Информация

Избор на рекомбинантен гостоприемник по метод за избор на цвят

Избор на рекомбинантен гостоприемник по метод за избор на цвят


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

В технологията за рекомбинантна ДНК, за да изберете рекомбинантен гостоприемник от нерекомбинантни, имаме различни видове техники.

Този, за който говоря, е избор на цвят метод с използване на 2 маркера (един устойчив на антибиотик ген за напр. ампицилини другият Z-ген). Използваме Z-ген като репортер ген. Тук използваме безвекторна Е. Coli като клетка гостоприемник.

Сега, когато добавим към чашата на Петри добавяне на ампицилин, съдържащ всички варианти (трансформанти и нетрансформанти), - нетрансформантите ще умрат. Трансформантите оцеляват.

Сега добавяме X-gal към репликата на тази петриева чаша и виждаме, че някои от колониите стават сини поради действието на ензима β-галактозидаза, който от своя страна се произвежда от непокътнатия Z-ген в плазмида. Това означава, че нашите сини колонии са нерекомбинантните.

Въпросът ми е-

Средата, взета в паничката на Петри, също трябва да съдържа глюкоза, нали? В противен случай рекомбинантите също биха дали цветна реакция (X-gal е хомолог на лактоза) поради Z-гена, присъстващ в тях хромозомна ДНК (концепция за оперон).

Въпросът може би е глупав, тъй като е някак очевидно, че трябва да доставяме основни нужди за растежа на бактерии (което обикновено е глюкоза).

Просто исках да потвърдя в случай, че нямаме налична глюкоза! =стр


Z генът, за който говорите, трябва да бъде lacZ който кодира $ beta- $ галактозидазата, която е направена от $ alpha $ и $ omega $ пептиди. Нито един пептид не функционира сам по себе си.

$eta-$галактозидазата ще разцепи гликозидната връзка в X-gal и ще образува галактоза и 5-бромо-4-хлоро-3-хидроксииндол. Последният продукт след това се димеризира и окислява до 5,5'-дибромо-4,4'-дихлоро-индиго, интензивно син продукт което е лесно за идентифициране и количествено определяне.

След това трябва да проверите генотипа на вашия бактериален щам, защото те обикновено имат само $omega$-пептида, кодиран в генома му. По този начин ензимната активност на $ beta- $ галактозидазата се възстановява само когато $ alpha $ -пептидът е в околната среда и процесът се нарича $ alpha $ -допълнение.

Два често използвани щама за клониране и експресия в E. coli са Dh5 $ alpha $ и TOP10.

Генотипът за Dh5a е следният:

F- Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK-, mK+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1

Тук, lacZΔM15 показва, че сегментът M15 е загубен от lacZ, а мутантният протеин ще има само $ omega $ -пептида.

Генотипът за TOP10 е така:

F- mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara leu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG

Отново ще забележите lacZΔM15, който все още е нефункционален пептиден сегмент.

И накрая, на вашия въпрос. Дори ако в средата няма глюкоза като първичен енергиен източник и присъства само X-gal, оперонът на вашата гостоприемна бактерия (предполагам, че е E. coli) не може да произвежда самостоятелно функционалната $ beta- $ галактозидаза. Нещо повече, рекомбинантите, с векторната последователност, кодираща $ alpha $ -пептида, нарушен, няма да проявят $ alpha $ -комплементация. Тогава няма цветна реакция! :Д

Справка:
1.Генотипове на Invitrogen ™ компетентни клетки - TOP10, извлечен от: https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/cloning/competent-cells-for-transformation/chemically-competent/top10f-genotypes.html.
2.Генотипове на Invitrogen™ компетентни клетки - DH5a, извлечено от: https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/competent-cells-for-transformation/chemically-competent/dh5alpha-genotypes.html.
3. Langley, К. Е .; Виларехо, М. Р .; Fowler, A. V .; Zamenhof, P. J .; Забин, И. (1975). "Молекулярна основа на бета-галактозидаза алфа-комплементация". Сборник на Националната академия на науките на Съединените американски щати. 72 (4): 1254-1257. doi:10.1073/pnas.72.4.1254. PMC 432510 Свободно достъпен. PMID 1093175. 4.


Идентифициране на рекомбинанти и усилващ метод за инактивиране на избор

След въвеждането на rDNA в подходящи клетки-гостоприемници е важно да се идентифицират онези клетки, които са получили rDNA молекулите. Този процес се нарича скрининг или подбор.

Като цяло методите за селекция се основават на експресията или неекспресията на определени черти като антибиотична резистентност, експресия на ензим като β-галактозидаза или протеин като GFP (зелен флуоресцентен протеин) и зависимост или независимост от хранителни изисквания, като например като аминокиселина левцин.

ПЪРВИ ИЗБОР НА РЕКОМБИНАНТИ:

Ако клетките гостоприемници E.coli са поели плазмида pBR322, тогава тези клетки ще растат в среда, съдържаща антибиотик ампицилин или тетрациклин, докато нормалните клетки на E.coli ще бъдат убити от антибиотиците. Така само трансформирани клетки, макар и малко, ще бъдат избрани за растеж и делене.

МЕТОД ЗА АКТИВИРАНЕ НА ИНСЕРЦИОНЕН ИЗБОР:

Това е по -ефективен метод от директния избор. При този подход една от генетичните черти се нарушава чрез вмъкване на чужда ДНК.

Гените за резистентност към антибиотици действат като добра система за инактивиране при вмъкване.

Плазмидът pBR322 съдържа два гена за резистентност към антибиотици, единият за ампицилин (amp r ген), а другият за тетрациклин (tet r ген). Ако целевата ДНК се вмъкне в tet r гена с помощта на Bam HI, свойството на резистентност към тетрациклин ще бъде загубено. Такива рекомбинанти биха били чувствителни към тест.

Когато такива рекомбинанти (съдържащи прицелна ДНК в tet r гена) се отглеждат в среда, съдържаща тетрациклин, те няма да растат, тъй като техният ген tet r е инактивиран. Но те са резистентни към ампицилин, тъй като генът am r е функционален.

От друга страна, самолигираните рекомбинанти ще покажат резистентност към ампицилин и тетрациклин. Следователно те ще растат на среда, съдържаща и двата антибиотика.

МЕТОД ЗА ИЗБОР НА СИНЬО-БЯЛ:

Друг мощен метод за скрининг за наличие на рекомбинантен плазмид се нарича синьо-бяла селекция.

