл 30 ще бъде по-малко ефективен от цикъл 1.

Ако приемем перфектната полимераза и това време за удължаване е достатъчно дълго, ще получите 100 нишки B' на цикъл 1, 100 нишки B' на цикъл 2 и така нататък. В края на 30 цикъла ще имате 30x100 нишки B' и 100 нишки A и 100 нишки B.


Разбиране на ефективността на qPCR и защо тя може да надхвърли 100%

Количествената полимеразна верижна реакция (или qPCR) е добре установен анализ за количествено определяне на нуклеинова киселина и все още се счита за метод на избор в повечето области на молекулярната биология. Въпреки че съществуват различни видове qPCR количествено определяне (абсолютно и относително), определяне на ефективност на усилване трябва да бъде сред първите неща да направите при настройване на qPCR анализ. Разбирането на ефективността и как да я изчислите е от решаващо значение за точното тълкуване на данните.

В идеалния случай броят на молекулите на целевата последователност трябва да се удвои по време на всеки цикъл на репликация, което съответства на 100% ефективност на усилване. По същия начин, ако броят на репликираните молекули е по-малък от два пъти, това се дължи на слаба ефективност – под 100%. Най-честите причини за по-ниска ефективност са лош дизайн на грунда и неоптимални концентрации на реагентите или реакционни условия. Вторичните структури като димери и фиби или неподходящи температури на топене (Tm) могат да повлияят на отгряването на грунд-шаблон, което води до лошо усилване. Тъй като всяко допълнително разреждане съдържа подходящо по-ниски изходни количества ДНК, възникват разлики между стойностите на Ct в серийно разредените проби (вижте по-долу).

Разликите между стойностите на Ct на известните стъпки на разреждане са по-високи от предвидените. 10-кратните разреждания трябва да са на 3,3 цикъла, но в този случай те са по-раздалечени.

Един от начините за изчисляване на ефективността на усилване е чрез серийни разреждания на вашата цел. След като получите техните Ct стойности, ги начертайте в логаритмична скала заедно със съответните концентрации. След това генерирайте крива на линейна регресия през точките от данни и изчислете наклона на линията на тренда. Накрая ефективността се изчислява с помощта на уравнението: E = -1+10 (-1/наклон) . Или използвайте този калкулатор, който върши работата вместо вас. Не забравяйте да разберете какво влияе върху наклона на кривата на усилване, тъй като в противен случай това може да бъде подвеждащо.

обикновено, желаната ефективност на усилване варира от 90% до 110%. Теоретичният максимум от 100% показва, че полимеразният ензим работи с максимален капацитет. Как тогава е възможна дори ефективност над 100%? Това би означавало, че повече от две копия на последователността се генерират във всеки qPCR цикъл, нали?

Пипетирането на 96- и 384-ямкови плаки може да бъде много разочароваща и досадна задача.

Използване на инструменти за пипетиране като Pipetting Aid PlatR може драстично да подобри вашата прецизност, като същевременно ви поддържа спокойни и отпуснати.


Преглед

Специфичната комплементарна асоциация, дължаща се на водородно свързване на едноверижни нуклеинови киселини, се нарича "отгряване": две комплементарни последователности ще образуват водородни връзки между техните комплементарни бази ( G до C и A до T или U ) и образуват стабилна двуверижна, антипаралелна "hybrid" молекула. Човек може да направи нуклеинова киселина (NA) едноверижна с цел отгряване - ако вече не е едноверижна, напр. повечето РНК вируси - чрез нагряване до точка над "температурата на топене" на двойно- или частично-двойно-верижната форма и след това бързо охлаждане: това гарантира, че "денатурираните" или разделените нишки не се отгряват повторно. Освен това, ако NA се нагрява в буфери с йонна сила по -ниска от 150 тМ NaCl, температурата на топене обикновено е по-ниска от 100oC - поради което PCR работи с температури на денатурация 91-97 o C.

По-подробно третиране на отгряване/хибридизация е дадено на придружаващата страница, заедно с обяснения за изчисления на сложност, условия за отгряване/хибридизация и др.

Taq полимераза се дава като притежаващ a полуживот от 30 минути при 95 o ° С, поради което отчасти човек не трябва да прави повече от около 30 цикъла на усилване: все пак е възможно намаляване на denaturация температура след около 10 кръга на усилване, като средната дължина на целевата ДНК е намалена : за шаблони на 300 bp или по-малко, температурата на денатурация може да бъде намалена до до 88 o C за 50% (G+C) шаблони (Yap and McGee, 1991), което означава, че човек може да направи толкова 40 цикъла без значително намаляване на ензимната ефективност.

"Време при температура" е основната причина за денатурация/загуба на активност на Taq: по този начин, ако човек намали това, ще увеличете броя на възможните цикли , независимо дали температурата е намалена или не. Обикновено времето за денатурация е 1 мин при 94 oС: възможно е за кратки шаблонни последователности да намалете това до 30 секунди или по-малко. Повишаването на температурата на денатурация и намаляването на времето също могат да работят: Innis and Gelfand (1990) препоръчват 96 o C за 15 сек.

Температура на отгряване и дизайн на грунд

Дължина и последователност на грунда са от решаващо значение при проектирането на параметрите на успешното усилване: температурата на топене на дуплекс NA се увеличава както с дължината му, така и с увеличаване на съдържанието (G+C): проста формула за изчисляване на Tm е

Tm = 4(G + C) + 2(A + T) o C.

По този начин температурата на отгряване, избрана за PCR, зависи директно върху дължината и композицията на грунда(ите). Човек трябва да се стреми към използване на температура на отгряване (Ta) около 5 o C под най-ниското Tm на другата двойка праймери, които ще се използват (Инис и Гелфанд, 1990). По-строго третиране на Ta се дава от Rychlik et al. (1990): те поддържат това ако Ta се увеличава с 1 o C всеки втори цикъл, специфичността на амплификацията и добивът на продуктите <1kb по дължина се увеличават. Една последица от твърде нисък Ta е, че един или и двата праймера ще го направят отгряване към последователности, различни от истинската цел, тъй като вътрешните несъответствия на една основа или частичното отгряване могат да бъдат толерирани: това е добре, ако някой иска да засили подобни или свързани цели обаче може да доведе до & специфично & quotnon & quot усилване и последващо намаляване на добива от желания продукт, ако 3'-най-голямата база е сдвоена с цел.

Последица от твърде висок Ta е това ще се произвежда твърде малко продукт , тъй като вероятността от отгряване на грунда е намалена, друго важно съображение е, че двойка праймери с много различни Tas може никога да не даде забележими добиви от уникален продукт, и също може да доведе до неволно & quotасиметрична" или едноверижно усилване на най-ефективно грундираната продуктова верига.

Отгряването не отнема много време: повечето грундове ще ефективно отгряване за 30 секунди или по-малко, освен ако Ta е твърде близо до Tm или освен ако не са необичайно дълги.

Илюстрация на ефекта от температурата на отгряване върху специфичността и върху добива на амплификация на Човешки папиломен вирус тип 16 (HPV-16) е даден по-долу (Williamson and Rybicki, 1991: J Med Virol 33: 165-171).

ДНК шаблони от плазмидни и биопсични проби бяха амплифицирани при различни температури на отгряване, както е показано: имайте предвид, че докато плазмидът се амплифицира от 37 до 55 о C, HPV ДНК се амплифицира само при 50 о ° С.

Дължина на грунда

Оптималната дължина на грунда зависи от неговото (A+T) съдържание, и Tm на своя партньор, ако рискува да има проблеми като описани по-горе. Освен Tm, a основното съображение е, че праймерите трябва да са достатъчно сложни, така че вероятността от отгряване към последователности, различни от избраната цел, да е много ниска. (Вижте хибриден документ).

Например, има ¼ шанс (4 -1) за намиране на A, G, C или T във всяка дадена ДНК последователност, има 1/16 шанс (4 -2) за намиране на която и да е динуклеотидна последователност (напр. AG) шанс 1/256 за намиране на дадена 4-базова последователност. По този начин, а шестнадесет базови последователности статистически ще присъстват само веднъж на всеки 4 16 бази (= 4 294 967 296 или 4 милиарда): това е около размера на човешкия или царевичния геном и 1000 пъти по-голям от размера на генома на Е. coli . По този начин, свързването на олигонуклеотид по-голяма от 17-база с неговата целева последователност е изключително специфичен за последователността процес, много повече от специфичността на моноклоналните антитела при свързването със специфични антигенни детерминанти. следователно, 17-мерни или по-дълги праймери се използват рутинно за амплификация от геномна ДНК на животни и растения. Твърде дългата дължина на грунда може да означава, че дори високите температури на отгряване не са достатъчни, за да предотвратят несъответствието сдвояване и неспецифично грундиране.

Дегенерирани грундове

За амплификация на родствени последователности от различни организми, или за "evolutionary PCR", човек може да увеличи шансовете за получаване на продукта чрез проектиране на "изродени" праймери: това всъщност би било набор от праймери, които имат редица опции на няколко позиции в последователността, така че да позволят отгряване и амплификация на различни свързани последователности . Например, Compton (1990) описва използването на набори от 14-мерни праймери с 4 и 5 дегенерации като предни и обратни праймери, съответно, за амплификация на гликопротеин В (gB) от сродни херпесвируси. Последователността на обратния праймер беше както следва:

TCGAATTCNCCYAAYTGNCCNT

където Y = T + C и N = A + G + C + T, а 8-базовото 5'-терминално разширение включва ЕкоRI сайт (подчертано) и фланкиращ дистанционер за осигуряване на рестрикционен ензим може да отреже продукта (каталогът на New England Biolabs дава добър списък на това кои ензими изискват колко дълга фланкираща последователност, за да се отрежат краищата). Дегенерациите очевидно намаляват специфичността на праймера(ите), което означава, че възможностите за несъответствие са по-големи и фоновият шум също се увеличава, повишената дегенерация означава, че концентрацията на отделните праймери намалява по този начин трябва да се избягва по-голяма от 512-кратна дегенерация. Въпреки това използвах праймери с 256- и 1024-кратна дегенерация за успешното усилване и последващо директно секвениране на широк спектър от Мастревируси на фона на царевична геномна ДНК (Rybicki и Hughes, 1990).

Праймерните последователности бяха получени от множество подравнявания на последователности, като позициите на несъответствието бяха използвани като 4-основни дегенерации за праймерите (показани като звезди 5 в F и 4 в R), както е показано по-горе. Въпреки тяхната дегенерация, праймерите могат да се използват за амплифициране на последователност от 250 bp от вируси, различаващи се по последователност с до 50% спрямо целевата последователност и 60% като цяло. Те биха могли да се използват и за много чувствително откриване на наличието на Вирус на царевична ивица ДНК на фона на геномна ДНК на царевица, при разреждане само 1/10 9 заразен сок / здрав сок (виж отдолу).

Някои групи използват деоксиинозин (dI) в дегенерирани позиции, вместо да използват смесени олиго: тази база се сдвоява с всяка друга база, което ефективно дава четирикратно израждане във всяка позиция в олиго, където присъства. Това намалява проблемите, свързани с изчерпването на специфични единични олиго в силно дегенерирана смес, но може да доведе до твърде висока дегенерация, когато има 4 или повече dI в олиго.

Температура и време на удължаване

Това обикновено е 70 - 72oC, за 0,5 - 3 минути. Taq всъщност има специфична активност при 37oC, която е много близка до тази на фрагмента на Klenow E coli ДНК полимераза I, която обяснява очевидния парадокс, който се получава, когато човек се опитва да разбере как грундовете, които се нагряват при оптимална температура, могат да бъдат удължени при значително по -висока температура - отговорът е такъв удължаването настъпва от момента на отгряване, дори ако това е преходно, което води до значително по-голяма стабилност. При около 70oC активността е оптимална и удължаването на праймера става до 100 бази/сек. относно 1 минута е достатъчна за надеждно усилване на 2kb последователности (Инис и Гелфанд, 1990). По-дългите продукти изискват по-дълго време: 3 минути е добър залог за 3kb и по-дълги продукти. По-дългите времена могат също да бъдат полезни при по-късни цикли, когато концентрацията на продукта надвишава концентрацията на ензима (>1nM) и когато изчерпването на dNTP и/или праймера може да стане ограничаващо.

Реакционен буфер

Препоръчителните буфери обикновено съдържат:

  • 10-50 mM Tris-HCl pH 8,3,
  • до 50 mM KCl, 1,5 mM или повече MgCl2,
  • праймери 0,2 - 1uM всеки праймер,
  • 50 - 200uM всеки dNTP,
  • желатин или BSA до 100 ug/ml,
  • и/или не-йонни детергенти като Tween-20 или Nonidet P-40 или Triton X-100 (0,05 - 0,10% об./об.)

(Инис и Гелфанд, 1990). Съвременните формулировки обаче могат да се различават значително - те също като цяло са собственост.

Предполага се, че PCR работи добре в буфер за обратна транскриптаза, и обратно, което означава, че са възможни протоколи с 1 епруветка (с cDNA синтез и последваща PCR) (Krawetz et al., 19xx Fuqua и др., 1990).

По-високи от 50 mM KCl или NaCl инхибира Taq, но някои са необходими за улесняване на отгряване на грунда.

[Mg2+] влияе на отгряване на праймера Tm на шаблон, продукт и праймер-шаблон асоциации продуктова специфичност ензимна активност и вярност. Taq изисква Безплатно Mg2+, така че трябва да се вземат предвид dNTP, праймери и шаблон, всички от които хелатират и секвестират катиона на тях, dNTPs са най-концентрирани, така че [Mg2+] трябва да бъде 0,5 - 2,5 mM по-голяма отколкото [dNTP]. Трябва да се извърши титруване с вариращ [Mg2+] с всички нови комбинации шаблон-праймер , тъй като те могат да се различават значително в своите изисквания, дори при едни и същи условия на концентрации и времена на цикъл/температури.

Някои ензими не се нуждаят от добавяне на протеин, други са зависими от него. Някои ензими работят значително по-добре в присъствието на детергент, вероятно защото той предотвратява естествената склонност на ензима да се натрупва.

Концентрациите на праймера не трябва да надвишават 1uM освен ако няма висока степен на израждане 0.2uM е достатъчно за хомоложни праймери.

Концентрация на нуклеотиди не е необходимо да надвишават 50uM всеки: дългите продукти обаче може да изискват повече.

