Информация

Висока концентрация на праймер в PCR

Висока концентрация на праймер в PCR


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Защо по-висока концентрация на праймери от ДНК шаблона в PCR ще благоприятства отгряването на шаблон към праймер?


По-просто казано, по-високата концентрация на праймери означава повече праймери в сместа, следователно повече шансове той да се отгрява към вашия ДНК шаблон, но повече не винаги е добре. Оптималната концентрация на праймери в PCR реакция е между 0,1 и 0,5 µM. За повечето приложения 0,2 µM са достатъчни. Използването на много висока концентрация на праймери може да бъде обезпокоително, тъй като може да накара вашите праймери да се свържат с частично допълващи се места, което води до неспецифични PCR продукти.

https://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/cloning/pcr_strategy/optimising_pcr/


Използването на висока концентрация на праймери гарантира, че след денатурация шаблонната ДНК се свързва с праймерите, вместо да се свързва един с друг. Също така по-високата концентрация на праймера повишава добива на продукта, тъй като праймерите действат като ограничаващ фактор за отгряване.

(Справка: https://academic.oup.com/nar/article/24/5/985/1047654)


Изчисляване на концентрациите за PCR

i) Олигонуклеотидните праймери обикновено се доставят като "толкова много OD единици/ml" - но какво прави това означава, по отношение на mg/ml, или mmol/ml и т.н.?

Дадено: праймерът е с дължина Y нуклеотиди (nt).

Дадено: MW на ssDNA е (330 дальтона на nt) x (дължина в nt) (Sambrook et al., 1989 p. C.1)

Дадено: концентрацията на праймера (=ssDNA), произвеждаща OD от 1 при 254 nm в 1 cm кювета, е 37 ug/ml

Тогава: MW на грунда е 330.Y далтона

И: X OD/ml = 37.X ug/ml = 37.X mg/l = 37.X /330.Y mM = 37.X.1000/330.Y uM

Например:

B 88/77 праймер - 17-мерен олигодеоксинуклеотид - както е доставен е 12,6 OD единици/ml. Трябва да направим 5 uM изходен разтвор за PCR.

MW: 17 x 330 = 5610

Концентрация: 12,6 OD x 37 ug/ml = 466 ug/ml = 466 mg/l = 0,466 g/l

Моларност: 0,466/5610 = 0,000083 Молар = 83 uM

Следователно: имаме нужда от 5 ul изходен разтвор на олиго в 83 ul (+78 ul вода), за да направим 5 uM разтвор (ако 1 uM в 83 ul дава 1 uM разтвор.)

ii) Изчисляване на количествата за PCR реакции: ако имаме нужда от крайна концентрация от 0,5 uM олиго в PCR реакционната смес (краен обем 50 ul), добавяме 5 ul от 5 uM запас към реакционната смес (1/10 крайно разреждане) .

Б) нуклеотиди:

Запаси от нуклеотиди за PCR (или друга процедура) са ПОЧТИ ВИНАГИ dNTP s (дезоксинуклеотиди) и концентрациите се дават почти винаги в ВСЕКИ dNTP: тоест дадената концентрация е ВСЕКИ нуклеотид в сместа, НЕ общата концентрация. Това означава, че 2,5 mM dNTP смес за PCR съдържа 2,5 mM от ВСЕКИ dNTP и 10 mM ОБЩО dNTP.

Пример:

i) Пригответе 2,5 mM изходен разтвор на dNTP от 100 mM отделни dNTPs, доставени от Promega:

  • ПЪРВО смесете равни обеми от всеки нуклеотид (напр.: 50 ul): това ви дава 200 ul от 25 mM смесени dNTPs (запомнете: концентрация, изразена в ВСЕКИ dNTP).
  • ТОГАВА разредете това (или аликвотна част) 1/10 с ВОДА - аликвотна част в количества от 100 ul и се замразява.

ii) Пригответе 1 mM запас от dNTP с dTTP, заместен до 10% (w/w) с дигоксигенин-11-dUTP (DIG-dUTP) за използване като смес за етикетиране за PCR маркиране на PCR продукти:

  • DIG-dUTP, доставен (от Boehringer Mannheim) при 25 nmol/25ul = 1 umol/ml = 1 mM крайната концентрация на DIG-dUTP трябва да бъде 1/10 от тази на други нуклеотиди, а [DIG-dUTP] + [dTTP] трябва = [ всеки друг dNTP]. Следователно, за да се получи 1 mM dNTP запас, трябва да се разреди DIG-dUTP запас 1/10.
  • ПЪРВО разредете отделни 100 mM dNTP запаси до 10 mM (напр. 5 ul до 50 ul, във вода).
  • ТОГАВА смесете равни обеми (напр. 10 ul) от 10 mM dCTP, dGTP и dATP запас и 9/10-и обем dTTP (9 ul). Добавете равен обем (напр. 10 ul) от 1 mM DIG-dUTP.
  • ТОГАВА добавете вода до 10 vol (=100 ul добавете 51 ul): крайна концентрация на всеки dNTP = 1 mM крайна концентрация DIG-dUTP = 0,1 mM и на dTTP = 0,9 mM.

iii) ИЗПОЛЗВАЙТЕ смес, направена по-горе при 50 uM всеки dNTP в PCR реакционна смес, краен обем 25 ul:


Протокол

Настройка на реакцията:

Препоръчваме да сглобите всички компоненти на реакцията върху лед и бързо да прехвърлите реакциите в термоциклер, предварително загрят до температурата на денатурация (95 & degC).

Съставна част 25 &mul реакция 50 &mul реакция Крайна концентрация
10X стандарт Taq Реакционен буфер 2.5 & mul 5 &mul 1X
10 mM dNTPs 0,5 & микрол 1 &мул 200 µM
10 & microM преден грунд 0,5 & микрол 1 &мул 0,2 & microM (0,05 & ndash1 & microM)
10 µM обратен грунд 0,5 и микрона 1 & мул 0,2 & microM (0,05 & ndash1 & microM)
Шаблонна ДНК променлива променлива & lt1000 ng
Taq ДНК полимераза 0,125 & микрол 0,25 & микрол 1,25 единици/50 & микро PCR
Вода без нуклеази до 25 & микрол до 50 & микрол

Бележки: Внимателно разбъркайте реакцията. Съберете цялата течност до дъното на епруветката чрез бързо завъртане, ако е необходимо. Покрийте пробата с минерално масло, ако използвате PCR машина без нагряван капак.

Прехвърлете PCR епруветките от лед в PCR машина с блока, предварително загрят до 95°C и започнете термоциклиране.