Този метод се основава на инсерционното инактивиране на гена lac-Z, присъстващ във вектора (например PUC19).

Този ген експресира ензима β-галактозидаза, чиято активност може да разцепи безцветен субстрат, наречен X-gal, в продукт със син цвят.

Ако lac-Z генът е инактивиран поради наличието на инсерта, тогава ензимите не се експресират. Следователно, ако след експеримент за трансформация клетките-гостоприемници на E.coli се поставят върху плоча с ампицилин и X-gal, съдържаща твърда среда, тогава колониите, които изглеждат сини, са тези, които имат трансформирани клетки (устойчиви на антибиотици), но нямат вложката (експресно активно ензим).

Колониите, които изглеждат бели, са устойчиви на ампицилин и имат вмъкната рДНК и по този начин са клетките, които ще бъдат използвани за бъдещ експеримент.


Топ 3 метода за образуване на рекомбинантна ДНК

Рестрикционният ензим, който причинява счупване на чужда ДНК, също причинява разпределение на векторна ДНК на определено място на разцепване. Кохезионните краища на векторната ДНК притежават последователности от нуклеотиди, комплементарни на кохезионните краища на чужда ДНК. Това може да се илюстрира с помощта на пример за ензим Eco RI, ще се получат подобни лепкави краища със същите базови последователности в едноверижни краища.

Когато двата края на векторната ДНК срещнат комплементарните краища на чужда ДНК, двата ще се задържат чрез Н свързване. Този процес, при който две отделни нишки нуклеинова киселина взаимодействат, за да образуват дуплекс молекула чрез взаимодействие между комплементарни базови двойки, присъстващи в отделните нишки, често се нарича отгряване (фиг. 24.9).

Чуждият ДНК фрагмент с незалепващи краища първо се прави лепкав чрез добавяне на хомополимерна опашка към 3′ хидроксилния край. Хомополимерната опашка е по същество последователност от малкото подобни нуклеотиди, например поли А (AAAAA … ….) Или поли Т (TTTTT … ..).

Сега комплементарните нуклеотидни последователности на ДНК фрагмента и тези на вектора са ковалентно свързани заедно с помощта на ензимна крайна дезоксинуклеотидил трансфераза (Фиг. 24.10 и 24.11).

Ензимната ДНК лигаза запечатва и стабилизира отрязаните краища на две ДНК молекули чрез катализиране на фосфодиестерните връзки между 3 𔃺 H и 5 ′ фосфат на два съседни нуклеотида. Основното предимство на тази техника е, че чуждият ДНК сегмент може лесно да бъде извлечен от клонираните копия на химерна ДНК чрез повторно разцепване с помощта на същия ензим.

В същото време има два недостатъка на тази техника:

(i) Двата края на разцепената векторна ДНК или на чуждата ДНК могат да се съединят от край до край и те могат да бъдат повторно циркуляризирани преди вмъкването,

(ii) Мястото за разпознаване, особено в сегмента, който трябва да бъде клониран, може да не лежи на удобно място. При този процес вложката може да съдържа избираем маркер, който позволява идентифициране на рекомбинантни молекули. Често се използва антибиотичен маркер. Така че клетката гостоприемник без вектор умира, когато е изложена на определени антибиотици и гостоприемникът с вектора ще живее, защото е резистентен.

Трансформацията на Escherichia coli със сравнително големи парчета химерна ДНК може да бъде улеснена чрез третиране на клетките с CaCl2 при ниска температура, за да станат пропускливи. С тази процедура трансформиращата се ДНК влиза в клетката непокътната и бактерията гостоприемник остава жизнеспособна. Влизането на рДНК в E.coli също се улеснява чрез внезапно повишаване на температурата до 42 ° C за 2-5 минути.

При тази температура клетъчната мембрана на Е. coli става пропусклива за макромолекулите. Сега се развиха щамове на коли, които са пропускливи за макромолекулите. След това по време на растежа на трансформирана клетка Е. coli, рекомбинантната ДНК на плазмид се репликира.

Бактериалната клетка съдържа няколко плазмиди в нея и някои от тях са от рекомбинантен тип, а другите само от плазмидните носители. В такива случаи може да не е лесно да се определи дали клонинг на трансформирана клетка Е. coli носи рекомбинантна ДНК молекула или само плазмидния носител.

Изборът и изолирането на трансформирания гостоприемник зависи от тяхната резистентност към антибиотици, промяна на цвета или някои други характеристики. Различните вектори имат различни свойства, което ги прави подходящи за различни приложения. Някои свойства могат да включват симетрични сайтове за клониране, размер и голям брой копия.

За селекция на трансформирани клетки на базата на техните резистентни антибиотици е важно клетките да се инкубират в среда без антибиотик за около час, за да се позволи експресирането на плазмидни устойчиви на антибиотици гени.

След това клетките могат да бъдат поставени върху твърда среда, съдържаща антибиотик за селекция на колонии с рекомбинантна ДНК. Плазмидите, притежаващи маркер за резистентност към антибиотици, ще образуват колония, а тези без маркер за резистентност ще бъдат убити. Тази процедура за откриване на вмъкване се нарича умишлено инактивиране.

В щам pBR-322 има два различни антибиотични маркера-tet-r ген, отговорен за резистентност към тетрациклин и amp-r ген за резистентност към ампицилин. Един от двата гена се инактивира по време на разцепване на рестрикционен ензим и вмъкване на чужда ДНК. Сега, ако клетките са поставени върху среда, съдържаща ампицилин, всички оцелели колонии трябва да бъдат устойчиви на amp-r.

Образуване на рекомбинантна ДНК: Метод # 2. Въвеждане или трансфекция на фаги:

Въвеждането на фаг е процесът на трансфекция, който е еквивалентен на трансформация, с изключение на това, че вместо бактериален плазмид се използва фаг. In in vitro опаковки, вектор използва ламбда или М 13 фаги за производство на фагови плаки, които съдържат рекомбинантна ДНК. Рекомбинантната ДНК може да бъде идентифицирана с помощта на различни методи за подбор. За първи път се използва бактериофаг за прехвърляне на чуждата ДНК в клетки на Е. coli.

Ако векторът е бактериофаг, неговата репликация в бактериален гостоприемник би довела до фагови частици, всяка от които носи идентично копие на целевия ген. Когато се използват фагови вектори, популация от клетки е заразена с вирусите и репликацията на вируса протича спонтанно.

