Информация

Какъв е препоръчителният максимален брой пасажи за клетки от бозайници (NCI-H441)?

Какъв е препоръчителният максимален брой пасажи за клетки от бозайници (NCI-H441)?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Има ли общоприет максимален брой пъти, в които трябва да разделяте и повторно засявате клетки от култура на бозайници, преди да рестартирате култури от нов материал?


Това е много добър въпрос и подчертава много често погрешно схващане за клетъчната култура и използва номерата на пасажите като индикация за това колко добре се държи клетката. Въпреки че това може да бъде добър барометър, но е подвеждащо. Пасажирането може да стресира клетките, ако се извършва много често, въпреки че отново зависи от това колко бързо се делят клетките.

Не трябва да мислите за пасаж (и клетъчна култура като цяло) по отношение на самата процедура, а по отношение на удвояване на популацията (PD), което може да се изчисли с помощта на формулата, предоставена тук (http://www.sciencellonline.com/site/ техническа поддръжка.php). Аз лично използвам [Log10(Nobering cell No/Seeding cell No)/Log10(2)]. Това трябва да ви позволи да характеризирате клетъчното си поведение между всеки пасаж и ви позволява да начертаете кумулативна PD графика. След като кумулативното PD спрямо времето стане нелинейно, тогава ще знаете, че клетките са променили поведението и може да е най-добре да използвате нов запас.

Основното предимство на този метод е, че не разчитате на работа с предположения и се справяте със солидни числа и ви позволява да предвидите кога трябва да очаквате да започнете нова партида за преминаване. Въпреки че номерата на пасажите могат да свършат същата работа, ако приемете за пасаж, клетките са направили определен PD, но това е по-скоро работа на предположение и не можете да проследите колко добре се справят клетките ви в даден момент от време. Например един от основните проблеми с използването на пасаж като мярка е, че можете да пасирате клетките при 98% сливане в нова колба и въпреки че това се брои за пасаж, но е доста неинформативно по отношение на поведението на клетките и не ви дава твърди числа и можете да направите това много пъти и въпреки че бихте направили голям брой пасажи, но клетките ви ще изглеждат добре. Въпреки че подобно упражнение е безсмислено и вероятно ще натовари клетките, но това е просто да се подчертае, че номерата на пасажите не са непременно много информативна и количествено измерима мярка за това колко добре клетките работят или се държат, следователно трябва да се използват PD и кумулативна PD. Друго предимство е, че тъй като имате работа с действителния брой клетки, ако сте променили размера на колбата си за клетъчна култура от да кажем Т-75 на Т-25, не е нужно да се притеснявате за промени в честотата на преминаване или да трябва да направете още догадки как това е повлияло на поведението на вашата клетка.

Основният ми съвет е, че трябва да поддържате честотата на преминаване една и съща поне в началото (въпреки че следете плътността на клетките, тъй като може би не искате да оставите клетките да бъдат прекалено сливащи се или несливащи се при преминаване, в зависимост от на вашата специфична методология и това, което е установено във вашата лаборатория), но пребройте своята плътност на засяване и събиране (клетка №) и изчислете PD и кумулативния PD и начертайте кумулативна PD спрямо времева графика и наблюдавайте поведението на клетките. Това трябва да ви даде добра индикация за вашето клетъчно поведение при условията, в които работите с тях, тъй като насоките са точно това, ръководства и те никога не могат да заменят експерименталната характеристика на вашите клетки при вашите условия и метод на работа!


Субкултивиране на суспензионни клетки

Следните протоколи описват общи процедури за субкултивиране на клетки от бозайници в суспензионна култура. Имайте предвид, че процедурата за преминаване на клетки от насекоми се различава от тази за клетки от бозайници в няколко важни стъпки. За повече информация вижте Бележки за субкултивиране на клетки от насекоми.

За преминаване на вашата собствена клетъчна линия ви препоръчваме да следвате стриктно инструкциите, предоставени с всеки продукт, който използвате в експериментите си. Последиците от отклонението от условията на култура, необходими за определен тип клетка, могат да варират от експресията на аберантни фенотипове до пълен провал на клетъчната култура.