Условия за термоциклиране за рутинна PCR:

СТЪПКА
ТЕМП
ВРЕМЕ
Първоначална денатурация
95°C
30 секунди
30 цикъла 95°C
45-68°C
68°C
15-30 секунди
15-60 секунди
1 минута/кб
Окончателно разширение 68°C 5 минути
Задръжте 4-10°C


Основни упътвания:

Олигонуклеотидните праймери обикновено са с дължина 20&ndash40 нуклеотида и в идеалния случай имат GC съдържание от 40&ndash60%. Компютърни програми като Primer3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3) могат да се използват за проектиране или анализ на праймери. Крайната концентрация на всеки праймер в реакция може да бъде 0,05 & ndash1 & muM, обикновено 0,1 & ndash0,5 & muM.

Концентрацията на Mg ++ от 1,5&ndash2,0 mM е оптимална за повечето PCR продукти, генерирани с Taq ДНК полимераза. Крайната концентрация на Mg++ в 1X стандарт Taq Реакционният буфер е 1,5 mM. Това поддържа задоволително усилване на повечето ампликони. Въпреки това, Mg ++ може да бъде допълнително оптимизиран на стъпки от 0,5 или 1,0 тМ, използвайки MgCl2.

Усилването на някои трудни мишени, като богати на GC последователности, може да бъде подобрено с добавки, като DMSO (3) или формамид (4).

Крайната концентрация на dNTPs обикновено е 200 цтМ от всеки дезоксинуклеотид.

Обикновено препоръчваме да използвате Taq ДНК полимераза при концентрация от 25 единици/ml (1,25 единици/50 &mul реакция). Въпреки това, оптималната концентрация на Taq ДНК полимеразата може да варира от 5&ndash50 единици/ml (0,25&ndash2,5 единици/50 &mul реакция) в специализирани приложения.

Първоначалната денатурация от 30 секунди при 95°C е достатъчна за повечето ампликони от чисти ДНК шаблони. За трудни шаблони, като богати на GC последователности, се препоръчва по-дълга първоначална денатурация от 2&ndash4 минути при 95°C преди PCR циклиране, за да се денатурира напълно шаблонът. При PCR на колония се препоръчва първоначална 5-минутна денатурация при 95°C.

По време на термоциклиране се препоръчва 15&ndash30 секунди денатурация при 95°C.

Етапът на отгряване обикновено е 15&ndash60 секунди. Температурата на отгряване се основава на Tм на двойката праймери и обикновено е 45 & ndash68 & degC. Температурите на отгряване могат да бъдат оптимизирани чрез извършване на PCR на температурен градиент, започващ 5°C под изчисленото Tm. Калкулаторът NEB Tm се препоръчва за изчисляване на подходяща температура на отгряване.

Когато се използват праймери с температури на отгряване над 65°C, е възможен 2-етапен PCR протокол (виж #10).

Препоръчителната температура на удължаване е 68°C. Времето за удължаване обикновено е 1 минута на kb. Препоръчва се последно удължаване от 5 минути при 68°C.

Обикновено 25&ndash35 цикъла дават достатъчен продукт. Може да са необходими до 45 цикъла за откриване на цели с малък брой копия.

Когато се използват праймери с температури на отгряване над 65°C, е възможен 2-етапен протокол за термоциклиране.


Протокол

Настройка на реакцията:

Препоръчваме да сглобите всички компоненти на реакцията върху лед и бързо да прехвърлите реакциите в термоциклер, предварително загрят до температурата на денатурация (95 & degC).

Съставна част 25 &mul реакция 50 &mul реакция Крайна концентрация
10X стандарт Taq Реакционен буфер 2,5 &mul 5 &mul 1X
10 mM dNTPs 0,5 & микрол 1 &мул 200 µM
10 & microM преден грунд 0,5 & микрол 1 & мул 0,2 µM (0,05&ndash1 µM)
10 µM обратен грунд 0,5 & микрол 1 &мул 0,2 µM (0,05&ndash1 µM)
Шаблонна ДНК променлива променлива <1,000 ng
Taq ДНК полимераза 0,125 & микрол 0,25 & микрол 1,25 единици/50 & микрона PCR
Вода без нуклеази до 25 & микрол до 50 & микрол

Забележки: Внимателно смесете реакцията. Съберете цялата течност до дъното на епруветката чрез бързо завъртане, ако е необходимо. Покрийте пробата с минерално масло, ако използвате PCR машина без нагрят капак.

Прехвърлете PCR епруветките от лед в PCR машина с блока, предварително загрят до 95°C и започнете термоциклиране.

Условия за термоциклиране за рутинна PCR:

СТЪПКА
ТЕМП
ВРЕМЕ
Първоначална денатурация
95°C
30 секунди
30 цикъла 95°C
45-68 & degC
68°C
15-30 секунди
15-60 секунди
1 минута/kb
Окончателно разширение 68°C 5 минути
Задръжте 4-10°C


Основни упътвания:

Олигонуклеотидните праймери обикновено са с дължина 20&ndash40 нуклеотида и в идеалния случай имат GC съдържание от 40&ndash60%. Компютърни програми като Primer3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3) могат да се използват за проектиране или анализ на праймери. Крайната концентрация на всеки праймер в реакцията може да бъде 0,05&ndash1 &uM, обикновено 0,1&ndash0,5 &uM.

Концентрацията на Mg ++ от 1,5&ndash2,0 mM е оптимална за повечето PCR продукти, генерирани с Taq ДНК полимераза. Крайната концентрация на Mg++ в 1X стандарт Taq Реакционният буфер е 1,5 mM. Това поддържа задоволително усилване на повечето ампликони. Въпреки това, Mg ++ може да бъде допълнително оптимизиран на стъпки от 0,5 или 1,0 mM с помощта на MgCl2.

Усилването на някои трудни мишени, като богати на GC последователности, може да бъде подобрено с добавки, като DMSO (3) или формамид (4).

Крайната концентрация на dNTPs обикновено е 200 µM от всеки дезоксинуклеотид.

Обикновено препоръчваме да използвате Taq ДНК полимераза при концентрация от 25 единици/ml (1,25 единици/50 &mul реакция). Въпреки това, оптималната концентрация на Taq ДНК полимеразата може да варира от 5&ndash50 единици/ml (0,25&ndash2,5 единици/50 &mul реакция) в специализирани приложения.

Първоначалната денатурация от 30 секунди при 95°C е достатъчна за повечето ампликони от чисти ДНК шаблони. За трудни шаблони, като богати на GC последователности, се препоръчва по-дълга първоначална денатурация от 2&ndash4 минути при 95°C преди PCR циклиране, за да се денатурира напълно шаблонът. При PCR на колония се препоръчва първоначална 5-минутна денатурация при 95°C.