Номер на цикъла

Броят на амплификационните цикли, необходими за създаване на лента, видима върху гел, зависи до голяма степен от началната концентрация на целевата ДНК: Innis и Gelfand (1990) препоръчват от 40 - 45 цикъла за усилване на 50 целеви молекули , и 25 - 30 за усилване на 3x105 молекули до същата концентрация. Тази непропорционалност се дължи на т.нар плато ефект, което е затихването на експоненциалната скорост на натрупване на продукта в късните етапи на PCR, когато продуктът достигне 0,3 - 1,0 nM. Това може да бъде причинено от разграждане на реагентите (dNTPs, ензим) изчерпване на реагентите (праймери, dNTPs - първи проблем с къси продукти, втори за дълги продукти) инхибиране на крайния продукт (образуване на пирофосфат) конкуренция за реагенти от неспецифични продукти, конкуренция за свързване на праймера чрез повторно отгряване на концентриран (10 nM) продукт (Innis and Gelfand, 1990).

Ако желаният продукт не е направен в 30 цикъла , вземете малка проба (1 ul) от амплифицирания микс и повторно усилване 20-30x в нов реакционен микс, вместо да се удължава цикъла до повече цикли: в някои случаи, когато концентрацията на шаблона е ограничаваща, това може да даде добър продукт, когато удължаването на цикъла до 40x или повече не дава.

Вариант на това е PCR с вложен грунд : PCR амплификацията се извършва с един комплект праймери, след което се взема някакъв продукт - със или без отстраняване на реагенти - за повторно амплифициране с вътрешно разположен, "вложен" набор от праймери. Този процес добавя още едно ниво на специфичност, което означава, че всички продукти, неспецифично амплифицирани в първия кръг, няма да бъдат амплифицирани във втория. Това е илюстрирано по-долу:

Тази гел снимка показва ефекта на вложената PCR амплификация върху откриваемостта на Вирус на пилешка анемия (CAV) ДНК в серия от разреждане: PCR1 само открива 1000 шаблонни молекули PCR2 амплифицира 1 шаблонна молекула (Soiné C, Watson SK, Rybicki EP, Lucio B, Nordgren RM, Parrish CR, Schat KA (1937: Avian Dis6) -476).

Етикетиране на PCR продукти с дигоксигенин-11-dUTP

(DIG Roche) трябва да се направи само в 50 uM всеки dNTP, като dTTP се замества до 35% с DIG-11-dUTP. ЗАБЕЛЕЖКА: че продуктът ще има по-висок MW от родния продукт! Това води до много добре маркирана сонда, която може да се използва многократно за периоди до 3 години. Вижте също тук.

Helix дестабилизатори / добавки

При NAs с високо (G+C) съдържание може да се наложи да се използват по-сурови условия на денатурация. Например, може да се включат до 10% (w или v/v):

  • диметилсулфоксид (DMSO),
  • диметилформамид (DMF),
  • карбамид
  • или формамид

в реакционната смес: Предполага се, че тези добавки намаляват Tm на целевата NA , въпреки че е известно DMSO при 10% и повече намаляване на активността на Taq с до 50% (Инис и Гелфанд, 1990 Гелфанд и Уайт, 1990).

Може да са необходими и добавки при амплификацията на дълги целеви последователности: DMSO често помага при усилване на продуктите на >1kb. Формамид очевидно може драстично да подобри специфичността на PCR (Sarkar и др ., 1990), докато глицерол подобрява усилването на високи (G+C) шаблони (Smith и др., 1990).

Полиетилен гликол (PEG) може да бъде полезна добавка, когато концентрацията на ДНК матрица е много ниска: насърчава макромолекулната асоциация чрез изключване на разтворител, което означава, че pol може да намери ДНК.

CDNA PCR

Много полезен праймер за синтеза на cDNA и cDNA PCR идва от стратегия за секвениране, описана от Thweatt и др. (1990): това използва смес от три 21-мерни праймера, състоящи се от 20 T остатъка с 3'-терминал A, G или C, съответно , за последователност вътре поли(А) регионът на сДНК клонове на иРНК от еукариотен произход. Използвал съм го за усилване на дискретни ленти от различни поли(А)+ вирусни РНК, само с един специфичен дегенериран праймер нагоре: Т-праймерът може да се отгрява навсякъде в поли(А) региона, но само молекули, които се отгряват в началото на поли(А) опашката, и чия 3'-повечето база е комплементарна към основата до началото на опашката , ще бъде удължен.

например: 5 '-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT (A, G, C) -3 '

работи за усилване на Potyvirus РНК и еукариотна иРНК

Прост набор от правила за проектиране на праймерна последователност е както следва (адаптирано от Innis and Gelfand, 1991):

грундовете трябва да са с дължина 17-28 основи

основният състав трябва да бъде 50-60% (G+C)

грундовете трябва да завършват (3') с G или C, или CG или GC: това предотвратява "дишането" на краищата и увеличава ефективността на грундирането

Tms между 55-80 о С са за предпочитане

пускането на три или повече Cs или Gs в 3'-края на праймерите може да насърчи неправилно праймиране в G или C-богатите последователности (поради стабилността на отгряване) и трябва да се избягва

3'-края на праймерите не трябва да се допълват (т.е. базова двойка), тъй като в противен случай димерите на праймерите ще се синтезират за предпочитане пред всеки друг продукт

самодопълване на праймера (способност за образуване на 2 о структури като фиби) трябва да се избягват.

Примери за взаимно допълване между и между грундове, което би довело до проблеми:

Екранни снимки, направени от анализи, направени с помощта на DNAMAN (Lynnon Biosoft, Квебек, Канада).

Препратки

Комптън Т (1990). Дегенерирани праймери за амплификация на ДНК. стр. 39-45 в: PCR протоколи (Innis, Gelfand, Sninsky and White, eds.) Academic Press, Ню Йорк.
Fuqua SAW, Fitzgerald SD и McGuire WL (1990). Прост метод на полимеразна верижна реакция за откриване и клониране на транскрипти с ниско съдържание. BioTechniques 9 (2): 206-211.
Gelfand DH и White TJ (1990). Термостабилни ДНК полимерази. стр. 129-141 в: PCR протоколи (Innis, Gelfand, Sninsky and White, eds.) Academic Press, Ню Йорк.
Innis MA и Gelfand DH (1990). Оптимизиране на PCR. стр. 3-12 в: PCR протоколи (Innis, Gelfand, Sninsky and White, eds.) Academic Press, Ню Йорк.
Krawetz SA, Pon RT и Dixon GH (1989). Повишена ефективност на катализираната с полимераза Taq полимеразна верижна реакция. Изследване на нуклеинови киселини 17 (2):819.
Rybicki EP и Hughes FL (1990). Откриване и типизиране на вирус на царевична ивица и други отдалечени родствени геминивируси на треви чрез амплификация с полимеразна верижна реакция на запазена вирусна последователност. Journal of General Virology 71:2519-2526.
Rychlik W, Spencer WJ и Rhoads RE (1990). Оптимизиране на температурата на отгряване за амплификация на ДНК in vitro. Изследване на нуклеинови киселини 18 (21): 6409-6412.
Sarkar G, Kapeiner S и Sommer SS (1990). Формакмид може драстично да увеличи специфичността на PCR. Изследване на нуклеинови киселини 18 (24): 7465.
Smith KT, Long CM, Bowman B и Manos MM (1990). Използване на съразтворители за подобряване на PCR амплификацията. Усилвания 9/90 (5):16-17.
Thweatt R, Goldstein S и Reis RJS (1990). Универсална праймерна смес за определяне на последователност в 3' края на сДНК. Аналитична биохимия 190:314-316.
Wu DY, Ugozzoli L, Pal BK, Qian J, Wallace RB (1991). Ефектът на температурата и дължината на олигонуклеотидния праймер върху специфичността и ефективността на амплификацията чрез полимеразната верижна реакция. ДНК и клетъчна биология 10 (3): 233-238.
Yap EPH и McGee JO'D (1991). Кратки добиви на PCR продукти, подобрени от по-ниски температури на денатурация. Изследване на нуклеинови киселини 19 (7):1713.


Коментар

Обща информация

Теоретичната основа на полимеразната верижна реакция (PCR виж въведението в главата) вероятно е описана за първи път в статия от Kleppe et al. (1971 г.). Тази техника обаче не предизвика общия интерес до средата на 80-те години, когато Кари Мълис и колеги от Cetus разработиха PCR в техника, която може да се използва за генериране на големи количества гени с едно копие от геномна ДНК (Saiki et al. , 1985, 1986 Mullis et al., 1986 Embury et al., 1987).

Първоначалната процедура включва добавяне на нова аликвота от фрагмента на Klenow на Е. coli ДНК полимераза I по време на всеки цикъл, тъй като този ензим е бил инактивиран по време на следващия етап на денатурация. Въвеждането на термостабилни Taq ДНК полимераза от Thermus aquaticus (Saiki et al., 1988) облекчава тази досада и улеснява автоматизирането на термичната циклична част от процедурата. Taq ДНК полимеразата също така позволява използването на по-високи температури за отгряване и удължаване, което подобрява строгостта на хибридизацията праймер-шаблон и по този начин специфичността на продуктите. Това също служи за увеличаване на добива на желания продукт.

Всички приложения на PCR зависят от оптимизиран PCR. В това устройство оптимизира PCR за няколко променливи, включително MgCl2 концентрация, подобряващи добавки-диметилсулфоксид (DMSO), глицерол или Perfect Match Polymerase Enchancer (PMPE)-и предотвратяване на неправилно отпечатване преди PCR. Тези и други параметри могат да бъдат изключително важни, тъй като всеки елемент на PCR може да повлияе на резултата (вижте 2.2 за обсъждане на отделните параметри).

На пазара има няколко комплекта за PCR оптимизация и патентовани подобрители (Таблица 3). Комплектите за оптимизация обикновено осигуряват панел от буфери, в които рН, буфер, нейонни детергенти и добавяне на (NH4)2ТАКА4 са разнообразни, MgCl2 могат да се добавят в няколко концентрации и могат да бъдат избрани подобрители (например, DMSO, глицерол, формамид, бетаин и/или патентовани съединения). Протоколът, представен тук, е насочен към поддържане на ниски разходи и широки възможности.

Техническа информация в приложение към каталога

Boehringer-Mannheim, Invitrogen, Stratagene, Sigma, Epicenter Technologies, Life Technologies

Няколко буфера, Mg 2+ и подобрители, които могат да включват DMSO, глицерол, формамид, (NH4)2ТАКА4и други неуточнени или патентовани агенти

Amersham Pharmacia Biotech

Готови за пускане перли „оптимизирани за стандартен PCR“ и готови за пускане RAPD зърна за анализ (буфер, нуклеотиди, Taq ДНК полимераза)

EasyStart PCR Mix-in-a-Tube-епруветки, предварително опаковани с восъчни перли, съдържащи буфер, MgCl2, нуклеотиди, Taq ДНК полимераза

PCR SuperMix—1.1× конц.—премикс, съдържащ буфер, MgCl2, нуклеотиди, TaqДНК полимераза

Advanced Biochemicals Red Hot DNA Polymerase—нов конкурент за Taq полимераза с функции за удобство

Молекулярни биопродукти HotStart Storage and Reaction Tubes—предварително залепените восъчни перли във всяка епруветка изискват ръчно добавяне на един компонент при висока температура

HotWax Mg 2+ зърна—восъчни перли съдържат предварително формулиран MgCl2 който се освобождава при първата стъпка при повишена температура

StrataSphere Magnesium Wax Beads—восъчни перли, съдържащи предварително формулиран Mg 2+

Горещ старт/отделна полимераза

TaqBead Hot Start Polymerase—восъчни перли, капсулирани Taq ДНК полимераза, която се освобождава на първия етап на повишена температура

Горещо стартиране/обратимо инактивиране на полимераза чрез свързване на антитела

TaqStart антитяло, TthStart антитяло - обратимо деактивиране Taq и Tth ДНК полимерази до първата денатурация при 95°C

PlatinumTaq—съдържа PlatinumTaq антитяло

JumpStart Taq—съдържа TaqStart антитяло

Горещ старт/обратима химическа модификация

AmpliTaq Gold – активира се при висока температура

Горещ старт/обратима химическа модификация

HotStarTaq ДНК полимераза - активира се при висока температура

Boehringer Mannheim, New England Biolabs

Tth пирофосфатаза, термостабилна

GC-Melt (в комплекти Advantage-GC) – собствена собственост

Taq-FORCE система за усилване и MIGHTY буфер – собствена собственост

Комплект Eppendorf MasterTaq с TaqMaster Enhancer – собствена собственост

PCRx Enhancer System – собствена

E.coli Едноверижен свързващ протеин (SSB)

Perfect Match Polymerase Enhancer – патентован

TaqExtender PCR добавка – патентована

Критични параметри и отстраняване на неизправности

MgCl2 Концентрация

Определяне на оптималния MgCl2 концентрацията, която може да варира дори за различни праймери от една и съща област на даден шаблон (Saiki, 1989), може да има огромно влияние върху успеха на PCR. В този протокол се тестват три концентрации - 1,5 mM (L), 3,0 mM (M) и 4,5 mM (H) - срещу три подобритела. Усилвателите са склонни да разширяват MgCl2 оптимален диапазон, допринасящ за успеха на PCR при една от тези концентрации. 10 х буфер, оптимизиран за даден ензим и отделен флакон с MgCl2 обикновено са снабдени с полимераза, така че потребителят може да титрува MgCl2 концентрация за техния уникален комплект грунд-шаблон.

Чистота на реагента

За приложения, които усилват редки шаблони, чистотата на реагента е най-важният параметър и избягването на замърсяване на всяка стъпка е от решаващо значение.

За да поддържате чистотата, съхранявайте множество малки обеми от всеки реактив в епруветки с винтова капачка.

За много приложения просто използването на висококачествени реактиви и избягването на нуклеазно замърсяване е достатъчно, но избягвайте един общ реагент, използван за инактивиране на нуклеази, диетилпирокарбонат (DEPC). Дори малки количества химикал, останал след обработката на водата чрез автоклавиране, са достатъчни, за да развалят PCR.

Избор на грунд

Това е факторът, който е най-малко предвидим и най-труден за отстраняване на неизправности. Просто казано, някои грундове просто не работят. За да увеличите максимално вероятността дадена праймерна двойка да работи, обърнете внимание на следните параметри.