Пасиращи висящи култури
Субкултивирането на суспензионни клетки е малко по-малко сложно от пасажирането на прилепнали клетки. Тъй като клетките вече са суспендирани в растежна среда, няма нужда да се третират ензимно, за да се отделят от повърхността на съда за култура и целият процес е по-бърз и по-малко травматичен за клетките. Заместването на растежната среда не се извършва в суспензионни култури, вместо това клетките се поддържат като се хранят на всеки 2 до 3 дни, докато достигнат сливане. Това може да стане чрез директно разреждане на клетките в колбата за култивиране и продължаване на тяхното разширяване, или чрез изтегляне на част от клетките от колбата за култивиране и разреждане на останалите клетки до плътност на засяване, подходяща за клетъчната линия. Обикновено периодът на закъснение след пасажирането е по-кратък от този, наблюдаван при прилепнали култури.


Клетъчен пасаж: Как правилно да се разреждат и разделят култивирани клетки

Има много различни техники за клетъчна култура. Използването на правилни методи за клетъчно пасажиране е важно за поддържане на клетъчната линия в експоненциална крива на растеж, което я прави добър модел като гостоприемник за експерименти за трансфекция. “Клетъчен проход” е термин, използван от други учени, за да демонстрират следния процес:

  1. Измийте клетките с PBS
  2. Отделете клетките от колбата чрез трипсинизация
  3. Ресуспендирайте в пълна среда (съдържа FBS), за да неутрализирате трипсина
  4. Прехвърлете подходящото разреждане в нова колба, съдържаща достатъчно среда

Правилното разреждане на пасажа е специфично за клетъчната линия и зависи от фактори като време за удвояване и предназначена употреба на клетките. Важният аспект, който трябва да запомните, е, че съотношението на разделяне се определя от общия обем на трипсин и среда от стъпки 2 и 3 по-горе. Като пример за колба T75, ако 1 mL трипсин се използва за отделяне на клетките и 9 mL пълна среда се използва за неутрализиране на трипсина, тогава общият обем на суспензията е 10 mL. В зависимост от клетъчната линия, ето примери за съотношения на разделяне, които изследователят може да следва:


Процедура

  1. Разгледайте културите с помощта на обърнат микроскоп, за да оцените степента на клетъчна плътност и да потвърдите отсъствието на бактериални и гъбични замърсители. Събиране на клетки в логаритмичната фаза на растеж. За прилепнали клетъчни линии събиране на клетки възможно най -близо до 80 - 90% сливане.
  2. Поставете прилепналите и полуприлепнали клетки в суспензия, използвайки трипсин/EDTA, както е описано по-горе и повторно суспендирайте в обем прясна среда, най-малко еквивалентен на обема на трипсин. Суспензионните клетъчни линии могат да се използват директно.
  3. Отстранете малка аликвота от клетки (100-200μL) и извършете броя на клетките. В идеалния случай клетъчната жизнеспособност трябва да бъде над 90%, за да се постигне добро възстановяване след замразяване.
  4. Остатъчната култура се центрофугира при 150 х g за 5 минути.
  5. Повторно суспендирайте клетките при концентрация от 2-4x106 клетки на mL в замразена среда.
  6. Пипетирайте 1 ml аликвоти от клетки в криопротективни ампули, които са етикетирани с името на клетъчната линия, номера на пасажа, номера на партидата, клетъчната концентрация и датата.
  7. Поставете ампулите в пасивен фризер, напр. Nalgene Mr. Frosty Контейнер за замразяване. Напълнете фризера с изопропилов алкохол и поставете при -80 °C за една нощ.
  8. Замразените ампули трябва да се пренесат в паровата фаза на съда за съхранение на течен азот и да се запишат местата.

Bright-Line е търговска марка на Cambridge Instruments, Inc.
Nalgene е регистрирана търговска марка на Thermo Fisher Scientific или нейните дъщерни дружества


Съображения за безопасност на течен азот

Общи проблеми с безопасността

Важно е персоналът да бъде обучен за използването на течен азот и свързаното с него оборудване, включително съдовете за съхранение, които трябва да бъдат обезвъздушени безопасно, и контейнерите, които може да се наложи да се напълнят. Както при всички лабораторни процедури, при работа с азот винаги трябва да се носи лични предпазни средства, включително козирка за цялото лице и термоизолирани ръкавици в допълнение към лабораторно палто и за предпочитане пластмасова престилка, устойчива на пръски. Правилното обучение и използването на защитно оборудване ще сведат до минимум риска от измръзване, изгаряния и други неблагоприятни инциденти.