По време на термоциклиране се препоръчва 15&ndash30 секундна денатурация при 95°C.

Етапът на отгряване обикновено е 15&ndash60 секунди. Температурата на отгряване се основава на Tм на двойката праймери и обикновено е 45 & ndash68 & degC. Температурите на отгряване могат да бъдат оптимизирани чрез PCR на температурен градиент, започващ с 5°C под изчисленото Tm. Препоръчва се калкулаторът NEB Tm да изчисли подходяща температура на отгряване.

Когато се използват праймери с температури на отгряване над 65°C, е възможен 2-етапен PCR протокол (виж #10).

Препоръчителната температура на удължаване е 68 & degC. Времето за удължаване обикновено е 1 минута на kb. Препоръчва се последно удължаване от 5 минути при 68°C.

Обикновено 25&ndash35 цикъла дават достатъчен продукт. Може да са необходими до 45 цикъла за откриване на цели с малък брой копия.

Когато се използват праймери с температури на отгряване над 65°C, е възможен 2-етапен протокол за термоциклиране.


Резултати

Блокираща производителност на грунда

Добавянето на блокиращ праймер към PCR сместа ясно намалява броя на амплифицираните фрагменти от хищници и обогатява броя на по-редките фрагменти от плячка. В rDNA смеси, съдържащи 1000 пъти повече rDNA фрагменти на "хищник" (крил) в сравнение с фрагменти на rDNA "плячка" (водорасли), само пикове, съответстващи на rDNA на крил, могат да бъдат открити чрез анализ на фрагменти, когато не се добавя блокиращ праймер (Таблица 3). Добавянето на блокиращ праймер, инхибиращ отгряване, в съотношение 4:1 в сравнение със съответния универсален праймер (1,0 μL блокиращ праймер и 0,25 μL универсален праймер, и двата 10 μM) доведе до намалено амплифициране на рДНК на крил, но не и до пълно спиране на амплификацията (Таблица 3) . И чрез добавяне на 10 пъти повече блокиращ праймер от универсалните праймери (2,5 μL блокиращ праймер и 0,25 μL всеки универсален праймер), рДНК на водораслите се амплифицира почти изключително (Таблица 3). Добавянето на 20 пъти повече блокиращ праймер (5,0 μL блокиращ праймер и 0,25 μL всеки универсален праймер) намалява още повече пика на крил (Таблица 3).

"Нормалният" праймер Short28SR-blkKrill3'c3 изглежда беше малко по-ефективен при блокиране на ДНК на хищник в сравнение с DPO праймера Short28SF-DPO-blkKrill. Пиковете, съответстващи на рДНК на крил, бяха по-ниски в блокиращия праймер 4:1: универсални праймерни смеси както за 1:100, така и за 1:1000 плячка: хищнически rDNA проби с нормалния праймер в сравнение със смесите с DPO праймер (Таблица 3) . Въпреки това, DPO праймерът до голяма степен блокира амплификацията на ДНК на крил, когато се добавя в съотношение 10:1 към немодифицирания праймер (Таблица 3).

Грундът за спиране на удължаване 28S-ElArKrill-3'c3 не работи. Не е генериран никакъв PCR продукт, когато се добавя към PCR сместа (данните не са показани).

Анализ на стомаха на крил

Общо 111 клона от 13 различни стомаси на крил бяха секвенирани, разкривайки 36 различни последователности, попадащи в 6 големи групи. Сред тях няма последователности, съответстващи на дивия тип 28D rDNA на крил. 10 различни (общо 15) последователности обаче са очевидно с произход от крил (Фигура 3) и вероятно псевдогени или версии с ниско копие, които обикновено не се откриват чрез директно секвениране.

Дърво на подобие на последователности. Дърво на сходството на последователности от последователности, амплифицирани от стомаси на крил и свързани последователности. Последователностите на стомаха на крил са наречени така, като първите три букви означават дата на вземане на проби, т.е. M24 = 24 март 2007 г., S17 и S20 = 17 септември и 20 септември 2007 г., St. означава номер на стомаха и числото в скоби е равно на числото на идентични последователности от всяка различна последователност, открити в различните стомаси. Дървото е без корени.

Бяха открити четири различни групи от водорасли. Две от тези групи, открити само в пробите от март, са имали най -близко съвпадение с видовете, принадлежащи към Bacillariophyta, съответно от рода Феодактил и рода Скелетонема (Фигура 3). Трета група, открита в стомаси от трите дати на вземане на проби, изглежда донякъде подобна на Bacillariophyta, но не съответства на нищо в GenBank (Фигура 3). Секвенираната област от 200 bp беше твърде неинформативна, за да разкрие къде принадлежи групата чрез филогенетичен анализ, освен това, че групата най-вероятно е от водорасли произход. Последната група водорасли е една последователност от септември, принадлежаща на Chlorophyta (Фигура 3).

Една голяма група от последователности, която преобладава в пробата от септември, не може да бъде недвусмислено идентифицирана чрез позоваване на текущите последователности в GenBank. Най-близките съвпадения са 96% съвпадение с Ставротевтис (Молуска). Възможно е това да представлява хранителни продукти за мекотели, като ларвни калмари. Възможно е обаче също така, че Stauroteuthis последователността е неправилно докладвана и всъщност е получена от замърсител на оригинала Ставротевтис проба.

Последователностите са депозирани в GenBank под присъединителните номера EU378965 - EU379000.


Taq полимераза


Дефиниция на единица: Една единица се дефинира като количеството на ензима, необходимо за катализиране на включването на 10 nmola dNTP в киселинно-неразтворима форма за 30 минути при 70 °C, като се използва ДНК на сперматозоидите на херинг като субстрат.

Доставка: изпратени върху син лед

Условия за съхранение: съхранявайте при -20 °C
избягвайте циклите на замразяване/размразяване

Срок на годност: 12 месеца

концентрация: 5 единици/&мул

Описание:
Taq Polymerase се препоръчва за рутинни PCR приложения (до 4 kb дължина на фрагмента), PCR с висока пропускателна способност или генотипиране. Буферната система гарантира стабилни и надеждни резултати от амплификация в почти всички приложения за PCR. Кристалният буфер съдържа добре балансирано съотношение на калиеви, амониеви и магнезиеви йони, за да осигури висока специфичност и минимално образуване на странични продукти без нужда от допълнителни стъпки за оптимизация.
Ruby Buffer допълнително съдържа буфер за зареждане с гел и присъща червена боя. Червеното багрило позволява лесен визуален контрол по време на настройката на PCR и в комбинация с реагента за плътност директното зареждане на реакционния продукт в гела.
Ензимът репликира ДНК при 72 °C. Той катализира полимеризацията на нуклеотиди в дуплексна ДНК в посока 5'→3' в присъствието на магнезий. Той също така притежава 5 '→ 3' полимеризационно-зависима екзонуклеазна заместителна активност, но му липсва 3 '→ 5' екзонуклеазна (корекционна) активност.