Общи съображения. Оптималният набор от праймери трябва да се хибридира ефективно с последователността, която представлява интерес с незначителна хибридизация с други последователности, присъстващи в пробата. Ако има налични разумни количества шаблон, специфичността на хибридизацията може да бъде тествана чрез извършване на олигонуклеотидна хибридизация, както е описано в МЕРНА ЕДИНИЦА Не е наличен. Разстоянието между праймерите е доста гъвкаво, вариращо до 10 kb. Може обаче да има значителен спад в ефективността на синтеза с разстояния >3 kb (Jeffreys et al., 1988). Малките разстояния между праймерите обаче намаляват способността за получаване на много информация за последователността или за повторно амплифициране с вложени вътрешни олигонуклеотиди, ако това е необходимо.

Проектирайте праймери, за да позволите демонстрация на специфичността на PCR продукта. Уверете се, че има диагностични рестрикционни ендонуклеазни места между праймерите или че олигонуклеотид може да открие PCR продукта специално чрез хибридизация.

Няколко компютърни програми могат да помогнат при проектирането на грунд (вижте Интернет ресурси в края на раздела). Те са най-полезни за избягване на набори от праймери с вътрешно- и междумолекулно допълване, което може драстично да повиши ефективната Tм. Като се има предвид изобилието от праймери спрямо шаблона, това може да попречи на грундирането на шаблона. Компютърният грунд дизайн не е безгрешен. Ако е възможно, започнете с грунд или комплект грундове, за които е известно, че ефективно грундират разширенията. В допълнение, уеб сайтовете на производителите предлагат техническа помощ при дизайна на грунд.

Допълняемост към шаблона. За много приложения праймерите са проектирани да допълват точно шаблона. За други, обаче, като инженерство на мутации или нови сайтове на рестрикционна ендонуклеаза, или за усилия за клониране или откриване на генни хомолози, където липсва информация за последователността, несъответствията на базовите двойки ще бъдат създадени умишлено или неизбежно. Най-добре е да има несъответствия (например в рестрикционен ендонуклеазен линкер) в 5′ края на праймера. Колкото по-близо е несъответствието до 3′ края на грунда, толкова по-вероятно е то да предотврати удължаване.

Използването на дегенерирани олигонуклеотидни праймери за клониране на гени, където е налична само протеинова последователност, или за извличане на генни хомолози в други видове, понякога е било успешно, но също така се е провалило безброй (и непубликувани) пъти. Когато реакцията работи, тя може да бъде изключително ценна, но също така може да генерира привидно специфични продукти, които изискват много труд за идентифициране и не дават полезна информация. Колкото по-малко дегенерират олигонуклеотидите, особено в 3′ края, толкова по-добре. Риск на купувача.

Дължина на грунда. Грундът трябва да е с дължина от 20 до 30 основи. Малко вероятно е по-дългите праймери да помогнат за значително увеличаване на специфичността.

Последователност на грунд. Проектирайте грундове със съдържание на GC, подобно на това на шаблона. Избягвайте праймери с необичайни разпределения на последователността, като участъци от полипурини или полипиримидини, тъй като тяхната вторична структура може да бъде катастрофална. Струва си да проверите за потенциална вторична структура, като използвате една от подходящите компютърни програми, които са налични.

"Праймер-димери." Праймерите-димери са често срещан артефакт, който най-често се наблюдава, когато малки количества шаблон се вземат през много амплификационни цикли. Те се образуват, когато 3′ края на единия праймер се отгрява до 3′ края на другия праймер и полимеразата след това разширява всеки праймер до края на другия. Полученият продукт може да се конкурира много ефективно с PCR продукта, който представлява интерес. Праймер-димерите могат най-добре да бъдат избегнати чрез използване на праймери без комплементарност, особено в техните 3′ краища. Ако се появят, оптимизиране на MgCl2 концентрацията може да сведе до минимум тяхното изобилие спрямо това на продукта от интерес.

Шаблон

Освен стандартните методи за приготвяне на ДНК ( МЕРНА ЕДИНИЦА Недостъпно - Недостъпно), са разработени редица прости и бързи процедури за определени тъкани (Higuchi, 1989). Дори относително разградени ДНК препарати могат да служат като полезни шаблони за генериране на PCR продукти с умерен размер. Двете основни притеснения по отношение на шаблона са чистотата и количеството.

Редица замърсители, открити в ДНК препарати, могат да намалят ефективността на PCR. Те включват урея, детергент SDS (чието инхибиращо действие може да бъде обърнато от нейонни детергенти), натриев ацетат и понякога компоненти, пренасяни при пречистването на ДНК от агарозни гелове (Gelfand, 1989 Gyllensten, 1989 K. Hicks и D. Coen, разпубликувайте. наблюдавайте.). Допълнителни органични екстракции, утаяване с етанол от 2,5 М амониев ацетат и/или пречистване на гел върху полиакриламид, а не агароза, могат да бъдат полезни за минимизиране на такова замърсяване, ако най-простият метод (утаяване на пробата с етанол и многократно промиване на пелетата с 70% пелетата ) не е достатъчно.

Ясно е, че количеството шаблон трябва да е достатъчно, за да може да се визуализира PCR продукти с помощта на етидиев бромид. Обикновено 100 ng геномна ДНК са достатъчни за откриване на PCR продукт от едно копие на ген на бозайник. Използването на твърде много шаблони не е препоръчително при оптимизиране за MgCl2 или други параметри, тъй като може да скрие разликите в ефективността на усилването. Нещо повече, твърде много шаблон може да намали ефективността поради замърсители в ДНК препарата.

Количеството шаблон, особено по отношение на количеството на целевата последователност спрямо неспецифичните последователности, може да има голям ефект върху добива на неспецифични продукти. При по -малка целева последователност е по -вероятно да се видят неспецифични продукти. За някои приложения, като например определени протоколи за секвениране на ДНК, където е важно да има един продукт, се препоръчва пречистване с гел на специфичния PCR продукт и повторно амплификация.

Taq и други термостабилни ДНК полимерази

Сред предимствата, предоставени от термостабилността на Taq ДНК полимеразата е нейната способност да издържа на многократно нагряване и охлаждане, присъщи на PCR, и да синтезира ДНК при високи температури, които стопяват несъответстващи праймери и региони на локална вторична структура. Ензимът обаче не е безкрайно устойчив на топлина и за най-голяма ефективност не трябва да се подлага на ненужни стъпки на денатурация. Всъщност някои протоколи (напр. МЕРНА ЕДИНИЦА Не е наличен и методът „горещ старт“, описан тук) препоръчваме добавянето му след първата стъпка на денатурация.

Увеличаване на размера на Taq ДНК полимеразата над 2,5 U/реакция понякога може да повиши ефективността на PCR, но само до известна степен. Добавянето на повече ензим понякога може да увеличи добива на неспецифични PCR продукти за сметка на продукта, който представлява интерес. Освен това, Taq ДНК полимеразата не е евтина.

Много важно свойство на Taq ДНК полимеразата е нейната степен на грешки, която първоначално беше оценена на 2 × 10 -4 нуклеотида/цикъл (Saiki et al., 1988). Пречистеният ензим, доставян от производителите, няма коригираща 3′⇒5′ екзонуклеазна активност, която намалява процента грешки на други полимерази, като фрагмента на Klenow от Е. coli ДНК полимераза I. За много приложения това не представлява никакви затруднения. Въпреки това, за секвениране на клонинги, получени от PCR, или когато започнете с много малко шаблони, това може да доведе до големи проблеми. Директно секвениране на PCR продукти ( МЕРНА ЕДИНИЦА Недостъпно), секвенирането на множество PCR-генерирани клонове и/или използването на подходящи отрицателни контроли може да помогне за преодоляването на тези проблеми. Алтернативно, промяна на реакционните условия (Eckert and Kunkel, 1990) или промяна на не-Taq ДНК полимераза (с по -голяма вярност) може да бъде полезна.

Друго важно свойство на Taq ДНК полимеразата е нейната склонност към добавяне на нешаблирани нуклеотиди към 3′ краищата на ДНК веригите. Това може да бъде особено проблематично при клониране на PCR продукти. Често е необходимо да се „полират“ PCR продуктите с ензими като други ДНК полимерази, преди да се добавят линкери или да се пристъпи към клониране с тъп край. Обратно, добавянето на несимплиран A от Taq ДНК полимеразата може да бъде полезна при клонирането ( МЕРНА ЕДИНИЦА Недостъпно).

Някои PCR протоколи могат да работят по -добре с една термостабилна полимераза, а не с друга. Таблица 4 изброява наличните в момента термостабилни ДНК полимерази по родови и търговски наименования, оригиналния източник на нативни и рекомбинантни ензими, доставчика, генерирания край (3'A добавяне срещу тъпи) и свързаните екзонуклеазни активности. 3′ до 5′ екзонуклеазна активност е корекция. Отстраняване на 5′ до 3′ екзонуклеазната активност на Taq Съобщава се, че ДНК полимеразата (N-терминална делеция) произвежда по-висок добив. 5′ до 3′ екзонуклеазна активност може да разгради донякъде праймерите. Ензимите за корекция синтезират ДНК с по-висока точност и могат да генерират по-дълги продукти от Taq, но са склонни да генерират ниски добиви. Ензимните смеси (Таблица 5) са оптимизирани за повишена прецизност и дължина, заедно с чувствителност и добив.

Taq (природен и/или рекомбинантен)

Ambion, Amersham Pharmacia Biotech, Boehringer Mannheim, Clontech, Fisher, Life Technologies, Marsh Biomedical, Perkin Elmer, Promega, Qiagen, Sigma, Stratagene

Taq, N-терминално изтриване

— а а За момента няма информация.

Promega, Epicenter Technologies

- а а За момента няма информация.

Thermococcus litoralis

New England Biolabs (Vent), Promega

Thermococcus litoralis

Amersham Pharmacia Biotech, Boehringer Mannheim, Epicenter Technologies, Perkin Elmer, Promega

Термостабилни ДНК полимерази и други компоненти

Разширете High Fidelity, Expand Long Template и Expand 20kb PCR Systems

KlenTaq LA полимеразна смес

KlenTaq-1 (дефицит на 5′-екзонуклеаза Taq) + неуточнена коректорна полимераза

KlenTaq-1 + неуточнена коректорна полимераза + TaqStart антитяло

Advantage-cDNA и Advantage-GC cDNA полимеразни смеси и комплекти

KlenTaq-1 + неуточнена коригираща полимераза + TaqStart Antibody GC Kit съдържа GC Melt

Advantage Genomic и Advantage-GC Genomic Polymerase Смеси и комплекти

Tth + неуточнена полимераза за корекция + TthStart GC комплект за антитяло съдържа GC Melt

Taq +Psp + неуточнена коректорна полимераза(и) + eLONGase буфер

Платинова Taq ДНК полимераза

Taq + Psp + платина Taq Антитяло

Платинена ДНК полимераза с висока точност

Taq + Psp + Taq Антитяло

Тбр с неуточнен подобрител

GeneAmp XL PCR и XL РНК PCR комплекти

OmniBase секвениращ ензим микс

Неопределена коректорска (и) полимераза (и) с термостабилна пирофосфатаза

AccuTaq LA ДНК полимеразна смес

Taq + неуточнена коректорна полимераза

TaqPlus Long и TaqPlus Precision PCR системи

Pfu+Taq TaqPlus Precision Reaction Buffer (собствено)

Accurase Fidelity PCR ензимен микс Calypso High Fidelity Single Tube RT-PCR система

Thermus sp. + Thermococcus sp. Calypso също съдържа AMV-RT

Горещ старт

Това, което се случва преди термичния цикъл, е от решаващо значение за успеха на PCR. Taq ДНК полимеразата запазва известна активност дори при стайна температура. Следователно, при нестроги условия на отгряване, като например при стайна температура, продуктите могат да бъдат генерирани от отгряване на праймери към целева ДНК на места с ниска комплементарност или имащи комплементарност само от няколко нуклеотида в 3′ краищата. Последните на практика биха създали нови шаблони, „маркирани“ с праймерните последователности. Следващите цикли усилват тези маркирани последователности в изобилие, като генерират неспецифични продукти и вероятно намаляват ефективността на амплификация на специфични продукти чрез конкуренция за субстрати или полимераза. По този начин са желателни условия, предотвратяващи полимеризацията преди първите етапи с контролирана температура. В този протокол се сравняват три метода за инхибиране на полимеризацията преди етапа с контролирана температура. Те включват физическо отделяне на съществен реакционен компонент преди първия етап на денатурация, охлаждане на реагентите до 0°C и обратимо блокиране на ензимната активност с антитяло.

Денатурация на шаблона преди Taq полимераза или MgCl2 Добавя се към реакцията осигурява драматично подобрение на специфичността и чувствителността в много случаи (Chou et al., 1992). Основният недостатък на този метод е, че изисква отваряне на реакционните епруветки втори път, за да се добави основният липсващ компонент. Това създава както неудобство, така и увеличаване на риска от замърсяване, което е важно съображение при тестване за наличието на дадена последователност в експериментални или клинични проби.

Охлаждането на всички компоненти на реакционната смес до 0°С преди смесването е по-удобен и най-евтиният метод, но е и най-малко надеждният. Прехвърлянето на PCR реакционните епруветки от ледената суспензия в предварително загрят до 95°C термоцикличен блок може да подобри шанса за успех.

Обратимо инхибиране на Taq ДНК полимеразата от TaqStart антитяло (Clontech) е най-удобният и много ефективен метод (Kellogg et al., 1994). Пълните реакции могат да бъдат настроени, покрити с масло и съхранявани при 4°C до няколко часа преди термичния цикъл без загуба на чувствителност или специфичност в сравнение с другите методи за горещ старт (MF Kramer и DM Coen, unpub. observ.). .). Цикълът започва веднага след 5-минутна денатурация на антитялото при 94°С. DMSO инхибира свързването на антитела и не трябва да се използва с TaqStart.

Няколко продукта за горещ старт вече се предлагат в търговската мрежа (Таблица 3). Успехът с всеки може да зависи от стриктното спазване на протоколите на производителя, дори и на конкретен термоциклер. Восъчните бариери и обратимите методи за свързване на антитела са по-прощаващи, докато химическите модификации имат по-строги изисквания за температура на активиране.