Риск от асфиксия

Единственото най-важно съображение за безопасност е потенциалният риск от задушаване, когато избягалият азот се изпарява и измества атмосферния кислород. Това е критично, тъй като изчерпването на кислород може много бързо да причини загуба на съзнание, без предупреждение. Следователно хладилниците с течен азот трябва да се поставят в добре проветриви помещения, за да се сведе до минимум този риск и да бъдат обект на планирана превантивна поддръжка. Магазините с големи обеми трябва да имат алармени системи за ниско съдържание на кислород.


Първични клетъчни линии

Първичните клетъчни линии се извличат директно от изрязана тъкан и култури или като експлантна култура, или след дисоциация в единична клетъчна суспензия чрез ензимно смилане. Такива култури първоначално са хетерогенни, но по-късно стават доминирани от фибробласти. Приготвянето на първични култури е трудоемко и те могат да се поддържат инвитро само за ограничен период от време. По време на относително ограничения си живот първичните клетки обикновено запазват много от диференцираните характеристики на клетката in vivo. Важна забележка: Първичните култури по дефиниция не са пасажирани, веднага след като бъдат пасирани, те се превръщат в клетъчна линия и вече не са първични.


Оценка на клетъчния растеж

Точното преброяване на клетките е от първостепенно значение при оценката на клетъчния растеж в културите, тъй като неправилното преброяване може да доведе до погрешни заключения за здравето на клетките. Броят на клетките може да се определи с помощта на хемоцитометър. Въпреки това, автоматизираните броячи на клетки, които използват принципа на Coulter, при който клетките преминават една по една през отвор в електрически сензор, дават най-прецизния брой клетки.

Фигура 2. Scepter™ 2.0 ръчен автоматизиран брояч на клетки


Клетки за замразяване и размразяване

Как да замразим клетките

  • култивирани клетки
  • среда за клетъчен растеж
  • разтвори за отделяне на клетки от плочата, ако се използват прилепнали клетки (напр. балансиран разтвор на сол, трипсин/EDTA)
  • диметилсулфоксид (DMSO) клас на тъканна култура
  • фетален говежди серум (FBS)
  • криовиалети
  • камера за замразяване на клетки
  • -80°C фризер
  • течност N2 резервоар за дългосрочно съхранение.

1. Пасажни клетки

За криоконсервация трябва да се използват здрави, активно растящи клетки. Винаги се опитвам да замразя голям брой клетки, които не са били пасирани в култура твърде много пъти.

Прекарвам клетките 1-2 дни преди замразяването, за да се уверя, че те са в логаритмична фаза на растеж по време на замразяването.

Някои лаборатории препоръчват смяна на растежната среда 24 часа преди замразяването, ако клетките не са били пасирани по това време.

2. Подгответе клетки

Отстранете клетките от съдовете, като следвате обичайния метод за пасажиране на прилепнали или суспензионни клетки. Обединете всички клетки и центрофугирайте.

3. Ресуспендирайте клетките в замразяваща среда и аликвотни части към криовиалите

Замразяването на клетките може да бъде смъртоносно. За да се избегнат щетите, които могат да бъдат причинени например от образуване на ледени кристали, осмотичен стрес или увреждане на мембраната, се използва криопротектор за понижаване на точката на замръзване на клетките.

DMSO, като 10% изходен разтвор, е най-често използваният криопротектор.

Внимание: Носете ръкавици, когато работите с DMSO, тъй като той лесно прониква през кожата.

Най-често срещаната среда за замразяване е 90% FBS/10% DMSO. За по-малко придирчиви клетки и за тъканна култура с бюджет, може също да се използва 10% DMSO в среда за клетъчен растеж.

След центрофугиране, ресуспендирайте клетъчната пелета в 1 mL замразяваща среда на криовиана.

Уверете се, че имате криовиони, предназначени за течен N2 съхранение. Обикновено планирам 1 100-милиметрова чиния с клетки на криовианал. Флаконите трябва да бъдат етикетирани с лабораторен маркер, който ще издържи на алкохол и течен N2.

