Информация

Студената адаптация в протеините, на последователно и структурно ниво

Студената адаптация в протеините, на последователно и структурно ниво


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Когато се търси адаптация към студ при едноклетъчни еукариоти, не е намерена много работа. През повечето време сравнителният анализ на последователността между морски мезофил и психрофил също не дава ясни резултати. Ако планирам да уча на структурно ниво (моделиране на хомология), ще получа ли отговори? Какъв тип параметри мога да търся за изследване? Кои протеини се очаква да осигурят адаптация към студа освен протеините, свързващи лед или антифриз, тъй като IBP и AFP не могат да бъдат намерени чрез сравнение на последователности. Възможно ли е да се дадат някои идеи по този въпрос?

Благодаря


Има изследователски групи, работещи по този точен въпрос; разбиране на студената адаптация в ензимите. Можете да прочетете за това в няколко статии като „Изчисляване на ензимна студена адаптация“ или „Молекулярна структурна основа за адаптирането към студа на психофилната β-глюкозидаза BglU в Micrococcus antarcticus“ или „Специфични аминокиселини, отговорни за адаптацията към студа на Micrococcus antarcticus β-глюкозидаза BglU'

Като цяло има няколко структурни характеристики, които обикновено се срещат. Обикновено те са много по-гъвкави (т.е. по-малко солни мостове и други подобни стабилизиращи връзки). Гъвкавостта идва от по -малко силна връзка между полипептидната верига и вътре в нея, и дори съдържа нередени области. Гъвкавостта също означава, че те обикновено са далеч по -малко стабилни и по -трудни за работа. Те са индустриално интересни, тъй като разработването на ензими, които могат да работят при ниски температури, може да намали цената на протичащите реакции. Това е по същество стъпка към по-екологична индустрия. Съществуват и спекулации за различни съотношения и изобилие от видовете аминокиселини и къде се намират. Ще трябва да прочетете статии за специфични протеини, за да проучите това.

От практическа гледна точка, студено адаптирани ензими обикновено се изолират от арктически микроорганизми и се характеризират в лабораторията - за да се определи тяхната температурна толерантност. След това структурата на такива ензими се решава (след много работа) и формира основата за разбиране на студената адаптация.

За да отговоря на въпроса по -конкретно, не, не е реалистично да се знае дали нещо е студено адаптирано директно, като се погледне протеиновата последователност (самостоятелно), това трябва да се определи експериментално в лабораторията. Въпреки това, ако протеинът е от студено адаптиран организъм (обикновено арктически бактерии), има основания да се предположи, че е адаптиран към студ, преди да го тествате в лабораторията. Можете също така да приложите биоинформатика на som (например бластно търсене), за да определите дали тя е свързана със студено адаптирани протеини. Освен това, ако този специфичен вид протеин, който разглеждате, е добре проучен, можете също да опитате да направите хомологични модели и да видите дали структурно е подобен на студено адаптирани роднини или дали е по-структурно подобен на неговите мезофилни или дори термофилни колеги. Това обаче е много спекулативно и не бих наложил прекалено голяма тежест на теоретично приетите адаптации - най -малкото трябва да знаете, че интересуващият протеин е от студено адаптирани организми, дори да започнете да разглеждате (изчислително) защо и как би могъл да бъдат адаптирани към студа.


Молекулярна характеристика на студената адаптация въз основа на ортологични протеинови последователности от Vibrionaceae видове

Набор от 298 протеинови семейства от психрофилни Vibrio salmonicida е съставен за идентифициране на генотипни характеристики, които го различават от ортологични последователности от мезофилния клон Vibrio/Photobacterium на гама-протеобактерията (Vibrionaceae семейство). В нашето сравнително изследване използвахме биоинформатични и статистически методи, базирани на подравняване. Интересна информация беше намерена в заместващите матрици и модела на асиметрии в процеса на заместване на аминокиселините. Заедно с разликата в състава, те идентифицираха аминокиселините Ile, Asn, Ala и Gln като тези, които имат най -голямо психофилно участие. Ile и Asn са засилени, докато Gln и Ala са потиснати. Негъвкавият Pro остатък също се потиска в областите на цикъла, както се очаква в гъвкава структура. Наборът от данни също беше класифициран и анализиран според прогнозираното субклетъчно местоположение и направихме допълнително проучване на 183 вътреклетъчни и 65 мембранни протеина. Нашите резултати разкриха, че психрофилните протеини имат сходни хидрофобни и зарядни приноси в ядрото на протеина като мезофилните протеини, докато повърхността, изложена на разтворител, е значително по-хидрофобна. Освен това психрофилните вътреклетъчни (но не и мембранни) протеини са значително по-отрицателно заредени на повърхността. Нашият анализ подкрепя хипотезата за предпочитание на по-гъвкави аминокиселини на молекулярната повърхност. Животът в студен климат изглежда се получава чрез много малки структурни модификации, а не чрез някои аминокиселинни замествания.