Дезоксирибонуклеозидни трифосфати

В опит да се увеличи ефективността на PCR, може да е изкушаващо да се увеличи концентрацията на dNTPs. Недей! Когато всеки dNTP е 200 mM, има достатъчно, за да се синтезират 12,5 mg ДНК, когато половината от dNTP са включени. dNTPs хелатират магнезий и по този начин променят ефективната оптимална концентрация на магнезий. Освен това, концентрациите на dNTP >gt200 mM всяка увеличават степента на грешка на полимеразата. Милимоларните концентрации на dNTP всъщност инхибират Taq ДНК полимераза (Gelfand, 1989).

Протоколът в това устройство изисква приготвяне на 4dNTPs в 10 mM Tris⋅Cl/1 mM EDTA (TE буфер), pH 7,4 до 7,5. Това е по-лесно и по-малко податливо на бедствие, отколкото неутрализиране с натриев хидроксид. Въпреки това, EDTA също хелатира магнезий и това трябва да се има предвид, ако запасите от dNTP се променят. Като алтернатива, за да се намали рискът от замърсяване, може да се направи смес от 4dNTP чрез комбиниране на равни обеми от търговски приготвени запаси.

Подобрители

Подобрителите се използват за увеличаване на добива и специфичността и за преодоляване на трудностите, срещани с високо съдържание на GC или дълги шаблони. Нейонните детергенти (Triton X-100, Tween 20 или Nonidet P-40) неутрализират зарядите на йонните детергенти, често използвани при подготовката на шаблони, и трябва да се използват в основната реакционна смес, а не като допълнителни подобрители. По-високи добиви могат да бъдат постигнати чрез стабилизиране/усилване на полимеразната активност с ензим-стабилизиращи протеини (BSA или желатин), ензим-стабилизиращи разтвори като бетаин или бетаин⋅HCl (TMAC), стабилизиращи ензима разтворители (глицерол), разтворители, подобряващи разтворимостта (DMSO или ацетамид), молекулярни разтворители (PEG) и предпочитания за полимеразна сол [(NH4)ТАКА4 се препоръчва за полимерази, различни от Taq]. По-голяма специфичност може да се постигне чрез намаляване на TМ на dsDNA (използвайки формамид), дестабилизиращо отгряване на несъответстващия праймер (използвайки PMPE или стратегии за горещ старт) и стабилизиращо ssDNA (използвайки Е. coli SSB или T4 ген 32 протеин). Усилването на шаблони с високо съдържание на GC може да бъде подобрено чрез намаляване на зависимостта на състава на основната двойка от TМ на dsDNA (с бетаин Rees et al., 1993). Бетаинът е осмолит, широко разпространен в растенията и животните и е нетоксичен, характеристика, която го препоръчва за удобство при работа, съхранение и изхвърляне. Бетаинът може да бъде патентована съставка в различни търговски формулировки. За дълги шаблони се препоръчва по-високо pH (pH 9,0). pH на Tris буфера намалява при високи температури, PCR с дълги шаблони изисква повече време при високи температури, а увеличеното време при по-ниско pH може да причини известно депуриниране на шаблона, което води до намален добив на специфичен продукт. Неорганичният фосфат (PPi), продукт на синтеза на ДНК, може да се натрупва с амплификация на дълги продукти до нива, които могат да благоприятстват обръщането на полимеризацията. Натрупването на PPi може да бъде предотвратено чрез добавяне на термостабилна PPase. Когато се анализират голям брой проби, удобството при добавяне на PCR продукти директно към гел представлява значително спестяване на време. Някои компании комбинират своята термостабилна полимераза с червено багрило и компонент с висока плътност, за да улеснят зареждането на реакционните продукти върху гелове без допълнително добавяне на буфер за зареждане.

Параметри на топлинния цикъл

Всяка стъпка от цикъла изисква минимално време, за да бъде ефективна, докато твърде много време може да бъде разточително и вредно за ДНК полимеразата. Ако времето за всяка стъпка може да бъде намалено, толкова по -добре.

Денатурация. От решаващо значение е по време на етапа на денатурация да настъпи пълно разделяне на нишките. Това е едномолекулна реакция, която сама по себе си е много бърза. Предложената 30-секундна денатурация, използвана в протокола, гарантира, че съдържанието на епруветката достига 94°C. Ако PCR не работи, си струва да проверите температурата в контролна епруветка, съдържаща 100 µl вода. Ако съдържанието на GC е изключително високо, може да са необходими по-високи температури на денатурация обаче, Taq Активността на ДНК полимеразата бързо намалява при по -високи температури (Gelfand, 1989). За да амплифицирате дълга последователност (>3 kb), минимизирайте времето за денатурация, за да защитите целевата ДНК от възможни ефекти, като депуриниране, на понижено рН на Tris буфера при повишени температури.

Отгряване. От решаващо значение е праймерите да се отгряват стабилно към шаблона. Грундове с относително ниско съдържание на GC (

Удължаване. Температурата на удължаване от 72°C е близка до оптималната температура за Taq ДНК полимераза (∼75°C), но предпазва праймерите от падане. Всъщност удължаването на грунда започва по време на отгряване, т.к Taq ДНК полимеразата е частично активна при 55°C и дори по-ниски температури (Gelfand, 1989).

Продължителността на удължаването зависи главно от дължината на последователността, която трябва да се амплифицира. Обикновено е достатъчна продължителност от 1 минута на kb дължина на продукта.

Някои протоколи, включително други в тази глава, завършват PCR с дълго време за окончателно удължаване в опит да се направят продуктите възможно най-пълни.

Време на рампа. Времето за нарастване се отнася до времето, необходимо за преминаване от една температура към друга. Използването на водни бани и ръчното преместване на пробите от температура на температура вероятно дава най-кратките времена на нарастване, които са основно времето, необходимо за промяна на температурата на съдържанието на епруветката. Различните термоциклери имат различни времена на нарастване по принцип, колкото по-кратки, толкова по-добре.

Робоциклерът Stratagene използва роботизирано рамо за преместване на проби от един блок с постоянна температура в друг, на практика елиминирайки времето за рампа на блока, но времето за рампа за съдържанието на тръбата трябва да бъде изчислено (∼1 сек/° C) и добавено към денатурация, отгряване, и времена за удължаване. Бързите цикли, които използват върхове за пипети с положително изместване или капилярни тръби за PCR реакциите, драстично намаляват времето за нарастване.

Като цяло, по-„високопроизводителните“ термоциклери с кратки времена на нарастване са пропорционално по-скъпи. На пазара има много нови термоциклери на цена под $5000, които се представят доста добре (Beck, 1998).

Очаквани резултати

Започвайки с ≥100 ng ДНК на бозайник (≥10 4 молекули), може да се използва, за да се определи кой MgCl2 концентрацията, подобряващата добавка и началните условия ще доведат до преобладаващ PCR продукт от последователност с едно копие, която е лесно видима върху гел, оцветен с етидиев бромид. Възможно е да се виждат и други второстепенни продукти.

Съображения за време

Може да бъде завършен за един ден. Сглобяването на реакционните смеси трябва да отнеме ~1 час. Колоезденето трябва да отнеме по-малко от 3 часа. Подготовката, пускането и оцветяването на гела трябва да отнеме още няколко часа. По-нататъшни проверки на специфичността на продукта, като разграждане с рестрикционна ендонуклеаза или Southern блот хибридизация, ще отнеме още няколко часа или дни, съответно.


Механизъм на действие:

Дългата верига на едноверижната сонда съдържа флуорохрома или радиомаркирано съединение на своя край.

След като намери своята комплементарна последователност върху шаблонната ДНК, която се свързва с нея, флуорохромът се освобождава и излъчва флуоресценция, която се измерва от детектора.

По този начин количеството на излъчваната флуоресценция е право пропорционално на хибридизацията на сондата.

При точната температура на отгряване праймерът се свързва със своята комплементарна последователност. След като се случи отгряването, Taq ДНК полимеразата започва да вмъква dNTP до 3' края, докато достигне края на веригата.

В края на реакцията се генерира нова ДНК молекула.


Съдържание

PCR амплифицира специфичен регион на ДНК верига (ДНК мишената). Повечето PCR методи амплифицират ДНК фрагменти с дължина между 0,1 и 10 kg базови двойки (kbp), въпреки че някои техники позволяват амплификация на фрагменти до 40 kbp. [5] Количеството на амплифицирания продукт се определя от наличните субстрати в реакцията, което става ограничаващо с напредването на реакцията. [6]

Основната настройка на PCR изисква няколко компонента и реагенти, [7] включително:

  • а ДНК шаблон който съдържа целевия регион на ДНК за усилване
  • а ДНК полимераза ензим, който полимеризира нови нишки на ДНК, устойчив на топлина Taq полимеразата е особено разпространена [8], тъй като е по-вероятно да остане непокътната по време на процеса на денатурация на ДНК при висока температура
  • две ДНК грундове които са комплементарни към 3′ (трите основни) края на всяка от сетивните и антисенс вериги на ДНК целта (ДНК полимеразата може да се свърже и да се удължи само от двуверижна област на ДНК без праймери, няма двойна -свързано място на иницииране, на което полимеразата може да се свърже) [9] специфични праймери, които са комплементарни на целевия регион на ДНК, се избират предварително и често се изработват по поръчка в лаборатория или се купуват от търговски доставчици на биохимия
  • дезоксинуклеозид трифосфат, или dNTPs (понякога наричани нуклеотиди "дезоксинуклеотидни трифосфати", съдържащи трифосфатни групи), градивните елементи, от които ДНК полимеразата синтезира нова ДНК верига
  • а буферен разтвор осигуряване на подходяща химическа среда за оптимална активност и стабилност на ДНК полимеразата
  • бивалентни калции, обикновено магнезиеви (Mg) или манганови (Mn) йони Mg 2+ е най-често срещаният, но Mn 2+ може да се използва за PCR-медиирана ДНК мутагенеза, тъй като по-високата концентрация на Mn 2+ увеличава процента на грешки по време на синтеза на ДНК [10 ] и едновалентни катиони, обикновено калиеви (К) йони [необходим по-добър източник]

Реакцията обикновено се провежда в обем от 10–200 μL в малки реакционни епруветки (0,2–0,5 mL обеми) в термичен цикъл. Термичният циклер загрява и охлажда реакционните тръби, за да постигне необходимите температури на всеки етап от реакцията (вижте по-долу). Много съвременни термоциклери използват ефекта на Пелтие, който позволява едновременно нагряване и охлаждане на блока, който държи PCR тръбите, просто чрез обръщане на електрическия ток. Тънкостенните реакционни тръби позволяват благоприятна топлопроводимост, за да позволят бързо термично равновесие. Повечето термоциклери имат нагрявани капаци за предотвратяване на кондензация в горната част на реакционната тръба. По-старите термоциклери без нагрят капак изискват слой масло върху реакционната смес или топка восък вътре в тръбата.

Редактиране на процедурата

Обикновено PCR се състои от поредица от 20–40 повтарящи се температурни промени, наречени термични цикли, като всеки цикъл обикновено се състои от две или три дискретни температурни стъпки (виж фигурата по-долу). Цикълът често се предшества от единична температурна стъпка при много висока температура (>90 °C (194 °F)) и последвано от едно задържане в края за удължаване на крайния продукт или кратко съхранение. Използваните температури и продължителността на времето, през което се прилагат във всеки цикъл, зависят от различни параметри, включително ензима, използван за синтеза на ДНК, концентрацията на двувалентни йони и dNTP в реакцията и температурата на топене (Tм) на праймерите. [11] Индивидуалните стъпки, общи за повечето PCR методи, са както следва:

  • Инициализация: Тази стъпка е необходима само за ДНК полимерази, които изискват топлинно активиране чрез PCR с горещ старт. [12] Състои се от нагряване на реакционната камера до температура от 94–96 °C (201–205 °F) или 98 °C (208 °F), ако се използват изключително термостабилни полимерази, която след това се задържа за 1– 10 минути.
  • Денатурация: Тази стъпка е първото редовно циклично събитие и се състои в нагряване на реакционната камера до 94–98 °C (201–208 °F) за 20–30 секунди. Това причинява стопяване или денатурация на ДНК на двуверижната ДНК матрица чрез разкъсване на водородните връзки между комплементарните бази, което води до получаване на две едноверижни ДНК молекули.
  • Отгряване: В следващата стъпка реакционната температура се понижава до 50–65 °C (122–149 °F) за 20–40 секунди, което позволява отгряване на праймерите към всеки от едноверижните ДНК шаблони. Два различни праймера обикновено са включени в реакционната смес: по един за всеки от двата едноверижни комплемента, съдържащи целевата област. Самите праймери са едноверижни последователности, но са много по-къси от дължината на целевата област, допълвайки само много къси последователности в 3′ края на всяка верига.
  • Удължаване/удължаване: Температурата на тази стъпка зависи от използваната ДНК полимераза, оптималната температура на активност за термостабилната ДНК полимераза на Taq полимеразата е приблизително 75–80 °C (167–176 °F), [13][14] въпреки че температурата от 72 °C (162 °F) обикновено се използва с този ензим. В тази стъпка ДНК полимеразата синтезира нова ДНК верига, комплементарна на ДНК шаблонната верига чрез добавяне на свободни dNTPs от реакционната смес, която е комплементарна на матрицата в посока 5′-до-3′, кондензирайки 5′-фосфатната група на dNTPs с 3'-хидрокси групата в края на зараждащата се (удължаваща) ДНК верига. Точното време, необходимо за удължаване, зависи както от използваната ДНК полимераза, така и от дължината на ДНК целевия регион за амплификация. По правило, при оптималната си температура повечето ДНК полимерази полимеризират хиляда бази в минута. При оптимални условия (т.е. ако няма ограничения поради ограничаващи субстрати или реактиви), на всеки етап на удължаване/удължаване, броят на ДНК целевите последователности се удвоява. С всеки следващ цикъл, оригиналните шаблонни вериги плюс всички новогенерирани вериги стават шаблонни вериги за следващия кръг на удължаване, което води до експоненциално (геометрично) усилване на специфичния ДНК целеви регион.
  • Окончателно удължаване: Тази единична стъпка е по избор, но се извършва при температура от 70–74 °C (158–165 °F) (температурният диапазон, необходим за оптимална активност на повечето полимерази, използвани в PCR) за 5–15 минути след последната PCR цикъл, за да се гарантира, че всяка останала едноверижна ДНК е напълно удължена.
  • Окончателно задържане: Последната стъпка охлажда реакционната камера до 4–15 °C (39–59 °F) за неопределено време и може да се използва за краткосрочно съхранение на PCR продуктите.