Внимавайте да включвате номера на пасажи/партиди, когато етикетирате криовиалетите.

4. Замразяване на клетки

За да позволите на водата да излезе от клетките преди замръзване, замразете клетките бавно. Това се постига с помощта на камера за замразяване на клетки. Скъпите хладилни камери пулсират в течност N2 периодично, за да контролирате скоростта на замръзване.

По-евтините опции включват камери, които използват изопропанол при стайна температура. Флаконите се поставят в камерата, добавя се изопропанол и камерите се поставят при –80°C за най-малко 4 часа.

Тези от нас с ограничен бюджет (като мен!) използват домашно приготвени камери. Запазвам стелажите от Styrofoam™, които идват с 15-mL конуси, поставям криовиана във всяка дупка, покривам с втора стойка, залепвам стелажите заедно и поставям при –80°C.

5. Не забравяйте да преместите клетките си в течния N2 резервоар

Вероятно едно от най-трудните неща в този протокол е да си спомните да преместите замразените си криовиони в течния N2 танк! Обикновено оставям клетките ми да замръзнат за една нощ и след това бързо поставям криовиалите в течния N2 резервоар.

Как да размразяваме клетките

1. Извадете клетките от резервоара и размразете

За най -голяма жизнеспособност на клетките е важно клетките да се замразят бавно. Обратното е вярно за размразяването - размразете бързо! Отстранете криовиалите от течността N2 резервоар и веднага ги поставете във водна баня с температура 37°C.

Съхранявайте криовиалите във водна баня, докато в криовиала не остане и най-малкият леден кристал.

2. Прехвърляне, завъртане (?) и чиния

Незабавно прехвърлете клетките в голям обем предварително затоплена среда за растеж на клетки (

10 mL/1-mL аликвотна част от клетки). За следващата стъпка трябва да вземете решение.

Има две направления на мислене за това дали криопротекторът трябва да бъде незабавно отстранен от клетките:

  1. В някои лаборатории клетките се центрофугират и клетъчната пелета се ресуспендира в прясна среда за растеж на клетките преди поставянето на клетките в блюдо за култура. Това е начинът, по който за първи път се научих да размразявам клетките.
  2. Някои данни обаче показват, че клетките са изключително крехки след размразяване и че центрофугирането може да увеличи клетъчната смърт. Поради това се препоръчва клетките да бъдат поставени в плаки и растежната среда да се смени по-късно.

За прилепнали клетки можете да смените средата веднага щом клетките се прикрепят към съда.

Превключих на този метод и сега обикновено изваждам клетките си точно преди да напусна лабораторията за през нощта и първо сменям средата на следващата сутрин.

3. Проверете вашите клетки

Около 24 часа след размразяването разглеждам клетките си внимателно под микроскоп, за да се уверя, че са здрави и се държат нормално.

Резюме

Ефективното замразяване и размразяване на клетките ще ви спести неудобството да поискате от колега още една аликвота от техните клетки или разходите за закупуване на нови клетки.

И ако всичко друго не успее, не забравяйте да замразите бавно и да размразите бързо! За повече информация относно криоконсервацията вижте нашата статия за запазване на микроорганизми. Кажете ни за вашите най -добри съвети за замразяване и размразяване на клетки!

Първоначално публикуван на 3 април 2013 г. Прегледан и актуализиран май 2021 г.

Това помогна ли ви? След това, моля, споделете с вашата мрежа.

6 коментара

Работя върху CHO суспензионни клетки, в нашата институция няма място в -196 за съхраняване на замразени клетки. Така
1.Можем ли да съхраняваме замразени CHO клетки при -80?
2. Какъв е подходящият брой клетки за замразяване?

Колко дълго можем да съхраняваме CHO суспензионни клетки при -80?

Зависи дали имате криопротектор. Но като цяло те могат да продължат много дълго време.

Някаква информация за това колко клетки трябва да бъдат поставени върху колба с определен размер?

Наистина зависи от типа клетки, които използвате. Те могат да бъдат с много различни размери.
Понякога можете да получите представа, като разгледате уебсайта на ATCC и разгледате условията на културата.