В крайна сметка фаговата ДНК, съдържаща целевия ген, се вмъква в бактериалната хромозома, където тя ще се репликира, сякаш е част от нормална хромозома. По този начин тези вектори заедно с целевите гени се въвеждат в бактериален гостоприемник. Това обикновено се постига с ензима ДНК лигаза. За лигирането е важно векторната ДНК и целевата ДНК да са отрязани от една и съща рестрикционна ендонуклеаза.

Образуване на рекомбинантна ДНК: Метод # 3. Небактериална трансформация:

Този процес е подобен на трансформацията. Единствената разлика между двете е, че небактериалната трансформация не използва бактерии като Е. coli като гостоприемник. При микроинжектиране ДНК фрагментът се инжектира директно в ядрото на клетката be | трансформиран.

В биологията клетките гостоприемници се бомбардират с високоскоростен пистолет за микро-снаряди, като частици от злато или волфрам, които са покрити с ДНК (фиг. 24.12).


Резултати

Системата за подбор

За да изберем за експресия, ние сливаме целевия мембранен протеин с C –терминален селектируем маркер, който придава фенотип на лекарствена резистентност, така че докато С-краят е в цитоплазмата, растежът върху селективна среда показва експресия на целевия мембранен протеин. Тъй като може да има много начини мутациите да осигурят лекарствена резистентност, които нямат нищо общо с експресията на кондензирания мембранен протеин, ние използваме стратегия за двойна селекция, при която една и съща цел на мембранния протеин се слива с един от двата маркера за лекарствена резистентност на два отделни плазмиди. Вероятността за получаване на мутации, които дават резистентност и към двете лекарства, без да се увеличава експресията на мембранния протеин, трябва да бъде изключително ниска. Двата селекционни плазмида, наречени pSEL1 и pSEL2, са илюстрирани на Фигура 1(А).

Плазмиди на селекционна система. О: Кодиращата последователност на протеина на целевата мембрана е слята с два различни избираеми маркера върху два съвместими плазмида, наречени pSEL1 и pSEL2. И двата плазмида използват PЛОШ промотор. Плазмидът pSEL1 има р15А произход на репликация и използва миши дихидрофолат редуктаза (mDHFR) като избираем маркер, който придава резистентност към триметоприм. Плазмидът pSEL2 има резистентност към канамицин (KanRes) като избираем маркер и носи произход на репликация colE1. Б: Двата плазмида, използвани за избор на подобрени мутанти, се отстраняват чрез in vivo храносмилане с рядко нарязващата се самонасочваща ендонуклеаза I-CreI. pSEL1 и pSEL2 съдържат 22bp I-CreI място за изрязване. I-CreI е кодиран върху pSC101 плазмид с резистентност към тетрациклин и чувствителен към температурата произход на репликация и тази конструкция се нарича pCURE.

Първоначално тествахме системата, като сравнявахме растежа върху селективна среда на клетки, произвеждащи добре експресиран мембранен протеин (GlpF) и тези, експресиращи слабо експресиран мембранен протеин (SPP). Както е показано на Фигура 2, клетките, съдържащи GlpF в pSEL1 и pSEL2, и тези, съдържащи SPP в pSEL1 и pSEL2, оцеляват в индуцираща среда без лекарства, което показва, че индукцията на нито един протеин не е смъртоносна за клетките. При наличието на подбор на лекарства без индукция, нито една от конструкциите не позволява оцеляване. При индуциращи условия и в присъствието на селекция оцеляват само клетки, експресиращи GlpF сливания. По този начин нашата система за селекция ефективно и ясно разграничава клетките, експресиращи високи нива на протеин на таргетната мембрана, и тези, експресиращи малко или никакъв протеин.

Ефективност на селекцията. ТОП10 клетки, произвеждащи добре експресиран мембранен протеин, глицероловият фасилитатор GlpF от E. coli, в pSEL1 и pSEL2 бяха сравнени с клетки, експресиращи слабо изразения мембранен протеин, сигнална пептидна пептидаза (SPP) от Archaeoglobus fulgidus, в pSEL1 и pSEL2. Само клетки, експресиращи GlpF, са в състояние да оцелеят в присъствието на селектиращо лекарство.

Излекуване на избрани мутанти

След мутантна селекция е необходимо да се отстранят плазмидите от селекционната система, pSEL1 и pSEL2, от щамовете. Открихме обаче, че традиционните методи за втвърдяване са много неефективни, когато се прилагат към нашите щамове и плазмиди. Затова ние разработихме бърз и ефективен метод за втвърдяване за тази работа.

В нашия метод на втвърдяване плазмидите, използвани по време на селекцията, се елиминират от in vivo храносмилане с рядка ендонуклеаза за рязане, хоминг ендонуклеаза I-CreI. 16 Както е показано на Фигура 1 (А), мястото за разпознаване на I-CreI е въведено в pSEL1 и pSEL2. За да премахнем селекционните плазмиди, въвеждаме трети плазмид, наречен pCURE, който кодира I-CreI ендонуклеаза и съдържа чувствителен към температурата източник на репликация [Фиг. 1 (В)]. I-CreI, експресиран от pCURE, смила двата pSEL плазмида и pCURE впоследствие се отстранява чрез растеж при повишена температура. С помощта на този метод щамовете могат надеждно да бъдат излекувани само за 2 дни.

Избор на щамове, които подобряват експресията на ромбоид-Rv1337

С ефективна система за подбор и високоефективна система за втвърдяване ние тествахме способността си да изолираме E. coli мутанти, които подобряват експресията на мембранния протеин. Насочихме се към MTb алфа-спираловиден протеин на вътрешната мембрана Rv1337, протеин от ромбоидно семейство, тъй като той е относително голям протеин, известен от предишната работа, за да бъде експресиран при ниски нива, откриваеми чрез Western blotting. В допълнение, ромбоид-Rv1337 има цитоплазмен С-край, който е необходим за селекция с С-терминални избираеми сливания на маркери, използвани в pSEL1 и pSEL2. Експресията на Rv1337 изглежда е токсична за клетките, тъй като клетъчният растеж се намалява драстично след индуциране.