За да се провери дали PCR успешно генерира очакваната ДНК целева област (също понякога наричана амплимер или ампликон), може да се използва електрофореза в агарозен гел за разделяне на размера на PCR продуктите. Размерът на PCR продуктите се определя чрез сравнение с ДНК стълба, маркер за молекулно тегло, който съдържа ДНК фрагменти с известни размери, който минава върху гела заедно с PCR продуктите.

Етапи Редактиране

Както при други химични реакции, скоростта на реакцията и ефективността на PCR се влияят от ограничаващи фактори. По този начин целият PCR процес може допълнително да бъде разделен на три етапа въз основа на напредъка на реакцията:

  • Експоненциално усилване: При всеки цикъл количеството на продукта се удвоява (при 100% ефективност на реакцията). След 30 цикъла едно копие на ДНК може да бъде увеличено до 1 000 000 000 (един милиард) копия. В известен смисъл репликацията на дискретна верига ДНК се манипулира в тръба при контролирани условия. [15] Реакцията е много чувствителна: трябва да присъстват само малки количества ДНК.
  • Изравняване извън сцената: Реакцията се забавя, тъй като ДНК полимеразата губи активност и когато консумацията на реагенти, като dNTP и праймери, ги кара да станат по-ограничени.
  • плато: Повече продукт не се натрупва поради изчерпване на реагентите и ензима.

На практика PCR може да се провали поради различни причини, отчасти поради чувствителността му към замърсяване, което причинява амплификация на фалшиви ДНК продукти. Поради това са разработени редица техники и процедури за оптимизиране на PCR условията. [16] [17] Замърсяването с външна ДНК се разрешава с лабораторни протоколи и процедури, които отделят предварително PCR смеси от потенциални ДНК замърсители. [7] Това обикновено включва пространствено разделяне на областите за настройка на PCR от зоните за анализ или пречистване на PCR продукти, използване на пластмасови съдове за еднократна употреба и щателно почистване на работната повърхност между настройките на реакцията. Техниките за проектиране на праймер са важни за подобряване на добива на PCR продукт и за избягване на образуването на фалшиви продукти, а използването на алтернативни буферни компоненти или полимеразни ензими може да помогне за амплификация на дълги или по друг начин проблемни области на ДНК. Добавянето на реактиви, като формамид, в буферни системи може да увеличи специфичността и добива на PCR. [18] Могат да се извършат компютърни симулации на теоретични резултати от PCR (електронна PCR), за да се подпомогне проектирането на праймера. [19]

Селективно изолиране на ДНК Редактиране

PCR позволява изолиране на ДНК фрагменти от геномна ДНК чрез селективна амплификация на специфичен регион на ДНК. Това използване на PCR увеличава много начини, като генериране на хибридизационни сонди за южна или северна хибридизация и клониране на ДНК, които изискват по -големи количества ДНК, представляващи специфичен ДНК регион. PCR доставя тези техники с големи количества чиста ДНК, позволявайки анализ на ДНК проби дори от много малки количества изходен материал.

Други приложения на PCR включват ДНК секвениране за определяне на неизвестни PCR-амплифицирани последователности, в които един от амплификационните праймери може да се използва при секвениране на Sanger, изолиране на ДНК последователност за ускоряване на рекомбинантни ДНК технологии, включващи вмъкване на ДНК последователност в плазмид, фаг , или космид (в зависимост от размера) или генетичния материал на друг организъм. Бактериални колонии (като E. coli) могат бързо да бъдат скринирани чрез PCR за правилни ДНК векторни конструкции. [20] PCR може също да се използва за генетично снемане на пръстови отпечатъци, криминалистична техника, използвана за идентифициране на човек или организъм чрез сравняване на експериментални ДНК чрез различни методи, базирани на PCR.

Някои методи за PCR пръстови отпечатъци имат висока дискриминационна сила и могат да се използват за идентифициране на генетични връзки между индивиди, като родител-дете или между братя и сестри, и се използват при тестване за бащинство (фиг. 4). Тази техника може също да се използва за определяне на еволюционните връзки между организмите, когато се използват определени молекулни часовници (т.е. 16S рРНК и recA гени на микроорганизми). [21]

Амплификация и количествено определяне на ДНК Редактиране

Тъй като PCR усилва областите на ДНК, към които е насочена, PCR може да се използва за анализ на изключително малки количества от пробата. Това често е критично за съдебномедицинския анализ, когато само следи от ДНК са налични като доказателство. PCR може да се използва и при анализа на древна ДНК, която е на десетки хиляди години. Тези базирани на PCR техники са били успешно използвани върху животни, като четиридесет хиляди годишен мамут, а също и върху човешка ДНК, в приложения, вариращи от анализа на египетски мумии до идентифицирането на руски цар и тялото на Английският крал Ричард III. [22]

Методите за количествена PCR или PCR в реално време (qPCR, [23] да не се бъркат с RT-PCR) позволяват оценка на количеството на дадена последователност, присъстваща в пробата – техника, която често се прилага за количествено определяне на нивата на генна експресия. Количествената PCR е утвърден инструмент за количествено определяне на ДНК, който измерва натрупването на ДНК продукт след всеки кръг на PCR амплификация.

qPCR позволява количествено определяне и откриване на специфична ДНК последователност в реално време, тъй като измерва концентрацията, докато се извършва процесът на синтез. Има два метода за едновременно откриване и количествено определяне. Първият метод се състои в използване на флуоресцентни багрила, които се задържат неспецифично между двойните нишки. Вторият метод включва сонди, които кодират специфични последователности и са флуоресцентно белязани. Откриването на ДНК с помощта на тези методи може да се види само след като се извърши хибридизация на сондите с нейната комплементарна ДНК. Интересна комбинация от техники е PCR в реално време и обратната транскрипция. Тази сложна техника, наречена RT-qPCR, позволява количествено определяне на малко количество РНК. Чрез тази комбинирана техника тРНК се превръща в сДНК, която допълнително се определя количествено с помощта на qPCR. Тази техника намалява възможността за грешка в крайната точка на PCR, [24] увеличава шансовете за откриване на гени, свързани с генетични заболявания като рак. [4] Лабораториите използват RT-qPCR за целите на чувствителното измерване на генната регулация. Математическите основи за надеждно количествено определяне на PCR [25] и RT-qPCR [26] улесняват прилагането на точни процедури за напасване на експериментални данни в изследователски, медицински, диагностични и инфекциозни приложения. [27] [28] [29] [30]

Медицински и диагностични приложения Редактиране

Бъдещите родители могат да бъдат тествани за генетични носители или децата им могат да бъдат тествани за действително засегнати от заболяване. [1] ДНК проби за пренатално изследване могат да бъдат получени чрез амниоцентеза, вземане на проби от хорионни въси или дори чрез анализ на редки фетални клетки, циркулиращи в кръвообращението на майката. PCR анализът също е от съществено значение за предимплантационна генетична диагностика, където отделни клетки на развиващ се ембрион се тестват за мутации.

  • PCR може да се използва и като част от чувствителен тест за типизиране на тъкани, жизненоважни за трансплантацията на органи. От 2008 г. [актуализация] дори има предложение за замяна на традиционните тестове за кръвна група, базирани на антитела, с тестове, базирани на PCR. [31]
  • Много форми на рак включват промени в онкогени. Използвайки PCR-базирани тестове за изследване на тези мутации, схемите на лечение понякога могат да бъдат индивидуално персонализирани за пациента. PCR позволява ранна диагностика на злокачествени заболявания като левкемия и лимфоми, което понастоящем е най-добре развитото в изследванията на рака и вече се използва рутинно. PCR анализите могат да се извършват директно върху геномни ДНК проби за откриване на специфични за транслокацията злокачествени клетки при чувствителност, която е поне 10 000 пъти по-висока от тази на други методи. [32] PCR е много полезен в медицинската област, тъй като позволява изолирането и амплификацията на туморни супресори. Количествената PCR например може да се използва за количествено определяне и анализ на единични клетки, както и за разпознаване на ДНК, иРНК и протеинови потвърждения и комбинации. [24]

Приложения за инфекциозни болести Редактиране

PCR позволява бърза и много специфична диагностика на инфекциозни заболявания, включително тези, причинени от бактерии или вируси. [33] PCR позволява също идентифициране на некултивируеми или бавно растящи микроорганизми като микобактерии, анаеробни бактерии или вируси от анализи на тъканни култури и животински модели. Основата за PCR диагностичните приложения в микробиологията е откриването на инфекциозни агенти и разграничаването на непатогенни от патогенни щамове по силата на специфични гени. [33] [34]

Характеристиката и откриването на инфекциозни болестни организми бяха революционизирани чрез PCR по следните начини:

  • В вирус на човешкия имунодефицит (или ХИВ) е трудна за намиране и изкореняване цел. Най-ранните тестове за инфекция разчитаха на наличието на антитела срещу вируса, циркулиращи в кръвния поток. Въпреки това, антителата се появяват едва много седмици след заразяването, антителата на майката маскират инфекцията на новородено, а терапевтичните средства за борба с инфекцията не засягат антителата. Разработени са PCR тестове, които могат да открият само един вирусен геном сред ДНК на над 50 000 клетки гостоприемници. [35] Инфекциите могат да бъдат открити по-рано, дарената кръв може да бъде изследвана директно за вируса, новородените могат да бъдат незабавно тествани за инфекция и ефектите от антивирусните лечения могат да бъдат количествено определени.
  • Някои болестни организми, като този за туберкулоза, са трудни за вземане на проби от пациенти и бавно се отглеждат в лабораторията. Тестовете, базирани на PCR, позволяват откриване на малък брой болестни организми (както живи, така и мъртви) в удобни проби. Подробен генетичен анализ може да се използва и за откриване на антибиотична резистентност, което позволява незабавна и ефективна терапия. Ефектите от терапията също могат да бъдат оценени незабавно.
  • Разпространението на a болестен организъм чрез популации от домашни или диви животни могат да бъдат наблюдавани чрез PCR тестване. В много случаи появата на нови вирулентни подтипове може да бъде открита и проследена. Подтиповете на организма, които са били отговорни за по-ранните епидемии, също могат да бъдат определени чрез PCR анализ.
  • Вирусната ДНК може да бъде открита чрез PCR. Използваните праймери трябва да са специфични за целевите последователности в ДНК на вируса и PCR може да се използва за диагностични анализи или ДНК секвениране на вирусния геном. Високата чувствителност на PCR позволява откриване на вируса скоро след инфекцията и дори преди началото на заболяването. [33] Такова ранно откриване може да даде на лекарите значително време за лечение. Количеството на вируса ("вирусен товар") в пациента може също да бъде количествено определено чрез PCR-базирани техники за количествено определяне на ДНК (вижте по-долу). Вариант на PCR (RT-PCR) се използва за откриване на вирусна РНК, а не на ДНК: в този тест ензимът обратна транскриптаза се използва за генериране на ДНК последователност, която съответства на вирусната РНК, тази ДНК след това се амплифицира съгласно обичайния PCR метод. RT-PCR се използва широко за откриване на вирусния геном на SARS-CoV-2. [36]
  • Болести като коклюш (или магарешка кашлица) се причиняват от бактериите Bordetella pertussis. Тази бактерия е белязана от сериозна остра респираторна инфекция, която засяга различни животни и хора и е довела до смъртта на много малки деца. Коклюшният токсин е белтъчен екзотоксин, който се свързва с клетъчните рецептори с два димера и реагира с различни типове клетки, като Т лимфоцити, които играят роля в клетъчния имунитет. [37] PCR е важен инструмент за тестване, който може да открие последователности в гена за коклюшния токсин. Тъй като PCR има висока чувствителност към токсина и бързо време за обработка, той е много ефективен за диагностициране на коклюш в сравнение с културата. [38]

Криминалистични приложения Редактиране

Разработването на PCR-базирани генетични (или ДНК) протоколи за пръстови отпечатъци има широко приложение в криминалистиката:

  • В най-дискриминиращата си форма, генетичен отпечатък може уникално да дискриминира всеки един човек от цялото население на света. Минутни проби от ДНК могат да бъдат изолирани от местопрестъплението и сравнени с тези от заподозрени или от ДНК база данни с по-ранни доказателства или осъдени. По-простите версии на тези тестове често се използват за бързо изключване на заподозрени по време на наказателно разследване. Доказателствата от десетилетни престъпления могат да бъдат тествани, потвърждавайки или оневинявайки хората, първоначално осъдени.
  • Съдебното ДНК типизиране е ефективен начин за идентифициране или оневиняване на заподозрени в престъпление поради анализ на доказателства, открити на местопрестъплението. Човешкият геном има много повтарящи се региони, които могат да бъдат намерени в генни последователности или в некодиращи региони на генома. По -конкретно, до 40% от човешката ДНК се повтаря. [4] Има две отделни категории за тези повтарящи се, некодиращи региони в генома. Първата категория се нарича тандемни повторения с променлив брой (VNTR), които са дълги 10–100 базови двойки, а втората категория се нарича къси тандемни повторения (STR) и те се състоят от повтарящи се 2–10 базови двойки секции. PCR се използва за амплифициране на няколко добре познати VNTR и STR, като се използват праймери, които обграждат всеки от повтарящите се региони. Размерите на фрагментите, получени от всеки индивид за всеки от STR, ще покажат кои алели присъстват. Чрез анализиране на няколко STR за дадено лице ще бъде намерен набор от алели за всеки човек, които статистически вероятно ще бъдат уникални. [4] Изследователите са идентифицирали пълната последователност на човешкия геном. Тази последователност може да бъде лесно достъпна чрез уебсайта на NCBI и се използва в много приложения от реалния живот. Например, ФБР е съставило набор от ДНК маркерни сайтове, използвани за идентификация, и те се наричат ​​​​комбинирана ДНК индексна система (CODIS) ДНК база данни. [4] Използването на тази база данни позволява да се използва статистически анализ за определяне на вероятността ДНК проба да съвпадне. PCR е много мощен и значим аналитичен инструмент за съдебно типизиране на ДНК, тъй като изследователите се нуждаят само от много малко количество от целевата ДНК, за да се използва за анализ. Например, една човешка коса с прикрепен космеен фоликул има достатъчно ДНК за провеждане на анализа. По същия начин, няколко сперматозоиди, проби от кожата под ноктите или малко количество кръв могат да осигурят достатъчно ДНК за окончателен анализ. [4]
  • По-малко дискриминиращите форми на ДНК пръстови отпечатъци могат да помогнат ДНК тест за бащинство, където дадено лице е съпоставено с неговите близки роднини. ДНК от неидентифицирани човешки останки може да бъде тествана и сравнена с тази от възможни родители, братя и сестри или деца. Подобно изследване може да се използва за потвърждаване на биологичните родители на осиновено (или отвлечено) дете. Действителният биологичен баща на новородено също може да бъде потвърден (или изключен).
  • Дизайнът на PCR AMGX/AMGY е показан не само [необходимо уточнение] улеснява амплифицирането на ДНК последователности от много минимално количество геном. Въпреки това, той може да се използва и за определяне на пола в реално време от проби от съдебни кости. Това осигурява мощен и ефективен начин за определяне на пола в съдебномедицински случаи и древни екземпляри. [39]