съдържание:
Taq полимераза (червена капачка)
5 единици/&mul Taq ДНК полимераза в 20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 % Tween-20, 0,5 % Nonidet P-40, 50 % (v/v) Glycerol (25 ° C)

Ruby Buffer (черна капачка)
10 х конц. пълен PCR буфер, съдържащ 200 mM Tris-HCl, KCl, (NH4)2ТАКА4 и 20 mM MgCl2, червена проследяваща боя и реагент за плътност за зареждане на гел

Кристален буфер (зелена капачка)
10 х конц. пълен PCR буфер, съдържащ 200 mM Tris-HCl, KCl, (NH4)2ТАКА4 и 20 mM MgCl2

съставна частPCR-211SPCR-211LPCR-211XL
Taq
Полимераза
200 единици
/ 40 &mul
1000 единици
/ 200 & мул
5000 единици
/ 1 мл
Рубин буфер1,2 мл5 х 1,2 мл25 мл
кристал
Буфер
1,2 мл5 х 1,2 мл25 мл


Настройка на анализа:
Преди да започнете, разбъркайте добре всички компоненти, за да осигурите хомогенност.
Пригответе премикс за броя на анализите, от които се нуждаете, съгласно следния протокол:

комп.шапка с козирказапас конц.окончателен конц.1 анализ @ 20 &mul1 анализ @ 50 &mul
Вода от клас PCRбяло напълнете до 20 &mulнапълнете до 50 &mul
Рубинен буфер или кристален буферчерен или зелен10x1x2 &мул5 &mul
dNTP Mix / 10 mM #NU-1006бяло10 mM200 &muM0,4 & мул1 &мул
Taq полимеразачервен5 единици/&мул0,025 единици/&мул0,1 и мул0,25 &mul
грунд микс или всеки грунд 10 & muM всеки грунд200 - 400 nM всеки праймер0,4-0,8 &mul1 - 2 &mul
шаблон
/проба ДНК
10 &mul 1)
удължение 2)
95 ° C
50 - 68 °C
72 ° C
10 - 20 сек
10 - 20 сек
20 сек - 4 мин

25 - 35x

Зареждане с гел и приложения надолу по веригата:
Ruby Buffer (#PCR-272) включва реагент за плътност + проследяващо багрило и позволява директно зареждане на PCR продуктите в гел за електрофореза. За откриване на ДНК/флуоресцентно оцветяване на ДНК препоръчваме използването на багрила от ново поколение (например SYBR DNA Stain, #PCR-273) вместо класическия, но силно мутагенен етидиев бромид.
Кристален буфер (#PCR-271) се препоръчва за приложения надолу по веригата, като секвениране на ДНК, лигиране, рестрикционно смилане или когато е необходим анализ на PCR продукта чрез абсорбция или флуоресцентна възбуждане. За гел електрофореза добавете буфер за зареждане на гел и флуоресцентно ДНК оцветяване (напр. Gel Loading Buffer with DNA Stain, #PCR-274 - #PCR-276) преди да заредите PCR в гела. Използването на предварително оцветени гелове или протоколи за оцветяване след серия е също възможно.

Допълнителни буферни системи:
Буфер за етикетиране (#PCR-263) се препоръчва за ДНК маркиране или приложения за мутагенеза. Буферът е специално оптимизиран за включване на белязани или модифицирани нуклеотиди в ДНК. Той дава превъзходни резултати в широк спектър от реакционни условия с повечето двойки праймер-шаблон, но амплификацията може също да доведе до повишена неспецифичност.
KCl буфер (#PCR-262) се препоръчва за използване при рутинни PCR реакции. Буферът е оптимизиран за най-висока специфичност, но може да изисква допълнителна фина настройка на параметрите на анализа като MgCl2 концентрация и температура на отгряване.

Оптимизиране на MgCl2 концентрация:
Препоръчва се крайна концентрация на Mg 2+ от 2,0 mM в комбинация с буфер за етикетиране. Въпреки това, ако индивидуалната оптимизация на Mg 2+ е от съществено значение, добавете 25 mM MgCl2 изходен разтвор (#PCR-266), както е показано в таблицата по-долу.

краен MgCl2 конц.20 &mul краен обем на анализа50 &mul краен обем на анализа
2 mM--
3 mM0,8 & мул2.0 &mul
4 mM1.6 &mul4.0 и мул
5 mM2.4 и мул6.0 &mul

Цитати на продукти:
Моля, щракнете върху черната стрелка вдясно, за да разширите списъка с цитати. Щракнете върху заглавието на публикацията за пълния текст.


Дискусия

Тук описваме нова техника за амплифициране на ДНК за намаляване на отрицателните ефекти от несъответствията между праймер и шаблон върху ефективността на амплификация на целеви шаблони. Този метод е изключително обща и проста модификация на PCR реакцията и включва три ензимни стъпки, включително медиирано от полимераза линейно копиране на геномни ДНК шаблони, екзонуклеазно смилане на праймери и последна PCR амплификация с помощта на праймери, насочени към независим от мишената линкер последователности. Както е показано в този ръкопис, този подход позволява експоненциалното усилване на целевата цел да бъде извършено с праймери, които нямат несъответствия с шаблони в реакцията. Това значително намалява отклонението, свързано с несъответствия и изродени праймери, които могат да се натрупват по време на PCR чрез ограничаване на взаимодействията праймер-шаблон само до два цикъла.