Изборът беше извършен на две стъпки. Първо, ТОП10 клетки, съдържащи pSEL1, кодиращ ромбоид-Rv1337, бяха мутагенизирани или с основния аналог 2-аминопурин (2АР), или с мутаторния ген mutD5, и колониите бяха избрани поради способността им да растат върху среда, съдържаща лекарството триметоприм. Във втория етап колониите, устойчиви на триметоприм, се обединяват и трансформират с конструкцията pSEL2, кодираща rhomboid-Rv1337. След това клетките, съдържащи две плазмидни конструкции, бяха избрани върху среда, съдържаща както триметоприм, така и канамицин. Предимството на тази двуетапна процедура е, че голям брой мутагенизирани клетки могат да бъдат поставени в първата стъпка, без да се губят мутанти поради ниската ефективност на плазмидната трансформация. Обогатеният пул може след това да бъде избран във втория етап, за да се изолират наистина оцелелите клетки поради експресията на целевия мембранен протеин. Около 1 на 10 000 мутагенизирани клетки оцеляха при първата селекция на триметоприм (100 � μg/mL), докато приблизително 1 на 1000 от колоните, подбрани от триметоприм, оцеляха във втората стъпка и успяха да растат и върху двата канамицина (10 � & #x003bcg/mL) и триметоприм (100� μg/mL).

Ние проверихме 47 избрани колонии и въз основа на Western blotting 17 демонстрираха повишена експресия на ромбоид-Rv1337. Избрахме пет клона, всички от независимо мутагенизирани култури, които показаха най -голямо увеличение на производството на протеини, и ги излекувахме от селекционните плазмиди, използвайки метода, описан по -рано. Ние наричаме тези щамове EXP-Rv1337-1, EXP-Rv1337-2, EXP-Rv1337-3, EXP-Rv1337-4 и EXP-Rv1337-5.

За да потвърдим резултатите от експресията, ние трансформирахме излекуваните мутанти с pSEL1 и pSEL2 кодиращ ромбоид-Rv1337. Увеличението на експресията в петте избрани, излекувани и ретрансформирани мутанти е показано на Фигура 3. Качественото изследване на Western blot, показано на фигура 3(А), показва ясно подобрение на целевото производство на мембранен протеин. Това увеличение се определя количествено чрез сравнение с интензитета на известни количества добавен протеинов стандарт към лентите. Както е показано на Фигура 3 (В), избраните щамове подобряват експресията на ромбоидните Rv1337 сливания до 75 пъти.

Увеличаване на експресията на MTb ромбоид-Rv1337 в пет избрани EXP мутанти. О: Western blot, използващ специфично антитяло за N-терминален 6 ×His етикет на мембранния протеин ромбоид-Rv1337, експресиран в pSEL1 и pSEL2 в щам от див тип и в 5 EXP мутантни щама. Експресията от pSEL1 обикновено е по -ниска, отколкото от pSEL2, тъй като има по -нисък брой копия. Пробите бяха нормализирани въз основа на OD600. Стандартна концентрация на протеин (серия от двукратно разреждане от 1000 ng до 3.9 ng пречистена 6×His-маркирана биотинова лигаза) също беше заредена върху всеки гел, за да се определи количествено увеличението на експресията. Б: Крайното увеличение на експресията на ромбоиден-Rv1337 в pSEL1 и pSEL2. Увеличаването на сгъването се определя чрез денситометрия и сравнение със стандарта за концентрация на протеин. За всички хистограми увеличението на пъти се осреднява за три опита и се отчита стандартното отклонение.

Изразяване без сливане с избираем маркер

Тъй като нашата обща система за селекция изисква прикрепването на целевия протеин към слят партньор, ние искахме да проверим дали мутациите са ефективни, когато протеинът се експресира без прикрепен маркерен протеин. Фигура 4 показва експресията на ромбоид-Rv1337 със или без сливания до избираеми маркери. За дивия тип и всички мутантни щамове нивата на експресия с сливането бяха ясно по -ниски от експресията без сливането (виж фиг. 4). Независимо от това, щамовете EXP подобряват експресията на rhomboid-Rv1337 в сравнение с дивия тип, независимо дали са слети с маркерен протеин или не.

Производителност на изразяване без сливане до избираем маркер. Rhomboid-Rv1337 се експресира като сливане в pSEL1 и pSEL2 или без сливане както в pBAD/HisA, така и в pBAD/HisA/p15A. Относителните единици на масата (RMU) са количествата мембранни протеини, изразени спрямо дивия тип, което е произволно зададено на 1,0. RMUs бяха определени чрез анализ на Western блотове, насочени към N-терминален 6 ×His етикет на ромбоид-Rv1337 и сравнение със стандарта за концентрация на протеин.

Ефективност на избрани щамове с Т7 промотор

Интересувахме се да видим дали мутантните ефекти са специфични за арабинозната промоторна система, която използвахме в нашия процес на селекция, или са по-общо ефективни. Например, е установено, че ефектите на С41 и С43 са специфични за Т7 промотора. 7 Следователно ние лизогенизирахме всички щамове с � за въвеждане на Т7 РНК полимераза и тествахме мутантите за ефикасност в Т7 промоторна система. Както е показано на Фигура 5, всички мутанти подобряват експресията на Rv1337 зад Т7 промотора до четири пъти. По този начин, подобрената експресия, наблюдавана в мутантите, не е напълно специфична за всеки един тип промотор, въпреки че EXP-Rv1337-5 изглежда по-ефективен за експресия от арабинозен промотор.

Експресия с T7 промотора. Щамовете бяха тествани за тяхната способност да експресират ромбоид-Rv1337, кондензиран към резистентност към канамицин, използвайки промотора Т7. Т7 полимераза се въвежда в дивия тип щам и всеки от мутантите чрез лизогенизация с λ-DE3. Скратното увеличение на експресията се определя чрез анализ на Western блотове, насочени към N-крайния 6 ×His етикет на всеки мембранен протеин и стандарта за концентрация на протеин.