Изследователски приложения Редактиране

PCR се прилага в много области на изследвания в молекулярната генетика:

  • PCR позволява бързо производство на къси парчета ДНК, дори когато е известна не повече от последователността на двата праймера. Тази способност на PCR увеличава много методи, като генериране хибридизационни сонди за Southern или Northern блот хибридизация. PCR доставя на тези техники големи количества чиста ДНК, понякога като единична верига, позволявайки анализ дори от много малки количества изходен материал.
  • Задачата на ДНК секвениране може да се подпомогне и чрез PCR. Известни сегменти от ДНК могат лесно да бъдат произведени от пациент с мутация на генетично заболяване. Модификациите на техниката на амплификация могат да извлекат сегменти от напълно неизвестен геном или могат да генерират само една верига от област от интерес.
  • PCR има множество приложения към по -традиционния процес на ДНК клониране. Той може да извлича сегменти за вмъкване във вектор от по-голям геном, който може да бъде наличен само в малки количества. Използвайки единичен набор от „векторни праймери“, той може също да анализира или извлича фрагменти, които вече са били вмъкнати във вектори. Някои промени в PCR протокола могат генерират мутации (общо или насочено към сайта) на вмъкнат фрагмент.
  • Маркирани с последователност сайтове е процес, при който PCR се използва като индикатор, че определен сегмент от генома присъства в конкретен клон. Проектът за човешкия геном установи, че това приложение е жизненоважно за картографиране на космическите клонове, които секвенират, и за координиране на резултатите от различни лаборатории.
  • Приложение на PCR е филогенният анализ на ДНК от древни източници, като този, открит в възстановените кости на неандерталци, от замразени тъкани на мамути или от мозъка на египетски мумии. [15] В някои случаи силно разградената ДНК от тези източници може да бъде сглобена отново по време на ранните етапи на амплификация.
  • Често срещано приложение на PCR е изследването на модели на генната експресия. Тъканите (или дори отделните клетки) могат да бъдат анализирани на различни етапи, за да се види кои гени са станали активни или кои са били изключени. Това приложение може също да използва количествен PCR за количествено определяне на действителните нива на експресия
  • Способността на PCR едновременно да амплифицира няколко локуса от отделни сперматозоиди [40] значително подобри по -традиционната задача на генетично картографиране чрез изучаване на хромозомни кросоувъри след мейоза. Редки събития на кръстосване между много близки локуси са наблюдавани директно чрез анализ на хиляди отделни сперматозоиди. По подобен начин могат да се анализират необичайни делеции, вмъквания, транслокации или инверсии, без да се налага да се чака (или плаща) за дългите и трудоемки процеси на оплождане, ембриогенеза и т.н.: PCR може да се използва за създаване на мутантни гени с мутации, избрани от учени по желание. Тези мутации могат да бъдат избрани, за да се разбере как протеините изпълняват своите функции и да променят или подобрят функцията на протеина.

PCR има редица предимства. Той е доста лесен за разбиране и използване и дава резултати бързо. Техниката е силно чувствителна с потенциал да произвежда милиони до милиарди копия на специфичен продукт за секвениране, клониране и анализ. qRT-PCR споделя същите предимства като PCR, с допълнително предимство на количественото определяне на синтезирания продукт. Следователно, той има своите приложения за анализиране на промени в нивата на генна експресия в тумори, микроби или други болестни състояния. [24]

PCR е много мощен и практичен инструмент за изследване.Последователността на неизвестни етиологии на много заболявания се установява чрез PCR. Техниката може да помогне за идентифициране на последователността от неизвестни досега вируси, свързани с вече известните, и по този начин да ни даде по-добро разбиране на самата болест. Ако процедурата може да бъде допълнително опростена и могат да се разработят чувствителни нерадиометрични системи за откриване, PCR ще заеме видно място в клиничната лаборатория за години напред. [15]

Едно основно ограничение на PCR е, че е необходима предварителна информация за целевата последователност, за да се генерират праймерите, които ще позволят нейното селективно усилване. [24] Това означава, че обикновено потребителите на PCR трябва да знаят точната последователност(и) преди целевия регион на всеки от двата едноверижни шаблона, за да гарантират, че ДНК полимеразата се свързва правилно с хибридите праймер-шаблон и впоследствие генерира целия целеви регион по време на синтеза на ДНК.

Както всички ензими, ДНК полимеразите също са склонни към грешки, което от своя страна причинява мутации в генерираните PCR фрагменти. [41]

Друго ограничение на PCR е, че дори най-малкото количество замърсяваща ДНК може да бъде амплифицирано, което води до подвеждащи или двусмислени резултати. За да се сведе до минимум вероятността от замърсяване, изследователите трябва да резервират отделни помещения за подготовка на реагенти, PCR и анализ на продукта. Реагентите трябва да се разпределят в аликвоти за еднократна употреба. Пипети с бутала за еднократна употреба и изключително дълги накрайници на пипетите трябва да се използват рутинно. [15]

Проби от околната среда, които съдържат хуминови киселини, могат да инхибират PCR амплификацията и да доведат до неточни резултати.

  • Алел-специфичен PCR: диагностична или клонираща техника, базирана на еднонуклеотидни вариации (SNV да не се бъркат с SNPs) (разлики с една база при пациент). Той изисква предварително познаване на ДНК последователност, включително разлики между алелите, и използва праймери, чиито 3' краища обхващат SNV (буфер за базова двойка около SNV обикновено се включва). PCR амплификацията при строги условия е много по-малко ефективна при наличие на несъответствие между шаблон и праймер, така че успешната амплификация със специфичен за SNP праймер сигнализира наличието на специфичния SNP в последователност. [42] Вижте SNP генотипиране за повече информация.
  • Сглобяване PCR или Полимеразен цикличен монтаж (PCA): изкуствен синтез на дълги ДНК последователности чрез извършване на PCR върху пул от дълги олигонуклеотиди с къси припокриващи се сегменти. Олигонуклеотидите се редуват между сенс и антисенс посоки и припокриващите се сегменти определят реда на PCR фрагментите, като по този начин селективно произвеждат крайния дълъг ДНК продукт. [43]
  • Асиметричен PCR: за предпочитане амплифицира една ДНК верига в двуверижен ДНК шаблон. Използва се при секвениране и хибридизиране при сондиране, където е необходимо усилване само на една от двете комплементарни нишки. PCR се провежда както обикновено, но с голям излишък от праймера за веригата, насочена за амплификация. Поради бавното (аритметично) амплифициране по -късно в реакцията след изчерпване на ограничаващия праймер, са необходими допълнителни цикли на PCR. [44] Скорошна модификация на този процес, известна като Lв ухо-Аслед-Tтой-Еxponential-PCR (LATE-PCR), използва ограничаващ праймер с по-висока температура на топене (Tм) отколкото излишния праймер, за да се поддържа ефективността на реакцията, тъй като ограничаващата концентрация на праймера намалява по средата на реакцията. [45]
  • Конвективна PCR: псевдоизотермичен начин за провеждане на PCR. Вместо многократно нагряване и охлаждане на PCR сместа, разтворът се подлага на термичен градиент. Полученият конвективен поток, задвижван от термична нестабилност, автоматично разбърква PCR реагентите от горещите и студените региони, като многократно позволява PCR. [46] Параметри като топлинни гранични условия и геометрия на PCR корпуса могат да бъдат оптимизирани, за да се получи здрав и бърз PCR чрез използване на появата на хаотични полета на потока. [47] Такава PCR настройка на конвективен поток значително намалява изискването за мощност на устройството и времето за работа.
  • PCR за набиране: силно паралелен метод за извличане на точни ДНК молекули за синтез на гени. Сложна библиотека от ДНК молекули се модифицира с уникални фланкиращи етикети преди масово паралелно секвениране. След това насочените с маркери праймери позволяват извличане на молекули с желани последователности чрез PCR. [48]
  • цифров PCR (dPCR): използва се за измерване на количеството на целевата ДНК последователност в ДНК проба. ДНК пробата е силно разредена, така че след паралелно провеждане на много PCRs, някои от тях не получават нито една молекула от целевата ДНК. Целевата концентрация на ДНК се изчислява като се използва пропорцията на отрицателните резултати. Оттук и името „цифров PCR“.
  • Хеликазно-зависимо усилване: подобно на традиционния PCR, но използва постоянна температура, а не циклично преминаване през цикли на денатурация и отгряване/удължаване. ДНК хеликаза, ензим, който размотава ДНК, се използва вместо термична денатурация. [49]
  • PCR с горещ старт: техника, която намалява неспецифичната амплификация по време на началните етапи на настройка на PCR. Това може да се извърши ръчно чрез нагряване на реакционните компоненти до температурата на денатурация (например 95 ° C) преди добавяне на полимераза. [50] Разработени са специализирани ензимни системи, които инхибират активността на полимеразата при температура на околната среда, или чрез свързване на антитяло[12][51], или чрез присъствието на ковалентно свързани инхибитори, които се дисоциират само след етап на активиране при висока температура. PCR с горещ старт/студено завършване се постига с нови хибридни полимерази, които са неактивни при стайна температура и се активират незабавно при температура на удължаване.
  • In silico PCR (цифрова PCR, виртуална PCR, електронна PCR, e-PCR) се отнася до изчислителни инструменти, използвани за изчисляване на теоретични резултати от полимеразна верижна реакция, като се използва даден набор от праймери (сонди) за амплифициране на ДНК последователности от секвениран геном или транскриптом. In silico PCR беше предложен като образователен инструмент за молекулярна биология. [52]
  • Интерсеквенционно-специфичен PCR (ISSR): PCR метод за ДНК отпечатъци, който усилва области между прости повторения на последователността, за да се получи уникален пръстов отпечатък с дължини на амплифицирани фрагменти. [53]
  • Обратна PCR: обикновено се използва за идентифициране на фланкиращите последователности около геномни вмъквания. Той включва поредица от разграждане на ДНК и самолигиране, което води до известни последователности в двата края на неизвестната последователност. [54]
  • PCR, медииран от лигиране: използва малки ДНК линкери, лигирани към ДНК, представляваща интерес, и множество праймери, отгряващи към ДНК линкерите, използван е за секвениране на ДНК, ходене на генома и ДНК отпечатък. [55]
  • Специфичен за метилиране PCR (MSP): разработено от Стивън Бейлин и Джеймс Г. Херман в Медицинското училище на Джон Хопкинс, [56] и се използва за откриване на метилиране на CpG острови в геномната ДНК. ДНК първо се третира с натриев бисулфит, който превръща неметилираните цитозинови бази в урацил, който се разпознава от PCR праймерите като тимин. След това се провеждат две PCR върху модифицираната ДНК, като се използват идентични праймерни набори с изключение на всички CpG острови в праймерните последователности. В тези точки един набор от праймери разпознава ДНК с цитозини за амплифициране на метилирана ДНК, а един набор разпознава ДНК с урацил или тимин, за да амплифицира неметилирана ДНК. MSP с помощта на qPCR може също да се извърши за получаване на количествена, а не на качествена информация за метилирането.
  • Miniprimer PCR: използва термостабилна полимераза (S-Tbr), която може да се простира от къси праймери („smalligos“) до 9 или 10 нуклеотида. Този метод позволява PCR насочване към по-малки праймерни свързващи региони и се използва за амплифициране на запазени ДНК последователности, като 16S (или еукариотен 18S) rRNA ген. [57]
  • Усилване на сондата, зависима от мултиплексно лигиране (MLPA): позволява усилване на множество цели с една праймерна двойка, като по този начин се избягват ограниченията на разделителната способност на мултиплексната PCR (виж по -долу).
  • Мултиплекс-PCR: се състои от множество набори праймери в една PCR смес за производство на ампликони с различни размери, които са специфични за различни ДНК последователности. Чрез насочване към множество гени наведнъж, допълнителна информация може да бъде получена от един тест, който иначе би изисквал няколко пъти повече реагенти и повече време за изпълнение. Температурите на отгряване за всеки от комплектите праймери трябва да бъдат оптимизирани, за да работят правилно в рамките на една реакция, и размерите на ампликона. Тоест дължината на тяхната базова двойка трябва да е достатъчно различна, за да образува отделни ленти, когато се визуализира чрез гел електрофореза.
  • PCR, подпомаган от наночастици (nanoPCR): някои наночастици (NPs) могат да подобрят ефективността на PCR (по този начин се наричат ​​nanoPCR), а някои дори могат да превъзхождат оригиналните PCR подобрители. Съобщава се, че квантовите точки (QD) могат да подобрят PCR специфичността и ефективността. Едностенните въглеродни нанотръби (SWCNT) и многостенните въглеродни нанотръби (MWCNT) са ефективни за подобряване на амплификацията на дълга PCR. Въглеродният нанопрах (CNP) може да подобри ефективността на повторната PCR и дългата PCR, докато цинковият оксид, титаниевият диоксид и Ag NPs е установено, че увеличават добива на PCR. Предишни данни показват, че неметалните NPs запазват приемлива точност на усилване. Като се има предвид, че много NPs са способни да подобрят ефективността на PCR, е ясно, че вероятно има голям потенциал за подобрения на nanoPCR технологията и разработване на продукти. [58][59]
  • Вложен PCR: повишава специфичността на амплификацията на ДНК, като намалява фона поради неспецифично амплифициране на ДНК. Два комплекта праймери се използват в два последователни PCR. В първата реакция, една двойка праймери се използва за генериране на ДНК продукти, които освен предвидената мишена, все още могат да се състоят от неспецифично амплифицирани ДНК фрагменти. След това продуктът(ите) се използва(т) във втора PCR с набор от праймери, чиито места на свързване са напълно или частично различни от и разположени на 3' от всеки от праймерите, използвани в първата реакция. Вложената PCR често е по-успешна в специфичното амплифициране на дълги ДНК фрагменти от конвенционалната PCR, но изисква по-подробно познаване на целевите последователности.
  • PCR с припокриване и разширение или Снаждане чрез разширение на припокриване (SOEing) : техника на генно инженерство, която се използва за снаждане на два или повече ДНК фрагмента, които съдържат комплементарни последователности. Използва се за свързване на ДНК парчета, съдържащи гени, регулаторни последователности или мутации, като техниката позволява създаването на специфични и дълги ДНК конструкции. Той може също да въведе делеции, инсерции или точкови мутации в ДНК последователност. [60][61]
  • PAN-AC: използва изотермични условия за усилване и може да се използва в живи клетки. [62] [63]
  • количествен PCR (qPCR): използва се за измерване на количеството на целевата последователност (обикновено в реално време). Той количествено измерва началните количества ДНК, кДНК или РНК. количественият PCR обикновено се използва за определяне дали ДНК последователност присъства в пробата и броя на нейните копия в пробата. Количествена PCR има много висока степен на прецизност. Количествените PCR методи използват флуоресцентни багрила, като Sybr Green, EvaGreen или съдържащи флуорофор ДНК сонди, като TaqMan, за измерване на количеството амплифициран продукт в реално време. Също така понякога се съкращава до RT-PCR (реално време PCR), но това съкращение трябва да се използва само за PCR с обратна транскрипция. qPCR е подходящите контракции за количествена PCR (PCR в реално време).
  • PCR с обратен комплемент (RC-PCR): Позволява добавянето на функционални домейни или последователности по избор да се прикрепят независимо към двата края на генерирания ампликон в реакция с една затворена епруветка. Този метод генерира целеви специфични праймери в рамките на реакцията чрез взаимодействието на универсални праймери (които съдържат желаните последователности или домейни, които трябва да бъдат добавени) и RC сонди.
  • PCR с обратна транскрипция (RT-PCR): за амплифициране на ДНК от РНК. Обратната транскриптаза преписва РНК в сДНК, която след това се амплифицира чрез PCR. RT-PCR се използва широко при профилиране на експресията, за определяне на експресията на ген или за идентифициране на последователността на РНК транскрипт, включително началните и крайните места на транскрипцията. Ако е известна геномната ДНК последователност на гена, RT-PCR може да се използва за картографиране на местоположението на екзоните и интроните в гена. 5' края на гена (съответстващ на началното място на транскрипцията) обикновено се идентифицира чрез RACE-PCR (Бързо амплифициране на сДНК краища).
  • РНКаза Н-зависим PCR (rhPCR): модификация на PCR, която използва праймери с 3' удължаващ блок, който може да бъде отстранен от термостабилен RNase HII ензим. Тази система намалява праймер-димерите и позволява мултиплексирани реакции да се извършват с по-голям брой праймери. [64]
  • Единичен специфичен праймер-PCR (SSP-PCR): позволява амплификацията на двойноверижна ДНК дори когато информацията за последователността е налична само в единия край. Този метод позволява амплификация на гени, за които е налична само частична информация за последователността, и позволява еднопосочен геном, преминаващ от известни в неизвестни области на хромозомата. [65]
  • PCR в твърда фаза: обхваща множество значения, включително Polony Amplification (където PCR колониите са получени в гел матрица, например), Bridge PCR [66] (праймерите са ковалентно свързани с твърда поддържаща повърхност), конвенционална Solid Phase PCR (където е асиметрична PCR прилага се в присъствието на грунд с твърда подложка с последователност, съответстваща на един от водните праймери) и подобрена PCR в твърда фаза [67] (където конвенционалната твърдофазна PCR може да бъде подобрена чрез използване на високо Tm и вложен твърд грунд с подложка с опционално прилагане на термичен „стъпка“ в полза на грундирането на твърда опора).
  • PCR за самоубийство: обикновено се използва в палеогенетика или други изследвания, където избягването на фалшиви положителни резултати и гарантирането на специфичността на амплифицирания фрагмент е най-висок приоритет. Първоначално е описано в проучване за проверка на наличието на микроба Yersinia pestis в зъбни проби, получени от гробове от 14-ти век на хора, за които се предполага, че са убити от чума по време на средновековната епидемия на Черната смърт. [68] Методът предписва използването на всяка комбинация от праймери само веднъж в PCR (оттук и терминът "самоубийство"), която никога не е трябвало да се използва в нито една положителна контролна PCR реакция, а праймерите винаги трябва да са насочени към геномен регион, никога не амплифициран преди в лабораторията, използвайки този или друг набор от праймери. Това гарантира, че в лабораторията няма замърсяваща ДНК от предишни PCR реакции, които иначе биха могли да генерират фалшиви положителни резултати.
  • Термично асиметричен преплетен PCR (TAIL-PCR): за изолиране на неизвестна последователност, обграждаща известна последователност. В рамките на известната последователност, TAIL-PCR използва вложена двойка праймери с различни температури на отгряване, дегенериран праймер се използва за амплификация в друга посока от неизвестната последователност. [69]
  • Тъчдаун PCR (Понижаващ PCR): вариант на PCR, който има за цел да намали неспецифичния фон чрез постепенно понижаване на температурата на отгряване с напредването на PCR цикъла. Температурата на отгряване при началните цикли обикновено е няколко градуса (3–5 °C) над Tм от използваните грундове, докато при по-късните цикли е с няколко градуса (3–5 °C) под праймера Tм. По-високите температури дават по-голяма специфичност за свързване на праймера, а по-ниските температури позволяват по-ефективно усилване от специфичните продукти, образувани по време на първоначалните цикли. [70]
  • Универсално бързо ходене: за ходене на генома и генетично снемане на пръстови отпечатъци с помощта на по-специфичен „двустранен“ PCR от конвенционалните „едностранни“ подходи (използвайки само един генно-специфичен праймер и един общ праймер — което може да доведе до артефактен „шум“) [71] по силата на механизъм, включващ образуване на лариатна структура. Опростените производни на UFW са LaNe RAGE (лариат-зависима вложена PCR за бързо амплифициране на краищата на геномната ДНК), [72] 5'RACE LaNe [73] и 3'RACE LaNe. [74]