Целите на това проучване бяха: (i) да се демонстрира, че първият и вторият етап на PCR могат да бъдат разделени и все пак да генерира надеждна амплификация (ii) да се определи дали дегенерациите в праймерните пулове са довели до очевидно изкривяване на наблюдаваната микробна общност, и ако PEX PCR техниката може да се използва за заобикаляне или намаляване на такова изкривяване, (iii) разработете стабилен работен процес за този подход, който да бъде приложен за всеки набор или набори от праймери, и (iv) идентифицира приложения, за които този подход е най-подходящ. Резултатите тук показват, че наистина двата определени типа взаимодействия в рамките на PCR (и.д. естествени и изкуствени взаимодействия) могат и трябва да бъдат разделени, когато се използват изродени праймери или когато се очакват несъответствия с шаблона. Етапите трябва да бъдат разделени, тъй като взаимодействията между геномна ДНК матрица и праймер имат най-голям потенциал за отклонение поради несъответствия, получени от истински несъответствия в gDNA и от дегенерации в праймерния пул. Нашият анализ на изкуствено синтезирана фалшива общност демонстрира силния потенциал за дегенериран праймерен пул от олигонуклеотиди с различни температури на топене за преференциален избор на шаблони въз основа на вариации на последователността в мястото на праймера. Нашата стратегия ограничава взаимодействието между gDNA шаблон-праймер до два цикъла, като всички последващи цикли на амплификация използват недегенерирани, не-шаблонни взаимодействия. Освен това, тъй като се използват само два цикъла по време на първия етап от взаимодействията между gDNA-праймер, могат да се използват необичайни условия на отгряване и удължаване. В това проучване използвахме дълги времена на отгряване (20 минути) при ниски температури на отгряване, за да позволим достатъчно време на полимеразата да се свърже с целевите места и да се удължи, без да повишава реакционната температура. Такива реакционни условия вероятно са по-толерантни към ниската ефективност на отгряване на праймера на чифтовите двойки с несъответствия. В систематично изследване на взаимодействията праймер-шаблон, Wu et al. [31] съобщават, че единични несъответствия, възникващи в последните 3-4 позиции от 3' края на праймера, дават минимално или никакво удължаване на праймера. Тук наблюдаваме, че 3' несъответствия могат да бъдат преодолени с помощта на PEX PCR метода и че праймерите с 3 или 4 несъответствия все още могат да се отгряват с геномни ДНК цели и да доведат до полимеразно разширение. Това беше разкрито чрез анализ на моделите за използване на праймер в анализите на фалшивите общности. Отбелязваме, че такъв анализ не може да се извърши с помощта на стандартни PCR подходи и изисква PEX PCR метод.

Освен това, ние демонстрираме чрез сравнението на PEX PCR метода със и без екзонуклеаза, че праймерите, насочени към изходната gDNA (или фалшивата ДНК), допринасят за изкривяването по време на по-късните цикли на PCR дори в присъствието на високи концентрации на PCR праймери от втория етап . Пълното отстраняване на неинкорпорирани праймери от реакцията на първия етап, макар и желателно, се оказва трудно. Дори след разреждане, екзонуклеазно смилане и понижаване на концентрацията на праймера по време на първите два цикъла, известно ограничено количество праймер от първи етап може да бъде размножено до втория етап на PCR. Въпреки това, лечението с екзонуклеаза значително намалява въздействието на пренасянето на праймера и е съществена част от методологията на PEX PCR. При анализи както на фалшива общност, така и на гДНК на околната среда, лечението с екзонуклеаза значително променя наблюдаваната микробна общност. Възможно е на мястото на третиране с екзонуклеаза, блокиране на олигонуклеотиди на обратното комплемента на праймери, специфични за предния и обратния матрица (д.ж. инверсен комплемент на 515F и 806R праймери без CS1 и CS2 линкери) може да бъде добавен към втория PCR етап на PEX PCR реакцията, за да се предотвратят взаимодействията между gDNA шаблон-праймер.

PEX PCR методът също така предоставя нов и стабилен механизъм за изследване на взаимодействията праймер-шаблон при анализи на сложни проби от gDNA. Методът PEX PCR запазва последователността на отгряване на праймера към шаблона на gDNA през първите два цикъла на реакцията и те могат да бъдат биоинформатично разпитани, за да се определи кои праймери в дегенерирания пул наистина участват в отгряването и удължаването. Наблюдавахме, че при високи температури на отгряване се предпочита идеалното съвпадение на отгряване и се използва по-малко разнообразие от праймери в басейна. Това изглежда е пагубно за реакцията на амплификация, тъй като перфектно съвпадащи праймери присъстват при ниско общо изобилие в силно дегенериран праймерен пул. При по-ниски температури на отгряване, по-широк спектър от праймери, съдържащи несъответствия с шаблона, участват в отгряване и удължаване. Това изглежда е от полза, тъй като анализите на фалшивата общност при по-ниски условия на отгряване генерират по-добри представяния на истинското основно разпределение на фалшивите ДНК. Наблюдавано е, че праймерите с 0–4 несъответствия с различни шаблони се отгряват и позволяват удължаване на полимераза. Когато 3' несъответствия бяха въведени в фалшиви ДНК шаблони, разпределението на използването на праймери се измести към праймери с 1 или 2 общи несъответствия с шаблона. Следователно, тежката дегенерация на наборите от праймери може да не е от полза при използване на PEX PCR метода. Вместо това може да е подходящо да се изберат „междинни“ праймери, които имат най-много 1 или 2 несъответствия с всички потенциални места за праймиране, с допускането, че всеки вариант не изисква уникален праймер, за да бъде насочен. Необходими са по -нататъшни изследвания, за да се определи най -добрата комбинация от дегенерация на праймера и температури на отгряване за други, по -дегенерирани цели, като например микробни функционални гени. Такава стратегия може да позволи директен PCR-базиран метод за анализ на единично копие на ген, присъстващ във всички микроорганизми, за целите на анализи на структурата на общността. Освен това отбелязваме, че може да са необходими допълнителни стратегии, за да се позволи на PEX PCR метода да работи ефективно при по -ниски температури на отгряване (д.ж. <45°C), като въвеждането на едноверижен ДНК свързващ протеин в главните смеси за амплификация.

Методът PEX PCR се препоръчва за: (i) всяка PCR реакция, при която се използва дегенериран праймер (ii) всяка PCR реакция, при която се използва недегенеративен праймер, но където е възможна вариабилност на ДНК матрицата на мястото на праймиране (iii ) реакции, при които може да се използва дегенерация на високо ниво за насочване към всички известни варианти на ген и (iv) когато няколко двойки праймери трябва да се използват едновременно. Тук показваме, че методът може да се използва за амплифициране и секвениране на шаблони с несъответствия в 3' края на мястото на праймера, за които е доказано, че са силно дестабилизиращи в PCR [31,32]. Crosby и Criddle [33] по-рано използваха стратегия, използваща хибридизационно улавяне, последвано от произволно праймирана амплификация и секвениране към целеви ДНК-насочени гени на РНК полимераза (rpoC). PEX PCR методът може да се адаптира към директна PCR амплификация на rpoC гени от всички микроорганизми в рамките на една реакция на амплификация. Това ще запази оригиналното относително изобилие, открито в шаблонната ДНК, и ще осигури пряк прокси за относителното изобилие от организми в пробата. Това е за разлика от амплификацията и секвенирането на rRNA гени, както е извършено в това проучване, тъй като широк спектър от генни копия на rRNA оперони се намират в домейните Bacteria и Archaea [34]. Все още не знаем дали нивото на израждане в запазените региони на rpoC (или друг подобен) ген вероятно ще бъде основна пречка по време на първите два цикъла на етап "А" на PEX PCR метода, но това е ясна следваща стъпка в развитието на тази техника. Ако се наблюдава димеризация на праймер в реакции с изключително дегенерирани праймерни пулове, пречистване на компонентите от етап „А“ с помощта на протокол за избор на размер (д.ж. AMPure перли) вместо екзонуклеаза ще намали трансфера на праймерни димери, които са нечувствителни към едноверижна екзонуклеазна активност.