EXP мутантите доставят протеин до мембраната

Очаквахме, че методът за подбор косвено ще селектира за вмъкване в мембраната, а не върху тела за включване, тъй като партньорът за сливане трябва да бъде сгънат и активен, за да даде лекарствена резистентност. За да преценим дали повишената експресия в мутантите съответства на повишената експресия в мембраната, извършихме диференциално центрофугиране. Неразтворимите, разтворимите и мембранните фракции на всяка проба бяха изолирани и впоследствие анализирани чрез Western blotting. По време на пречистването бяха включени и маркерни протеини за различните фракции: (1) стрептавидин, който се намира в телата за включване, (2) малтозно свързващ протеин (MBP), който остава разтворим, и (3) GlpF, протеин, насочен към мембрана. Резултатите са показани на фигура 6. В дивия тип щам, rhomboid-Rv1337 се експресира почти напълно до мембраната, с малко количество протеин, открит в неразтворимата фракция. Във всички мутантни щамове обаче ромбоид-Rv1337 изглежда се експресира изключително в мембраната без откриваем компонент в неразтворимата фракция. Следователно EXP мутантите водят до вмъкване на протеина в мембраната, а не до шунтиране на протеина в телата на включване и всъщност вмъкването изглежда е подобрено в избраните мутанти.

Анализ на мембранната експресия. Беше проведено фракциониране на див тип и мутантни щамове, експресиращи Rv1337 в pSEL1 и pSEL2. За да се оцени ефективността на фракционирането, културите се размножават преди лизис с клетки, експресиращи мембранен протеин (E. coli GlpF), разтворим протеин (MBP) или протеин, насочен към тела на включване (стрептавидин). Неразтворимите (IB), разтворимите (Sol) и мембранните (MF) фракции на всяка проба бяха анализирани чрез Western blotting, насочени към 6×His етикета на всеки протеин. [Цветната фигура може да се види в онлайн изданието, което е достъпно на www.interscience.wiley.com.]:

Прилагане на избрани мутанти към други мембранни протеинови мишени

Въпреки че избрахме за подобрена експресия на rhomboid-Rv1337, възможно е изолираните щамове да подобрят експресията на други мембранни протеини. За да тестваме тази възможност, ние изразихме други MTb цели и редица ромбовидни конструкции от различни видове в дивия тип и EXP мутантните щамове (Таблица I). С изключение на Rv2835, всички тези мишени изглеждат токсични за клетките въз основа на наблюдението, че клетъчният растеж е драстично намален след индуцирането. Както е показано на Фигура 7, експресията на тези мишени може да бъде подобрена в един или повече от избраните мутанти. EXP-Rv1337-5 е особено ефективен за М. jannaschii ромбовиден, D. melangaster rhomboid и MTb Rv2835, подобрявайки експресията съответно приблизително 10-, 20- и 90 пъти.

Таблица I

Експресия на целите на мембранния протеин е тествана в EXP мутанти

ЦелGI номерОрганизъмПредполагаема функцияМУ (kDa)# TM спирали
Rv133715,608,477М. туберкулозаРомбоиден протеин от семейство25.86
Rv274615,609,883М. туберкулозаPGP синтаза22.14
Rv283515,609,972М. туберкулозаABC транспортьор34.16
Rv011015,607,252М. туберкулозаПротеин от семейството на ромбоидите26.97
MJR15,669,882M. jannashiiРомбоиден протеин от семейство21.36
Ро 124,655,197D. melanogasterРомбоиден протеин от семейство39.37

Увеличаване на експресията на други мембранни протеинови мишени. Различни мембранни протеинови мишени бяха тествани за експресия в EXP мутанти, избрани с помощта на rhomboid-Rv1337. Скратното увеличение на експресията се определя чрез анализ на Western блотове, насочени към N-крайния 6 ×His етикет на всеки мембранен протеин и стандарта за концентрация на протеин. В Mycobacterium tuberculosis (MTb) мишени Rv2746 и Rv2835 бяха изразени като сливания с резистентност към канамицин в pSEL2. Втора ромбоидна протеаза от MTb (Rv0110) се експресира без сливане. Ромбоидни протеази от Metanococcus jannaschii (MJR) и Drosophila melanogaster (Rho 1) се експресират с N-терминално сливане към SUMO. Стандартното отклонение на кратното увеличение на експресията на MTb Rv2835 от щам EXP-Rv1337-5 е 55.

Относителен брой плазмидни копия на мутанти

Ние открихме, че експресията на ромбоиден-Rv1337, слят към избираем маркер, е подобрена, когато се експресира от единичен плазмид, а не от два (не е показано). По този начин, един очевиден начин за увеличаване на експресията би бил да се намали броят на плазмидните копия. Затова ние оценихме броя на копията на EXP мутантите. Както е показано на Фигура 8, всички мутанти имат брой копия на плазмида, сравним с дивия тип TOP10 щам, с изключение на EXP–Rv1337𠄴, който показва драстично намален брой копия. Вероятно намаленият брой копия в EXP –Rv1337 𠄴 забавя експресията до ниво, което клетките могат по -лесно да приспособят, подобно на щамовете C41 и C43 за експресията от T7 промотора. 7, 13

Анализ на номера на плазмидно копие. Щамовете бяха ретрансформирани с pSEL1 и pSEL2 кодиращ ромбоид-Rv1337 и бяха отгледани до фаза на средна регистрация. Пробите бяха нормализирани въз основа на OD600 и бяха пречистени в колона заедно с усвоен от HindIII pUC19 плазмид като вътрешен контрол за пречистване. След това пробите се анализират върху агарозен гел.


Въвеждане на рекомбинантна ДНК в клетката гостоприемник

Рекомбинантният вектор, носещ чужда ДНК, трябва да бъде прехвърлен в подходящата клетка гостоприемник. Това са няколко метода за въвеждане на рекомбинантни вектори и те зависят от няколко фактора, като типа на вектора и клетката гостоприемник.

Някои често използвани процедури са както следва:

ТРАНСФОРМАЦИЯ:

В rDNA технологията най-често срещаният метод за въвеждане на rDNA в жива клетка се нарича трансформация.

В природата обаче честотата на трансформация на много клетки (например клетки на дрожди и бозайници) е много по-малка. Второ, през цялото време клетките гостоприемници не претърпяват трансформация, тъй като не са подготвени за това.

Когато развият фактори на компетентност в клетките, настъпва феномен на трансформация.

Има някои фактори, които влияят на трансформацията, като концентрация на чужда ДНК молекула, клетъчна плътност на гостоприемника, температура и т.н.

При тази процедура бактериалните клетки поемат ДНК от околната среда.

През 1970 г. Мендел и Хюго установяват, че клетките на E.coli стават маркабелно компетентни да поемат външна ДНК, когато се суспендират за кратко в студен калциев хлорид (CaCl2) решение.

ТРАНСФЕКЦИЯ:

Трансфекцията е прехвърляне на чужда ДНК в култивирани клетки гостоприемници, медиирано чрез химикали.