Топлоустойчивите ензими, които са ключов компонент в полимеразната верижна реакция, са открити през 60-те години на миналия век като продукт на микробна форма на живот, която е живяла в прегрятите води на гъбния извор на Йелоустоун. [75]

Документ от 1971 г. в Списание по молекулярна биология от Kjell Kleppe и колеги в лабораторията на H. Gobind Khorana за първи път описват метод за използване на ензимен анализ за репликиране на кратък ДНК шаблон с праймери инвитро. [76] Въпреки това, тази ранна проява на основния PCR принцип не е получила много внимание по това време и изобретяването на полимеразната верижна реакция през 1983 г. обикновено се приписва на Кари Мълис. [77]

Когато Мълис разработва PCR през 1983 г., той работи в Емеривил, Калифорния за Cetus Corporation, една от първите биотехнологични компании, където отговаря за синтезирането на къси вериги от ДНК. Мълис е написал, че е замислил идеята за PCR, докато пътувал покрай тихоокеанското крайбрежие една нощ в колата си. [78] Той си играеше наум с нов начин за анализиране на промените (мутации) в ДНК, когато осъзна, че вместо това е изобретил метод за усилване на всяка ДНК област чрез повтарящи се цикли на дублиране, задвижвани от ДНК полимераза. В Scientific American, Мълис обобщава процедурата: "Започвайки с една молекула от ДНК на генетичния материал, PCR може да генерира 100 милиарда подобни молекули за един следобед. Реакцията е лесна за изпълнение. Не изисква повече от епруветка, няколко прости реагента и източник на топлина." [79] ДНК пръстовите отпечатъци се използват за първи път за тестване на бащинство през 1988 г. [80]

Мълис и професор Майкъл Смит, които са разработили други основни начини за манипулиране на ДНК, [81] са удостоени съвместно с Нобеловата награда по химия през 1993 г., седем години след като Мълис и колегите му от Cetus за първи път прилагат неговото предложение на практика. [82] Документът на Мълис от 1985 г. с RK Saiki и HA Erlich, „Ензимно амплифициране на геномни последователности на β-глобин и анализ на рестрикционните места за диагностика на сърповидноклетъчна анемия“ – изобретението за полимеразна верижна реакция (PCR) – беше удостоено с цитиране за Chemical Награда за пробив от Отдела по история на химията на Американското химическо дружество през 2017 г. [83] [1]

В основата на PCR метода е използването на подходяща ДНК полимераза, способна да издържи на високите температури от> 90 ° C (194 ° F), необходими за разделяне на двете нишки на ДНК в двойната спирала на ДНК след всеки цикъл на репликация. ДНК полимеразите, използвани първоначално за in vitro експерименти, предхождащи PCR, не са в състояние да издържат на тези високи температури. [1] Така че ранните процедури за репликация на ДНК бяха много неефективни и отнемащи време и изискваха големи количества ДНК полимераза и непрекъснато боравене през целия процес.

Откритието през 1976 г Taq полимераза - ДНК полимераза, пречистена от термофилната бактерия, Thermus aquaticus, който естествено живее в горещи (50 до 80 °C (122 до 176 °F)) среди [13] като горещи извори — проправи пътя за драматични подобрения на PCR метода. ДНК полимеразата, изолирана от T. aquaticus е стабилен при високи температури, оставайки активен дори след денатурация на ДНК, [14] като по този начин премахва необходимостта от добавяне на нова ДНК полимераза след всеки цикъл. [2] Това позволи автоматизиран процес, базиран на термоциклери, за амплификация на ДНК.

Патентни спорове Редактиране

PCR техниката е патентована от Кари Мълис и възложена на Cetus Corporation, където Мълис е работил, когато е изобретил техниката през 1983 г. Taq ензимът полимераза също е покрит с патенти. Има няколко известни съдебни дела, свързани с техниката, включително неуспешно дело, заведено от DuPont. Швейцарската фармацевтична компания Hoffmann-La Roche закупи правата върху патентите през 1992 г. и в момента [ кога? ] съдържа тези, които все още са защитени.

Свързана патентна битка за Taq полимеразният ензим все още продължава в няколко юрисдикции по света между Roche и Promega. Правните аргументи надхвърлят живота на оригиналния PCR и Taq патенти за полимераза, които са изтекли на 28 март 2005 г. [84]


Стъпка 5: qPCR оптимизация

Проектиране и тестване на грунд

По време на генната експресия, ДНК първо се транскрибира в иРНК. При еукариотите некодиращите региони на последователността на иРНК, известни като интрони, се отстраняват и протеин-кодиращите региони, известни като екзони, се свързват, за да произведат зрялата иРНК, която се транслира в протеин. Този процес се нарича сплайсинг на РНК. Човешкият геном съдържа

20 000 гена, кодиращи протеини, които могат да бъдат обработени в повече от 80 000 протеин-кодиращи иРНК, а изчисленият брой на синтезираните протеини е в диапазона от 250 000 до 1 милион [23]. Това предполага, че регулирането на генната експресия е сложен процес. Един от регулаторните процеси е алтернативно сплайсинг, при който конкретни екзони на един и същи ген се свързват, за да произвеждат множество иРНК, наречени варианти на снаждане, които след това се транслират в различни протеинови изоформи. Препоръчваме да включите всички варианти на снаждане на целевия ген, освен ако потребителят се интересува само от един конкретен вариант на снаждане на целевия ген. Също така е за предпочитане да се проектират праймери, които се свързват специфично с кДНК, но не и с геномна ДНК, тъй като амплификацията от геномна ДНК може да попречи на анализа на генната експресия. Това може да се постигне чрез проектиране на праймерна последователност, която пресича екзон-екзонна връзка, или чрез включване на голям интрон между предния и обратния праймер. Това е съществено изискване, ако по време на екстракцията на РНК не се извърши етап на елиминиране на геномна ДНК. При определени обстоятелства, като например когато целевата генна последователност не съдържа интрон или праймерът не може да бъде локализиран на кръстовището екзон-екзон поради ДНК последователността, геномната ДНК трябва да бъде отстранена от РНК пробата, преди да бъде превърната в сДНК. Например, генът, кодиращ човешки протеин от топлинен шок, член 6 от семейството (HSPA6) не съдържа никакви интрони и по този начин геномната ДНК трябва да бъде отстранена от РНК пробата, за да се предотврати на праймерите да амплифицират както геномната ДНК, така и сДНК едновременно по време на qPCR реакцията . Предимството на използването на налични в търговската мрежа, базирани на спин колона комплекти за извличане на РНК е, че те обикновено включват етап на елиминиране на геномна ДНК.

За да се тества дали праймерите са специфични за сДНК, един подход е да се извършат qPCR реакции, използвайки сДНК, ˗RT контрола или вода като матрица. След това крайните PCR ампликони могат да бъдат разделени с помощта на електрофореза с 2% агарозен гел. Единична остра ДНК лента с очакван размер трябва да присъства само в реакцията с кДНК, ако праймерите се свързват само с кДНК (Фигура 4).

Продуктите от ДНК фрагменти, получени от PCR реакция със същите праймери, но използващи или вода (лента 2), -RT (реакция на синтез на кДНК, съдържаща РНК, но без кДНК, лента 3), или сДНК (лента 4) като матрица, бяха разделени на 2% агарозен гел. Лента 1 е 100 bp ДНК стълба. Единична остра ДНК лента с очаквания размер, която е крайните PCR ампликони, присъства само в реакцията с кДНК.