Методът PEX PCR може също да намери широко приложение за количествени PCR, в които се използват дегенерирани праймери. Количествени PCR могат да бъдат извършени чрез първоначална обработка на ДНК проби, приготвени с помощта на етап „А“ на метода PEX PCR. Впоследствие qPCR ще се изпълнява, като се използват праймери, насочени към линкерни последователности, вместо специфични за шаблон праймери. Това потенциално може значително да повиши ефективността на qPCR и целевия обхват за широкоцелеви дегенерирани праймери, общи за микробиологията на околната среда, и да избегне проблеми, произтичащи от диференциалната ефективност на усилване за различни цели. Подобен подход всъщност е разработен с цел да се намали въздействието на замърсяването с бактериална ДНК при qPCR реакции [35].

И накрая, ние отбелязваме, че този метод има концептуални прилики с проучване, проведено по-рано от Crosby и Criddle [33], в което линкерни последователности, свързани със случайни праймери, бяха използвани за амплифициране на функционални гени, които бяха уловени с помощта на хибридизационни сонди. В това проучване са използвани два цикъла на отгряване и удължаване за етикетиране, с последващо усилване. В допълнение, Illumina е разработила подход за улавяне на мишени, при който два праймера с линкери или в 5’ или 3’ краища се оставят да се отгряват към една верига от матрица ДНК (и.д. TruSeq Amplicon). След удължаване на полимераза, лигирането се използва за свързване на удължения фрагмент с 3' крайния праймер с 3' фланкиран линкер. Впоследствие, PCR амплификация с помощта на линкерни последователности се използва за приготвяне на фрагменти за секвениране.


QRT-PCR стандартни криви в реално време. ефективността е твърде висока ! - (29 юни 2005 г.)

В моите qRT-PCR експерименти в реално време използвам метода на стандартната крива за количествено определяне на генната експресия. Стандартните криви обаче изглеждат за мен огромна процедура, дори с гени, които са добре установени да работят добре с реално време, като GAPDH.

Понякога успявам да създам отлични стандартни криви с наклон приблизително -3,3 (

100% ефективност) свързаните криви на топене за всяко разреждане също са отлични.

Въпреки това, през повечето време може да получа отлични криви на топене за всяко разреждане, но наклонът за моята стандартна крива може да падне около -2,6 (

Някой може ли да предложи някакво обяснение за тази странна дилема? Следователно може ли някой да предложи някои предложения за решаване на този проблем?

Едно нещо, за което се сещам, е, че получавам неравномерна ефективност на усилване при различни концентрации на РНК. FYI, аз обикновено използвам 100 ng/uL РНК за "1x" и правя серийни разреждания до 100x. Разбирам, че наистина трябва да използвам по-голям диапазон от разреждания, но по-големи от 100x разреждания просто не работят за моите гени/праймери.

Благодаря за всяка помощ, която мога да получа.

Какъв е обхватът на Cts? Видяхте ли замърсяване във вашата отрицателна контрола?

My Ct values for the standard curves usually range from around 14-20, and the negative controls are showing no DNA contamination.

What instrument are you using?

Dear YuJ,
Are you using SYBR Green as reporter dye and you are using iCycler?
What is your lowest dilution in your standard?

This is what always happen to me. If i run a SYBR Green assay using standard ranging from 10e6 to 1, i will get > 100% efficiency.
So what i did was I unselect the last two dilution (10 and 1) and the efficiency become

3.3.
I think this is due to the primer dimer formation that contribute to the false signal in you reaction. And the effect of the primer dimer is great enough to afact you data especially in the low concentration standard.

I am indeed using SYBR Green chemistry (ABI SYBR Green PCR Mix), but the instrument I use is the Applied Biosystems 7900HT.

I have tried removing certain dilutions in all possible permutations before plotting the trendlines, but the outcomes are inconsistent between experiments. I also don't believe I have any primer-dimers because of the very pronounced product peaks and complete absence of primer-dimer peaks from the dissociation/melting data.

Hi YuJ,
Could you please describe how you preparing your quantitative standard?

My quantitative standards are prepared as such.

1. RNA isolation using TRIZOL reagent following manufacturer instructions plus an additional overnight purification step with ethanol (100%) and sodium acetate (3 M).

2. Spectrophotometric determination of [RNA]. A260/A280 ratio is usually at around 1.8.

3. Serial dilution of RNA at 1x, 10x, 25x, 75x, 100x, and sometimes 1000x (with 1x being 100 ng/uL diluted from stock, 10x being 10 ng/uL, etc.) using DEPC-treated water. I make sure to vortex each tube very well before pipetting for the next dilution.

4. Reagents in RT-PCR reactions include: Multiscribe Reverse Transcriptase (ABI), RNaseOUT RNase Inhibitor (Invitrogen), SYBR Green 2x PCR Mix (ABI). These, plus DEPC-treated water, are combined as a master mix.

5. Primer concentrations have been previously optimized for each primer. In the case of GAPDH, I determined the ideal concentration to use would be 0.06 uM per reaction for both the forward and reverse primer.

6. In each reaction tube, I first add the water and master mix, then the primers, and then finally the appropriate RNA template.

7. Each tube is vortexed and loaded in triplicate into the appropriate optical reaction plate. Plate is centrifuged to get rid of air bubbles and placed into the ABI 7900HT.

8. Thermocycler is set for a 45C RT phase (30min), 95C melting + 60C annealing phase (40 cycles), and then an additional dissociation phase at the end for generating the dissociation curves.

I probably included a lot of irrelevant facts, but hopefully this is what you meant by how I prepare my quantiative standards.

Dear YuJ,
Thanks for your description. I would strongly suggest you to use invitro transcription to prepare your GAPDH mRNA rather than using TRIzol extracted total RNA.