Заредените химични вещества като катионна липозома, калциев фосфат на DEAE декстран се вземат и се смесват с ДНК молекули.

Клетките гостоприемници получатели се наслагват от тази смес.

ЕЛЕКТРОПОРАЦИЯ:

Електрически ток се използва за създаване на преходни микроскопични пори в мембраната на реципиентната клетка гостоприемник, позволявайки да влезе рекомбинантна ДНК.

МИКРОИНЖЕКЦИЯ:

Екзогенната ДНК може също да бъде въведена директно в животински и растителни клетки без използването на еукариотни вектори.

В процедурата на микроинжектиране чуждата ДНК се инжектира директно в клетките реципиенти с помощта на фина микро спринцовка под фазово -контрастен микроскоп за подпомагане на зрението.

Микроскопичните частици от злато или волфрам са покрити с интересуващата ДНК и бомбардирани върху клетки с устройство, подобно на пистолет за частици. Затова се използва терминът биолистика.

Забележка: Друг метод за въвеждане на чужди гени е чрез естествен генен инженер Agrobacterium tumefaciens.


Основите на рекомбинантната ДНК


И така, какво е рДНК?
Това е много добър въпрос! rDNA означава рекомбинантна ДНК. Преди
стигаме до частта & quotr & quot, трябва да разберем ДНК. Тези от вас с
опит в биологията вероятно знае за ДНК, но много от ChemE не са
вижда ДНК от гимназиалната биология. ДНК е пазителят на цялата информация
необходими за пресъздаване на организъм. Цялата ДНК се състои от основа, състояща се от
захар, фосфат и една азотна основа. Има четири азотни основи,
аденин (А), тимин (Т), гуанин (G) и цитозин (С). Азотът
бази се намират по двойки, като A & T и G & C са сдвоени заедно. Последователността

на азотните бази могат да бъдат подредени по безкрайни начини, а структурата им е известна като

известната "двойна спирала", която е показана на изображението по-долу. Захарта, използвана в

ДНК е дезоксирибоза. Четирите азотни основи са еднакви за всички организми. В

последователността и броят на базите е това, което създава разнообразие. ДНК не го прави

всъщност правят организма, той произвежда само протеини. ДНК се транскрибира

в иРНК и тРНК се транслира в протеин и след това протеинът образува

организъм. Чрез промяна на последователността на ДНК, начина, по който протеинът е

образувани промени. This leads to either a different protein, or an inactive protein.

Now that we know what DNA is, this is where the recombinant comes in.
Recombinant DNA is the general name for taking a piece of one DNA, and
and combining it with another strand of DNA. Thus, the name recombinant!
Recombinant DNA is also sometimes referred to as "chimera." By combining two or
more different strands of DNA, scientists are able to create a new strand of DNA.
The most common recombinant process involves combining the DNA of two
different organisms.

How is Recombinant DNA made?
There are three different methods by which Recombinant DNA is made. Те са
Transformation, Phage Introduction, and Non-Bacterial Transformation. Всеки
are described separately below.

Трансформация
The first step in transformation is to select a piece of DNA to be inserted
into a vector. The second step is to cut that piece of DNA with a restriction
enzyme and then ligate the DNA insert into the vector with DNA Ligase. The insert contains a selectable
marker which allows for identification of recombinant molecules. An antibiotic
marker is often used so a host cell without a vector dies when exposed to a certain
antibiotic, and the host with the vector will live because it is resistant.

The vector is inserted into a host cell, in a process called transformation. Едно
example of a possible host cell is E. Coli. The host cells must be specially
prepared to take up the foreign DNA.

Selectable markers can be for antibiotic resistance, color changes, or any other
characteristic which can distinguish transformed hosts from untransformed hosts.
Different vectors have different properties to make them suitable to different
приложения. Some properties can include symmetrical cloning sites, size, and
high copy number.

Non-Bacterial Transformation
This is a process very similar to Transformation, which was described above. В
only difference between the two is non-bacterial does not use bacteria such as E. Coli
for the host.

In microinjection, the DNA is injected directly into the nucleus of the cell being
transformed. In biolistics, the host cells are bombarded with high velocity
microprojectiles, such as particles of gold or tungsten that have been coated
with DNA.

Phage Introduction
Phage introduction is the process of transfection, which is equivalent to transformation,
except a phage is used instead of bacteria. In vitro packagings of a vector is used.
This uses lambda or MI3 phages to produce phage plaques which contain recombinants.
The recombinants that are created can be identified by differences in the
recombinants and non-recombinants using various selection methods.


How does rDNA work?
Recombinant DNA works when the host cell expresses protein from the recombinant genes.

A significant amount of recombinant protein will not be produced by the host unless expression
factors are added. Protein expression depends upon the gene being surrounded by
a collection of signals which provide instructions for the transcription and translation
of the gene by the cell. These signals include the promoter, the ribosome binding
site, and the terminator. Expression vectors, in which the foreign DNA is inserted,
contain these signals. Signals are species specific. In the case of E. Coli, these

signals must be E. Coli signals as E. Coli is unlikely to understand the signals of

human promoters and terminators.

Problems are encountered if the gene contains introns or contains signals which act
as terminators to a bacterial host. This results in premature termination, and the recombinant
protein may not be processed correctly, be folded correctly, or may even be degraded.

Production of recombinant proteins in eukaryotic systems generally takes place in
yeast and filamentous fungi. The use of animal cells is difficult due to the fact
that many need a solid support surface, unlike bacteria, and have complex growth
нужди. However, some proteins are too complex to be produced in bacterium,

so eukaryotic cells must be used.


Why is rDNA important?
Recombinant DNA has been gaining in importance over the last few years, and
recombinant DNA will only become more important in the 21st century as genetic

diseases become more prevelant and agricultural area is reduced. Below are

some of the areas where Recombinant DNA will have an impact.

  • Better Crops (drought & heat resistance)
  • Recombinant Vaccines (ie. Hepatitis B)
  • Prevention and cure of sickle cell anemia
  • Prevention and cure of cystic fibrosis
  • Production of clotting factors
  • Production of insulin
  • Production of recombinant pharmaceuticals
  • Plants that produce their own insecticides
  • Germ line and somatic gene therapy


What does the future hold?
Now that we've figured out the basics behind what Recombinant DNA are, it's
time to look at how Recombinant DNA will impact the future. Which industries
and fields will be shaped by rDNA? How will rDNA effect the health and
lifestyles of RPI students in the next generation? Click over to our
rDNA Impact Statement to find out the answer!