При замразяване на размразяването поставях толкова клетки в колбата, колкото бяха в колбата, когато събирах реколтата.
Ако смятате, че клетките ви няма да издържат добре при замразяване, можете да ги поставите в по-малка колба.
Ребека

Бях научен от някакъв човек, който направи трансгенни мишки да добавя бавно DMSO отделно към вашата замразяваща среда. Това позволява на клетките да свикнат с DMSO, тъй като той е токсичен за клетките, особено при по-високи температури. Сега използвам 2 части среда за замразяване на клетките си. Използвам нормална среда (DMEM, 10% FCS, гентамицин), за да ресуспендирам клетките си в и 2х среда за замразяване (DMEM, 30% FCS, 20% DMSO, гентамицин). След центрофугиране на клетките си, ресуспендирам клетките си в половината от крайния обем в ледено студена нормална среда и след това постепенно добавям ледено студената 2x замразяваща среда, като въртя клетките между всяко добавяне. Държа клетките на лед, за да ги охладят, докато достигнат -80C (в какъвто контейнер е наличен).

За частта за размразяване размразявам клетките във водна баня при 37°C и ги поставям върху лед, след като ледът в епруветката почти изчезне. След това клетките се поставят в ледено студена епруветка Falcon от 14 ml върху лед и постепенно се добавят ледено студен DMEM, 10% FCS, гентамицин, като отново се върти между всяко добавяне. (Обикновено използвам ¬6ml за добавяне, но можете да добавите още, ако искате). След като завъртя клетките си, ресуспендирам клетките си в DMEM със стайна температура, 10% FCS, гентамицин и ги поставям в инкубатора.

Може да изглежда прекалено сложно (за някои клетъчни линии със сигурност е така), но ако трябва да чакате всеки път, докато клетките ви са здрави, за да правите експерименти, може просто да си струва усилията. Късмет!


РЕАГЕНТИ И РАЗТВОРИ

HEPES буфер, 50 mM (рН 8,0)

  • 238,3 g HEPES (свободна киселина напр. Sigma-Aldrich, кат. № H3375)
  • 800 ml Milli-Q вода
  • Регулирайте рН до 8.0 с 10 N NaOH
  • Доведете обема до 1000 ml с вода Milli-Q

Съхранявайте при стайна температура до 1 година

Приготвеният разтвор е 1 М HEPES изходен разтвор. Преди употреба, разредете 20× във вода Milli-Q, за да приготвите 50 mM разтвор.

PEG 8000, 50%

  • 250 g PEG 8000 (напр. Sigma-Aldrich, кат. № 89510-250G-F)
  • 250 мл вода Milli-Q
  • Загрейте до 80°C, за да разтворите PEG 8000
  • Оставете разтвора да се охлади
  • Съхранявайте при стайна температура до 2 месеца

PEI, 1 µg/µl

  • 1. Разтворете PEI (напр. Polysciences, кат. № 23966-1) чрез завихряне, като използвате стерилна вода, загрята до 80°C и използвайки ∼90% обем, необходим за достигане на крайна концентрация от 1 g/L (1 µg/µl) .
  • 2. Охладете до стайна температура.
  • 3. Регулирайте рН до 7,0 с НС1.
  • 4. Добавете стерилна вода до крайна концентрация от 1 µg/µl.
  • 5. Филтрирайте с 0,22-µm мембранен филтър и разделете на аликвоти. Съхранявайте при -20°C до 1 година.
  • 6. Размразете във водна баня при 37°C, докато утайките се разтворят напълно.

7. Съхранявайте размразената аликвотна част при 4°C до 1 месец.

Утайките се разтварят отново чрез инкубиране при 37 ° C преди употреба.


Изкушаващо е да започнете да експериментирате в момента, в който клетките ви пристигнат. В действителност може да отнеме известно време, за да получите добро усещане за това как е вероятно да се държат вашите клетки. Не всяка аликвотна част е еднаква, дори ако източникът е един и същ. Струва си да отделите време, за да приложите всяка необходима стратегия, за да поддържате работата си възможно най-последователна и точна.

LabTAG от GA International е водещ производител на високоефективни специални етикети and доставчик на идентификационни решения, използвани в изследователски и медицински лаборатории, както и в здравни институции.


Гледай видеото: Харпагин форте - победи болката! (Февруари 2023).