The reason is when you use TRIzol to extraction, you will get total RNA not GAPDH specific mRNA. So when you quantitate using spetrophotometrically, the reading will be out. Thus it would not give you a

You may try to clone the GAPDH gene into a plasmid and invitro trascripted(IVT) into GAPDH mRNA --> treat with DNase I to completly remove DNA conteminant--> stop DNase reaction --> purify the mRNA --> quantitate you mRNA*-->converte xx ug/ul into xx RNA copy/ul--> perform 10 fold serial dilution --> run RT-PCR.

This should give you a batter result.

*optional:
If you want to make sure that you IVT GAPDH mRNA is free from DNA conteminat, you may run a RT-PCR and a PCR (no RT) simultaneously. Your (no RT) PCR should not give you any band. If it does, treat you standard again with DNase I.

Забележка:
when you do a cloning please in clude 10-20 bp extra flanking at the both 3' and 5' end of your acture mRNA target. This will provide bater stability against exonuclease and yield prolong shelf life to your standard.

I would like to recommend you to use Ambion produst for IVT purpose.

Thank you for your advice, Hadrian, but I do not believe that method is suitable for me.

Although I've only mentioned GAPDH serial dilution as an example, I am actually conducting a gene expression study for some other genes, merely using GAPDH as an internal control.

Also, when I made the spectrophotometric measurements, I was just interested in the A260/A280 ratio as a measure of RNA purity and a rough estimate of the total RNA concentration in the stock tube. Indeed I am measuring total RNA, but gene-specific primers are used in the RT-PCR for actual quantification.

Sorry, I should have first mentioned what I'm actually doing instead of assuming that others can read my mind.


The Degenerate Primer Design Problem: Theory and Applications

A PCR primer sequence is called degenerate if some of its positions have several possible bases. В degeneracy of the primer is the number of unique sequence combinations it contains. We study the problem of designing a pair of primers with prescribed degeneracy that match a maximum number of given input sequences. Such problems occur when studying a family of genes that is known only in part, or is known in a related species. We prove that various simplified versions of the problem are hard, show the polynomiality of some restricted cases, and develop approximation algorithms for one variant. Based on these algorithms, we implemented a program called HYDEN for designing highly degenerate primers for a set of genomic sequences. We report on the success of the program in several applications, one of which is an experimental scheme for identifying all human olfactory receptor (OR) genes. In that project, HYDEN was used to design primers with degeneracies up to 10 10 that amplified with high specificity many novel genes of that family, tripling the number of OR genes known at the time.


High concentration of primer in PCR - Biology

The 64-bit Mac version should work on most modern Macs (OS X 10.7 or newer).

FreeBSD users may simply type pkg install pooler

For all other systems (GNU/Linux, older Mac, Solaris. ) please compile from source (below).

Example primers file

Source code

  • a C compiler (GCC or Clang) and basic Unix tools,
  • MingW compiler(s) if you want to cross-compile for Windows.

Usage

  • If you opt to use Score when your primers and/or tags are very long, you will be asked if you are really sure you don't want to use deltaG instead.
  • If you opt for deltaG, the following questions will be asked: Temperature: Enter a number (decimal fractions are allowed). You can enter it in Celsius, Kelvin, Fahrenheit or Rankine. Do not enter the suffix C or K or F or R---Primer Pooler will determine for itself which unit was meant, and ask you to confirm. (Recent versions of Primer Pooler offer 5 additional obscure temperature scales if you decline all of the more probable ones.) Magnesium concentration in mM (0 for no correction): Enter your concentration of magnesium in nanomoles per cubic metre (decimal fractions are allowed). Enter 0 if you don't mind the deltaG figures not being corrected for magnesium concentration. Monovalent cation (e.g. sodium) concentration in mM: Enter your concentration of sodium etc in nanomoles per cubic metre (decimal fractions are allowed). If in doubt, try 50. dNTP concentration in mM (0 for no correction): Enter your concentration of deoxynucleotide (dNTP) in nanomoles per cubic metre (decimal fractions are allowed). Enter 0 if you don't mind the deltaG figures not being corrected for dNTP concentration.
  • If you answered yes to this question, the summary will be displayed on screen, and you will be asked if you also want to save it to a file. If you answer yes to this, you will be asked for a filename.
  • These up-front counts will include self-interactions (a primer interacting with itself), and interactions between the pair of primers in any given set. Self-interactions and in-set interactions are не counted when summarizing the counts of each pool (below).
  1. Go to http:// hgdownload. cse. ucsc. edu/ downloads. html
  2. Choose a species (e.g. Human)
  3. Choose "Genome sequence files"
  4. If you're under hg38, choose "Standard genome sequence files"
  5. Scroll down to the links, and choose the one that ends .2bit (e.g. hg38.2bit)
  • After the overlap scan is complete, Primer Pooler will then have enough data to write an input file for MultiPLX if you wish to run that software as well for comparison. If you decline this, it will ask if you want it to write a simple text file with the locations of all amplicons, which you may accept or decline.
  • If you do не opt to check for overlaps in the genome, then Primer Pooler will не take overlaps into account when generating its pools. This is rarely useful unless you have already ensured there are no overlaps in the set of amplicons under consideration. Even then, I would recommend performing a scan anyway, just to double-check: an early version found 11 overlaps in a supposedly overlap-free batch drawn up by an experienced academic---we all make mistakes. But bypassing the overlap check might be useful if you are sure there are no overlaps and you don't want to download a very large genome file to the workstation you're using.

You will not be allowed to set the maximum size of each pool lower than the average size of each pool, since that would make it logically impossible to fit all primer-sets into all pools. It is not advisable to set it just above the average either, since being overly strict about the evenness of the pools could hinder Primer Pooler from finding a solution with lower dimer formation. You might want to experiment with different maxima---you will be able to come back to this question and try again. Do you want to give me a time limit? (y/n): If you answer y, you will be asked to set a time limit in minutes. Normally 1 or 2 is enough, although you may wish to let it run a long time to see if it can find better solutions. You don't имам to set a time limit: you may manually interrupt the pooling process at any time and have it give the best solution it has found so far, whether a time limit is in place or not. Additionally, Primer Pooler will stop automatically when it detects better solutions are unlikely to be found. Do you want my "random" choices to be 100% reproducible for demonstrations? (y/n): If you answer y, Primer Pooler's random choices will be generated in a way that merely look random but are in fact completely reproducible. This is useful for demonstration purposes---you'll know how long it will take to find the solution you want. Otherwise, the random choices will be less predictable, as a different sequence will be chosen depending on the exact time at which the pooling was started. Pooling display While pooling is in progress, Primer Pooler will periodically display a brief summary of the best solution found so far, showing the pool sizes, and the counts of interactions (by deltaG range or score) within each pool. As instructed on screen, you may press Ctrl-C (i.e. hold down Ctrl while pressing and releasing C, then release Ctrl) to cancel further exploration and use the best solution found so far. Do you want to see the statistics of each pool? (y/n): After the pooling is complete, or after you have interrupted it (by pressing Ctrl-C as instructed on screen), you will be asked if you wish to see the interaction counts of each pool (rather than a simple summary of всичко pools as appeared during pooling). If you want this, you will also be asked if you wish to save them to a file, and, if so, what file name. Do you want to see the highest bonds of these pools? (y/n): If you answer Yes, you will be asked for a deltaG or score threshold, and all interactions worse than that threshold will be displayed on-screen with bonds diagrams such as:and you will then be asked if you wish to save it to a file, and, if so, what file name. You will then be asked if you would like to try another threshold. Shall I write each pool to a different result file? (y/n): If you answer y to this, you will be asked for a prefix, which will be used to name the individual results files. Otherwise, you will be asked if you wish to save all results to a single file. If you decline saving all results to a single file, the results will not be saved at all---this is for when you weren't happy with the solution and want to go back to try a different number of pools or a different maximum pool size. Do you want to try a different number of pools? (y/n): This question is self-explanatory. You can go back as many times as you like, trying different numbers of pools. But many researchers have a pretty good idea of how many pools they want to use, or else are happy with the computer's initial suggestion. Would you like another go? (y/n): If you answered No to trying a different number of pools, or if you didn't want the program to do pooling at all, then you will be asked if you want to start the program again. Answering No to this question will exit.