Pop Quiz Time!
To help you determine how well you know Recombinant DNA, we
have generously decided to provide you with a basic quiz that even a
senior ChemE should be able to do. Be sure and look over the additional
information provided below, because these questions could be tricky! всичко
the information needed to answer the questions can be found on this page,
or the associated pages. When you're ready, click below.

Additional Information
The information presented above is only an introduction to the wonders of
Recombinant DNA. In order to fulfill your desire for knowledge, Matt and
Beth have scoured the web for the best websites with in-depth knowledge
concerning rDNA. You will find the links below and a brief
description of what the page describes. Наслади се!

Recognition Sequences for frequently used restriction endonucleases.

Information about human proteins that have been synthesized from eukaryotic and bacteria genes.

Information about gene addition projects that have been done with plants.

Information about gene subtraction projects that have been done with plants.

Basic information about what DNA is

А SHOCKWAVE application illustrating DNA replication

A video that illustrates protein synthesis

Information about how gene splicing differs from conventional agriculture

Information about the merits of agricultural gene splicing

Information about treating genetic diseases in the womb

A Question and Answer about gene therapy

The Recombinant DNA chapter of an online textbook

A Recombinant DNA problem set and tutorial

The NIH Guidelines for research involving Recombinant DNA

An online textbook covering the protocols for Recombinant DNA

A clearinghouse of links concerning Clinical Trials

Information about gene therapy for human patients

Recombinant DNA and the synthesis of human insulin

A repository of information concerning Medical Biotechnology

Created by Matthew Kuure-Kinsey and Beth McCooey for Biochemical Engineering Fall 2000


TOOLS OF RECOMBINANT DNA TECHNOLOGY

Following are the key tools of recombinant DNA technology:
Restriction enzymes, polymerase enzymes, ligases, vectors, and the host organism

Restriction Enzymes

The enzymes which cut the DNA are called restriction enzymes. Hind II was the first restriction endonuclease to be discovered. Hind II always cuts DNA molecules at a particular point by recognizing a specific sequence of six base pairs. This specific base sequence is called the recognition sequence for Hind II. Today, more than 900 restriction enzymes are known. Different enzymes recognize different sequences.

Exonuclease: These enzymes remove nucleotides from the ends of the DNA.

Endonuclease: These enzymes make cuts at specific positions within the DNA.

Nomenclature of Restriction Enzymes: Each enzyme is named after the bacterium from which it was isolated. The naming system is based on bacterial genus, species and strain. Following table shows the name of EcoRI restriction enzyme and the implied naming system.

Derivation of EcoRI name
СъкращениеСмисълОписание
EЕшерихияРод
coколивидове
РRY 13Strain
АзFirst identifiedOrder of identification

Palindromes: A group of letters that form the same word when read both forward and backward is called a palindrome. Restriction enzyme cut at the palindrome sequence in a DNA. Following is an example of palindrome sequence:

5' —— GAATTC —— 3'
3' —— CTTAAG —— 5'

Restriction enzymes cut the strand of DNA a little away from the centre of the palindrome sites, but between the same two bases on the opposite strands. This leaves single stranded portions at the ends. There are overhanging stretches called sticky ends on each strand. These are named so because they form hydrogen bonds with their complementary cut counterparts. This stickiness of the ends facilitates the action of the enzyme DNA ligase.

When cut by the same restriction enzyme, the resultant DNA fragments have the same kind of ‘sticky-ends’ and, these can be joined together (end-to-end) using DNA ligases.

Unless, the vector and the source DNA are cut with the same restriction enzyme, the recombinant vector molecule cannot be created.

Separation and isolation of DNA fragments: The cutting of DNA by restriction endonucleases results in the fragmentes of DNA. These fragments can be separated by a technique known as gel electrophoresis. Since DNA fragments are negatively charged molecules they can be separated by forcing them to move towards the anode under an electric field through a medium/matrix.

Agarose is the most commonly used matrix. It is a natural polymer which is extracted from sea weeds.

The DNA fragments separate according to their size through sieving effect provided by agarose gel. So, smaller fragments move farther than longer fragments.

The separated DNA fragments are stained with ethidium bromide. After that, exposure to UV radiation makes them visible. The DNA fragments appear as bright orange bands in this case.

The separated bands of DNA are cut out from agarose gel and extracted constructing recombinant DNA by joining them with cloning vectors.

Cloning Vectors

A small piece of DNA taken from a virus, a plasmid or the cell of a higher organism, that can be stably maintained in an organism, and into which a foreign DNA fragment can be inserted for cloning purposes is called a cloning vector.

The following are the features that are required to facilitate cloning into a vector.

  1. Origin of replication (ori): The sequence from where replication starts in the DNA is called the Origin of Replication (ori). When a piece of DNA is linked to this sequence, it can be made to replicate within the host cell. If you want to recover many copies of the target DNA, it should be cloned in a vector whose ‘ori’ supports high copy number.
  2. Selectable marker: These are the substances which help in identifying and eliminating non-transformants and selectively permitting the growth of the transformants. Generally, the genes which encode resistance to antibiotics (ampicillin, chloramphenicol, tetracycline, kanamycin, etc.) are considered useful selectable markers for E. coli. Нормалното E. coli cells do not carry resistance against any of these antibiotics.
  3. Cloning sites: All cloning vectors have recognition sites for the commonly used restriction enzymes. But to link the alien DNA, the vector needs to have very few, preferably single, recognition site. Ligation of alien DNA is carried out at a restriction site present in one of the two antibiotic resistance genes.

Пример: A foreign DNA can be ligated at the Bam H I site of tetracycline resistance gene in the vector pBR322. The recombinant plasmids will lose tetracycline resistance due to insertion of foreign DNA but they can still be selected out from non-recombinant ones by plating the tranformants on ampicillin containing medium.

After that, the transformants (growing on ampicillin containing medium) are transferred on a medium which contains tetracycline.

The recombinant will grow in ampicillin containing medium but not in tetracycline containing medium.

But non-recombinants will grow in medium containing both the antibiotics. In this case, one antibiotic resistance gene helps in selecting the transformants, while other antibiotic resistance gene gets inactivated due to insertion of alien DNA. Thus, it helps in selection of recombinants.