Специфичността на праймера може също да бъде проверена чрез анализ на кривата на топене. Анализът на кривата на топене е оценка на характеристиките на дисоциация на двуверижна ДНК (продукт от реакцията на qPCR) по време на нагряване и може да се използва в реакции на qPCR с интеркалиращи багрила, като SYBR Green. SYBR Green флуоресцира само когато е свързан с двуверижна ДНК, но не и в присъствието на едноверижна ДНК. В края на qPCR цикъл, термоциклерът е програмиран да повишава температурата постепенно от 60 ଌ до 95 ଌ (0,05 ଌ ·s -1) и да измерва количеството флуоресценция. Двуверижният PCR ампликон започва да денатурира до едноверижна ДНК, което води до намалена флуоресценция. Температурата, при която се прекъсва водородната връзка между две ДНК вериги, зависи от тяхната дължина, съдържание на гуанин-цитозин и тяхната комплементарност, така че ще се получи уникална крива на топене на променящата се скорост на флуоресценция (-Rn) спрямо температурата за всеки специфичен двуверижен ДНК фрагмент (фиг. 5). Ако повече от един ДНК фрагмент се произвежда по време на qPCR реакцията, като се използва съответно сДНК и геномна ДНК като матрица, ще бъде открита повече от една крива на топене. Силно препоръчваме да включите анализ на кривата на топене със SYBR Green-базиран qPCR анализ и да гарантирате, че се произвежда един специфичен продукт във всички реакции, усилващи един и същ целеви ген. Това може лесно да се направи чрез добавяне на програма за температура на кривата на топене в края на qPCR цикъл, което е функция, налична в повечето qPCR инструменти.

qPCR реакцията, използваща сДНК, синтезирана от интактна (розова) и разградена РНК (червена) проба, показва същата крива на топене, което показва, че се произвежда същият PCR ампликон. Въпреки това, различна крива на топене се наблюдава, когато се използва сДНК, синтезирана от обработена с РНКаза РНК проба (синя), която показва различен PCR ампликон, произведен по време на qPCR реакцията. Нашите препоръки за qPCR оптимизация са изброени в каре 6.

Клетка 6

Препоръчва се да се проектират qPCR праймери, които са специфични за целевия ген и само амплифицират кДНК (напр. да се насочат към всички предвидени изоформи и да обхващат връзка между екзоните), а специфичността на праймера трябва да бъде тествана като част от процеса на валидиране на qPCR [ 1]. Препоръчваме да включите анализ на кривата на топене за тестване на специфичността на праймера, тъй като не изисква допълнителна стъпка. Съгласно насоките на MIQE от авторите се изисква да предоставят достатъчно информация за qPCR целта и праймерите, като генен символ, номер за достъп на последователността и дължина на ампликона [1] (вижте пример в Експеримент 4).

Оптимизиране на производителността на qPCR

При qPCR реакция цикълът на количествено определяне (Cq) стойността се дефинира като броя на циклите, необходими за флуоресцентния сигнал да надхвърли флуоресценцията на фона (наричан още прагов цикъл (CT), пресичане (Cстр), или точка на излитане (TOP) в предишни публикации). Софтуерните програми qPCR могат да задават прага автоматично след определяне на базовата флуоресценция от цикъл 3 до 15 през цялата реакционна плоча, която е известна като базова стойност. По подразбиране софтуерната програма за PCR в реално време QuantStudio (Applied Biosystems, Foster City, CA), която използваме в нашата лаборатория, задава този праг на десет стандартни отклонения над средната базова флуоресценция. Въпреки това, както базовата линия, така и прагът могат да се регулират ръчно.

За да се получи висока ефективност на амплификация (увеличаване на броя на PCR ампликони на цикъл), както праймерът, така и концентрацията на cDNA трябва да бъдат оптимизирани за различни целеви гени. Препоръчителната ефективност на усилване е между 93% и 105% (наклонът на Cq спрямо Log на входа на кДНК в стандартна крива е между -3.2 и -3.5 и стойността на R2 е над 0.98, вижте примерите на фигура 6) [15].

Стандартна крива се генерира, като се използва 10-кратно разреждане на сДНК като матрица за qPCR реакции. Полученият Cq стойностите са нанесени спрямо лога на входа на cDNA. Ефективността, както и стойността на R 2, са в допустимите граници. Ефективността на Циклофилин и PGC-1 α са приблизително равни, като абсолютната стойност на наклона на 㥌q срещу Log на входа на cDNA е < 0.1.

Изборът на концентрация на сДНК за крайната qPCR реакция ще зависи от избрания qPCR комплект, използваните праймери, както и нивото на експресия на целевия ген. В нашата лаборатория първо разреждаме cDNA десет пъти с вода, преди да използваме във всяка qPCR реакции. При тестване на нов набор от праймери, стандартна крива трябва да се генерира, като се използва серия от разредени сДНК проби като шаблон (Фигура 6, използвайки Циклофилин и PGC-1 α като пример,). Контролната реакция на “no template” трябва да се настрои, като се използва само вода (контрол без шаблон, TFC). Ефективността на qPCR амплификация след това може да бъде изчислена от наклона на графиката на Cq стойности, нанесени спрямо Log на входа на cDNA (Ефективност = (10 𢄡/slope – 1) × 100). Нови комплекти праймери трябва да бъдат проектирани и тествани, ако ефективността на усилване не е в препоръчания диапазон.

За всички експерименти, описани в тази статия, използвахме първоначална концентрация на праймера от 300 nM. Препоръчва се да се изберат концентрации на праймер и сДНК в рамките на линейния динамичен диапазон за qPCR, което води до Cq между 20 и 30 [15]. Въпреки това, при реакции с висок Cq стойност (㸰, в зависимост от нивото на експресия на целевия ген и qPCR протокола), е необходимо да се проведат qPCR реакции с различни концентрации на праймери и да се използва концентрацията, която дава най-ниската Cq стойност (показваща, че реакцията е проведена при най-ефективните условия). Различните qPCR реакционни комплекти могат да препоръчат различна концентрация на праймер. Нашите препоръки за оптимизиране на ефективността на qPCR са изброени в каре 7.

Клетка 7

Препоръчва се да се запази настройката по подразбиране на машината като праг, но винаги да се проверява дали е зададена в областта на експоненциално усилване във всички графики на усилване и дали всички графики са успоредни и над фоновия шум на базовата линия [ 15]. Всяка qPCR реакция трябва да бъде оптимизирана, за да се постигне предпочитан Cq стойност (20 до 30) и ефективност на усилване (93%�%). За някои целеви гени е трудно да се получат праймери с желаната ефективност на амплификация дори след тестване на множество набори праймери. Препоръчваме да използвате праймери с ефективност на усилване, най-близка до желания диапазон между 93% и 105% (вижте праймери за ACTB и GAPDH като примери в експеримент 4).


SCRIPT RT-qPCR ProbesMaster

Описание:
SCRIPT RT-qPCR ProbesMaster е предназначен за количествени анализи в реално време на РНК шаблони, използващи двойно маркирани флуоресцентни сонди. Готовата за употреба смес се основава на генетично конструирана обратна транскриптаза с подобрена термична стабилност, осигуряваща повишена специфичност, висок добив на сДНК и подобрена ефективност за високо структурирани и дълги сДНК фрагменти.
2x конц. миксът съдържа всички реагенти, необходими за RT-qPCR (с изключение на шаблон, праймери и флуоресцентната сонда с двойно етикетиране), за да се осигури бърза и лесна подготовка с минимум стъпки на пипетиране. Ензимите с първокласно качество и оптимизираният реакционен буфер, съдържащ ултрачисти dNTPs, осигуряват превъзходни резултати от PCR в реално време.
RT-qPCR се използва за амплифициране на двуверижна ДНК от едноверижни РНК шаблони, за да позволи бързо количествено определяне в реално време на РНК мишени. В стъпката на обратната транскрипция обратната транскриптаза синтезира едноверижни ДНК молекули (cDNA), комплементарни на РНК шаблона. В първия цикъл на PCR стъпката ДНК полимераза с горещ старт синтезира ДНК молекули, комплементарни на сДНК, като по този начин генерира двуверижна ДНК матрица. Полимеразната активност при горещ старт се блокира при температура на околната среда и се включва автоматично в началото на първоначалната денатурация. Термичното активиране предотвратява разширяването на неспецифично отгрявани праймери и праймер-димерни образувания при ниски температури по време на настройката на PCR.
Едноетапната RT-qPCR предлага изключително удобство, когато се прилага за анализ на мишени от множество проби от РНК и свежда до минимум риска от замърсяване.
Сместа може да се използва и в комбинация с ROX референтна боя (#PCR-351) в PCR инструменти, които са съвместими с оценката на ROX сигнала.

съдържание:
SCRIPT RT-qPCR ProbesMaster
Готова за употреба смес от SCRIPT обратна транскриптаза, Hot Start Polymerase, RNase инхибитор, dNTPs, реакционен буфер и стабилизатори.

Флуоресцентни сонди с двойно етикетиране:
PCR технологията в реално време, базирана на двойно маркирани ДНК сонди, осигурява изключително чувствителна и специфична PCR система с възможност за мултиплексиране. Това изисква два стандартни PCR праймера и ДНК сондата, която се хибридизира с вътрешна част на ампликона. Последователността на двойно маркираната ДНК сонда трябва да избягва вторичната структура и образуването на праймер-димер.

Продължете с обратна транскрипция и термично циклиране, както се препоръчва.

Обратна транскрипция и термично циклиране:
Поставете флаконите в PCR цикъл и стартирайте следната програма.

обратен
транскрипция 5)
50-55 °C10-15 мин1x
начален
денатурация 6)
95°С5 минути1x
денатурация95°С15 сек35-45x
отгряване и
удължаване
60-65 °C 7) 1 мин 8) 35-45x

За оптимална специфичност и амплификация може да е необходима индивидуална оптимизация на препоръчаните параметри. Имайте предвид, че оптималните времена на реакция и температури трябва да бъдат коригирани за всяка конкретна двойка РНК/праймер.


ОБРАЗОВАНИЕ И ОБОСНОВКА НА МЕТОДА

Комплектът за екстракция е избран въз основа на неговата ефективност за изолиране на геномна и плазмидна растителна ДНК, които впоследствие трябва да бъдат амплифицирани чрез PCR. Екстракцията на ДНК се състои в разрушаване на клетъчната стена, елиминиране на РНК и отстраняване на протеини чрез утаяване. След това ДНК се фиксира върху афинитетна колона, промива се и се елуира. Подобни подходи вече са прилагани за откриване на ДНК от други растения [6] или от вируси [7].

Имайте предвид, че в този експеримент PCR се използва, за да се определи дали соевото брашно съдържа генетично модифициран растителен материал, но техниката може да се използва и в различни контексти като палеонтология и съдебна медицина [8-12]. PCR протича в три фази: 1) топлинна денатурация на двойноверижната ДНК, 2) отгряване на праймерите върху последователностите чрез охлаждане и 3) удължаване на ДНК чрез удължаване на праймерите в противоположни посоки. Тези три стъпки се наричат ​​цикъл и PCR включва повторение на този цикъл. Количеството ДНК се увеличава експоненциално. Следователно добивът на ДНК се увеличава като функция на 2 n , където н е броят на циклите. Това означава, че след един цикъл количеството на ДНК се удвоява, а след 30 цикъла теоретично ДНК е амплифицирана в продължение на 109 пъти и може лесно да бъде открита върху гел за електрофореза.

За този експеримент PCR праймерите са проектирани да откриват два вида гени. Първият набор от праймери амплифицира ендогенни растителни гени, хлоропластен ген и специфичния ген на соев лектин. По този начин ние проверяваме наличието на растителна ДНК и по-специално ДНК на соя. Вторият набор от праймери амплифицира последователности, които обикновено не се срещат в растенията, но се въвеждат чрез генетична трансформация. В този случай двете амплифицирани чужди ДНК са конститутивно активният 35 S промотор от вируса на мозайка от карфиол и терминаторът на гена на нопалин синтаза (NOS) от Agrobacterium tumefaciens. Ако някоя от тези две последователности е амплифицирана, това показва, че целевата ДНК е трансгенна [1]. По принцип всички одобрени генетично модифицирани земеделски култури са трансформирани с конструкции, съдържащи един или и двата от тези елемента. Идентифицирането на нови промоторни и терминаторни последователности в трансгенни конструкции се превръща в проблем за учените.

PCR праймерите са проектирани да създават амплифицирани продукти с различни размери, за да се улесни тяхното идентифициране. Таблица I показва последователностите на синтезираните праймери. Местата на отгряване са избрани да генерират само един ДНК фрагмент, за да се опрости интерпретацията. Тези фрагменти се визуализират като ленти върху агарозни гелове след PCR (вижте таблицата за размерите на амплифицираните последователности).


Полимеразна верижна реакция

Дейвид П. Кларк,. Мишел Р. Макгихи, в Молекулярна биология (трето издание), 2019 г.

5 Обратна PCR

Друг подход, който използва непълна информация за последователността за усилване на целевия ген е обратна PCR . В този случай е известна последователност от част от дълга молекула на ДНК, да речем хромозома. Целта е да се разшири анализът по протежение на молекулата на ДНК в неизвестните региони. За да се синтезират праймерите за PCR, неизвестната целева последователност трябва да бъде фланкирана от два региона на известна последователност. Настоящата ситуация е точно обратната на тази. За да се заобиколи този проблем, целевата молекула на ДНК първо се превръща в кръг.

Извършването на PCR върху циркуляризиран ДНК шаблон амплифицира съседни региони с неизвестна последователност.

Рестрикционен ензим, обикновено този, който разпознава шест-базова последователност, се използва за направата на кръга. Този ензим не трябва да се врязва в известната последователност, но ще се реже нагоре и надолу по веригата от известната област. Полученият фрагмент първо ще има неизвестна последователност, известната последователност в средата, последвана от по -неизвестна последователност. Двата края на фрагмента ще имат съвместими лепкави краища, които лесно се свързват заедно, за да образуват кръг от ДНК (фиг. 6.12). За PCR се използват два праймера, съответстващи на известния регион и обърнати навън около кръга. Синтезът на нова ДНК ще продължи около кръга по часовниковата стрелка от единия праймер и обратно на часовниковата стрелка от другия. Като цяло, обратната PCR дава множество копия на сегмент от ДНК, съдържащ малко ДНК вдясно и малко ДНК вляво от оригиналния известен регион.

Обратната PCR позволява неизвестни последователности да бъдат амплифицирани чрез PCR, при условие че са разположени до ДНК, в която последователността вече е известна. ДНК се нарязва с рестрикционен ензим, който не се нарязва в областта на известната последователност, както е показано в Стъпка 1. Това генерира фрагмент от ДНК, съдържащ известната последователност, ограден от две области с неизвестна последователност. Тъй като фрагментът има два съвпадащи лепкави края, той може лесно да се циркулира от ДНК лигаза. Накрая, PCR се извършва върху кръговите фрагменти на ДНК (Стъпка 2). Използват се два праймера, които са обърнати навън от известната ДНК последователност. PCR амплификацията дава множество копия на един линеен продукт, който включва неизвестна ДНК от лявата и дясната страна.