Command-line usage

The only mandatory argument (if not running interactively) is a filename for the primers file. This should be a text file in multiple-sequence FASTA format, such as:(this example does not represent real primers). Degenerate bases are allowed using the normal letters, and both upper and lower case is allowed. Names of amplicons' primers should end with F or R, and otherwise match. Optionally include tags (tails, barcoding) to apply to all primers: >tagF and >tagR (tags can also be changed part-way through the file).

Processing options should be placed before this filename. Options are as follows: --help or /help or /? Show a brief help message and exit. --counts Show score or deltaG-range pair counts for the whole input. deltaG will be used if the --dg option is set (see below). This option produces a fast summary of how many primer pairs (in the entire collection, before pooling) have what range of interaction strengths. This could be used for example to check a pool that you have already chosen manually, or if you want a rough idea of the worst-case scenario that pooling aims to avoid. --self-omit Causes the --counts option to avoid counting self-interactions(a primer interacting with itself), and interactions between the pair of primers in any given set. --print-bonds=THRESHOLD Similar to --counts , this can be useful for checking a manual selection or for a rough idea. All interactions worse than the given threshold (deltaG if --dg is in use, otherwise score) will be written to standard output, with bonds diagrams. --dg[= temperature[, mg[, cation[, dNTP]]]] Set this option to use deltaG instead of score. Optional parameters are the temperature (default is human blood heat), the concentration of magnesium (default 0), the concentration of monovalent cation (e.g. sodium, default 50), and the concentration of deoxynucleotide (dNTP, default 0). Decimal fractions are allowed in all of these. Temperature is specified in kelvin, and all concentrations are specified in nanomoles per cubic metre. --suggest-pools Outputs a suggested number of pools. This is the approximate lowest number of pools needed to achieve no worse than a deltaG of -7 (or a score of 7) in each. --pools[= NUM[, MINS[, PREFIX]]] Splits the primers into pools. Optional parameters are the number of pools (if omitted or set to ? then the suggested number will be calculated and used), a time limit in minutes, and a prefix for the filenames of each pool (set this to - to write all to standard output). --max-count=NUM Set the maximum number of pairs per pool. This is optional but can make the pools more even. A maximum lower than the average is not allowed, and it's usually best to allow a generous margin above the average. --genome=PATH Check the amplicons for overlaps in the genome, and avoid these overlaps during pooling. The genome file may be in .2bit format as supplied by UCSC, or in .fa (FASTA) format. --scan-variants When searching for amplicons in a genome file, scan variant sequences in that file too, i.e. sequences with _ and - in their names. By default such sequences are omitted as they're not normally needed if using hg38. --amp-max=LENGTH Sets maximum amplicon length for the overlap check. The default is 220. --multiplx=FILE Write a MultiPLX input file after the --genome stage, to assist comparisons with MultiPLX's pooling etc. --seedless Don't seed the random number generator --version Just show the program version number and exit.

Changes

Defects fixed

  1. an error in incremental-update logic sometimes had the effect of generating suboptimal solutions (in particular, pools could be unnecessarily empty, and/or full beyond any limit that was set)
  2. an error in the user-interface loop meant that if you use tags, run interactively, and answer "yes" to the question "Do you want to try a different number of pools", the second run will have been done without the tags, and its results will have been de-tagged twice, removing some bases from the output moreover, the resulting truncated versions of your primers will have made it into the interaction calculations for any third run.

Versions prior to 1.17 also had a display bug: the concentrations for the deltaG calculation are in millimoles per litre, not nanomoles as stated on-screen in interactive mode (please ignore the on-screen instruction and enter millimoles, or upgrade to the latest version which fixes that instruction).

Versions prior to 1.34 would round down any decimal fraction you type when in interactive mode (for deltaG temperature, concentration and threshold settings). Internal calculation and command-line use was not affected by this bug.

Versions prior to 1.37 did not ignore whitespace characters after FASTA labels and the label) -->.

Notable additions

Version 1.2 added the MultiPLX output option, and Version 1.33 fixed a bug when MultiPLX output was used with tags and multiple chromosomes. Version 1.3 added genome reading from FASTA (not just 2bit), auto-open browser, and suggest number of pools.

Version 1.36 clarified the use of Taq probes, and allowed these to be in the input file during the overlap check. It's consequently stricter about the requirement that reverse primers must end with R or B : previous versions would accept any letter other than F for these.

Version 1.4 allows tags to be changed part-way through a FASTA file. For example, if there are two >tagF sequences, the first >tagF will set the tags for all F primers between the beginning of the file and the point at which the second >tagF is given the second >tagF will set the tags for all F primers from that point forward. You can change tags as often as you like.

Version 1.5 allows primer sets to be "fixed" to predetermined pools by specifying these as primer name prefixes , e.g. [email protected]:myPrimer-F fixes myPrimer-F to pool 2.

Version 1.6 detects and warns about alternative products of non-unique PCR. It was followed within hours by Version 1.61 which fixed a regression in the amplicon overlap check.

Version 1.7 makes the ignoring of variant sequences in the genome optional, and warns if primers not being found might be due to variant sequences having been ignored.


Гледай видеото: Sabun köpüğü tırnak tasarımı. Bubble nails. 2. Ders (Декември 2022).