Забележка: Selection of recombinants due to inactivation of antibiotics requires simultaneous plating on two plates having different antibiotics. Hence, it is a cumbersome process.

Alternate selectable markers have been developed which can differentiate recombinants from non-recombinants on the basis of their ability to produce color in the presence of chromogenic substrate.

In this case, a recombinant DNA is inserted within the coding sequence of an enzyme, α-galactosidase. This results into inactivation of the enzyme. (It is called insertional inactivation).

The presence of chromogenic substrate gives blue-colored colonies if plasmid in bacteria does not have an insert.

Presence of insert results into insertional inactivation of α-galactosidase, and no color is produced by the colonies. Such colonies are identified as recombinant colonies.

Vectors for cloning genes in plants and animals: Bacteria and viruses have been transferring their genes to transform eukaryotic cells in order to force them to do what the bacteria or viruses want. Now, these tools of pathogens can be transformed into useful vectors for delivering beneficial genes to humans. For example the tumor inducing (Ti) plasmid of Agrobacterium tumifaciens has now been modified into a cloning vector which is no more pathogenic to the plants. This vector can now be utilized to transfer beneficial genes into many plants.

Competent Host (For Transformation with Recombinant DNA)

We know that DNA is a hydrophilic molecule. Hence, it cannot pass through cell membranes. In order to force bacteria to take up the plasmid, the bacterial cell needs to be ‘competent’’ to take up DNA. This is done by treating the bacterial cells with a specific concentration of a divalent cation, e.g. calcium. It increases the efficiency with which DNA enters the bacterium through pores in its cell wall.

Recombinant DNA can then be forced into such cells in following steps:

  • Cells along with recombinant DNA are incubated on ice.
  • They are then briefly placed at 42°C (heat shock).
  • Then they are put back on ice.

Micro-injection: In this method, recombinant DNA is directly injected into the nucleus of an animal cell.

Gene Gun: This method is applied for plant cells. In this method, cells are bombarded with high velocity micro-particles of gold or tungsten coated with DNA.

Disarmed Pathogen: When the disarmed pathogen infects the cell, it transfers the recombinant DNA into host.


Yeast protein expression systems – Saccharomyces cerevisiae

The highly developed genetic system, ease of use, reduced time input and costs have made S. cerevisiae an attractive organism for the expression and production of recombinant proteins. Yeasts are able to carry specifically designed plasmids and this ability is valuable in a recombinant protein expression system. The plasmid used consists of restriction sites that can be used to insert the gene sequence of interest. Transformation of yeasts with the plasmid produces the desired protein and can be appropriately scaled up.

Фигура 3. Yeast protein expression system – Saccharomyces cerevisiae

Expression of protein using S. cerevisiae involves the following steps:

  • use of competent E. coli cells to take up DNA sequence of interest (Catalog Numbers CMC0001, CMC0004, CMC0014)
  • integration of the DNA into bacterial genome or circularization of the DNA sequence to exist as a plasmid
  • selection of transformed E. coli using a selection marker (antibiotic) (Catalog Numbers L5667, L0168, L0543, L0418, L8795)
  • expansion of selected E. coli in appropriate culture media, such as classic LB options (product numbers L2542, L3522, L3147) or EnPresso™ Y Defined Media (product number Y22001)
  • isolation of DNA or plasmid
  • transformation into yeast (yeast transformation kit, Catalog Number YEAST1)
  • screen the transformants for integration of DNA into yeast chromosome
  • selection and scaling-up of high expressing yeast clones in appropriate culture media (Catalog Numbers Y1375, Y1501, Y1751, Y2001, Y1376, Y0750)
  • isolation and purification of intracellular/secreted proteins

Характеристика

  • low cost culture methods
  • suitable for both intracellular and secreted proteins
  • provides eukaryotic post-translational glycosylation of proteins although it results in high

Community Surveys

William L. Thompson , . Charles Gowan , in Monitoring Vertebrate Populations , 1998

Plot Selection Method

The random selection method used for choosing which plots to survey could have a significant impact on the chance of encountering a given species. One could stratify an area by species’ habitat affiliations ( Fig. 4.3 ). However, this would require prior life history information, or at least historical records of occurrence, for the species in question. Species would have to be grouped by habitat preference with different sampling frames constructed by group. This would obviously remove the possibility of collecting distributional data in a single survey.

Figure 4.3 . Two strata, separated by a thick line, hypothetically based on a habitat affiliation for a given species. The probability of selecting a plot containing an individual of a given species is much greater in the smaller stratum (preferred habitat) than for the larger stratum.

The advantage of using stratified random sampling to increase the chance of selecting a plot that contains a member of a target species is shown in ( Fig. 4.3 .) We use the simplest case of a single species to demonstrate this advantage, but the same principle applies for groups of species as well. Note that there are 50 empty plots out of 100 in the sampling frame so that without stratification the chance of picking an occupied plot would be, on average, 1 in 2 or 50%. However, stratifying by habitat yields one stratum in which 20 of 25 (80%) of the plots contain at least one individual and another stratum that has only 30 of 75 (40%) plots that are occupied. Sampling effort then can be concentrated in the small stratum to increase the probability of selecting occupied units.

Stratification of the sampling frame by some attribute associated with spatial clustering of species may be effective when applied to a single species, but probably cannot be implemented for more than several related species. That is, the greater the number of target species, the greater the possible number of different cluster patterns. One species may be clustered in riparian habitat whereas another may be aggregated in grasslands. There is simply no way to have one optimum and worthwhile stratification design that can account for the many different patterns of distribution the aggregation of a species is a species trait, and cannot be accommodated for all the different species with a single stratification design or plot size. Thus, one ends up with a suboptimal allocation of effort for all species. That is, the reasonable approach under these circumstances is to select a simple random sample of the entire sampling frame, which means there is no stratification and no optimum allocation of sampling effort.


Заключения

The D4R dominant host range selection represents a quick and stringent method to generate recombinant MVA viruses. The method represents an alternative to current selection techniques that rely on additional marker genes, chemical agents, and multiple rounds of plaque purification. In contrast to traditional homologous recombination protocols and to the recently described BAC cloning procedure, the less laborious D4R-dominant host range selection approach by principle does not require foreign marker genes, resulting in MVA recombinants that are free from marker gene sequences and that thus meet the state-of-the-art requirements for use as live vaccines.