Това е визуализация на абонаментно съдържание, достъп чрез вашата институция.


Заден план

Микроорганизмите, които живеят при забраняващи условия, се наричат ​​екстремофили, чието откритие посочва уникалната адаптивност на примитивните форми на живот. Тези микроорганизми са групирани според техните оптимални условия на растеж, в които съществуват, като ацидофили (проявяващи оптимален растеж при киселинни рН условия), алкалифили (процъфтяващи при алкални рН условия), барофили (оцеляващи при голям натиск), ендолити (живеещи дълбоко вътре скали), халофили (процъфтяващи при високи концентрации на сол), психрофили (оптимална температура под 20 ° C) и термофили (оптимална температура между 45–80 ° C), хипертермофили (оптимална температура над 80 ° C) [1]. Най-голямото покритие на известните екстремофилни условия на земната биосфера е под 10°C. Например, три четвърти от земята е покрита с океани, които поддържат средна температура от един до три градуса по Целзий. Освен това обширните сухоземни зони на Арктика и Антарктика са постоянно замразени през цялата година [1]. Други няколко примера за крио местообитания включват студени пустини, високи алпийски почви, морски лед, студени пещери, морски седименти, вечно замръзнали почви, ледници, сняг и др.

По -голямата част от известните психрофили принадлежат към сортове археи и бактерии и няколко вида дрожди, гъби и водорасли [2]. Способността да се развива при животозастрашаващи ефекти от ниски температури, близо до точката на замръзване на водата, изисква огромен набор от адаптации от всичките им клетъчни компоненти, включително техните мембрани, системи за генериране на енергия, машини за синтез на протеини, биоразградими ензими и компонентите отговорен за усвояването на хранителни вещества и др., за поддържане на метаболизма, поддържане на растежа и възпроизводството, съвместими с живота при тези ниски температурни условия [3, 4]. Развивайки се със специални механизми, психрофилите успешно колонизират тези ниши [2, 5]. Психрофилните протеини показват последователности и структури, сравними с тези на техните мезо и (хипер) термофилни хомолози, особено ензими със способността им да работят ефективно като катализатори при ниски температури [6]. Термолабилността на тези протеини при умерени температури гарантира огромни индустриални приложения в биотехнологиите, биоремедиацията, храните, текстила, биокатализата на детергенти при условия на ниска вода и детергенти и др. [5–9].

Поради горните факти, исторически, започвайки от средата на 70-те години, много внимание се обръща главно на последователността и структурните атрибути, допринасящи за адаптацията на протеините (главно ензимите) към условия на висока температура. Много изследователи сравняват параметрите, основани на последователността и структурата, между термофилни и мезофилни протеини [10]. С появата на пионерски усилия в края на 90-те години в решаването на триизмерни структури на криофилни ензими като алфа-амилаза [11] алкална протеаза [12] триоза фосфат изомераза [13] малат дехидрогеназа [14] от антарктически микроорганизми и поради няколко налични структури в банката с данни за протеини (PDB), групите се фокусират върху структурната основа на протеините при студена адаптация [4, 15–20].

Постоянното увеличаване на последователността на протеомите на екстремофилите отвори много нови пътища за разбиране на адаптациите към екстремни условия [16, 21–25]. Сега е възможно цялостно сравнение на глобалните предпочитания на аминокиселини и моделите на заместване, изведени от протеоми на различни организми [26–28]. Използвайки хомоложни последователности, групирани заедно с различни статистически методи, ние проведохме обширен анализ на протеомите на психрофилни, мезофилни, термофилни и хипертермофилни микроорганизми, за да изследваме възможна корелация на аминокиселинните модели на заместване с адаптиране към съответните им оптимални условия на растеж. В този ръкопис обсъждаме резултатите от сравнителен анализ на напълно секвенирани протеоми от шест члена от всеки от психрофилните и мезофилните организми.


Препратки

van den Burg, B. Екстремофилите като източник на нови ензими. Curr. Мнение. Микробиол. 6, 213–218 (2003).

Gomes, J. & amp Steiner, W. Биокаталитичният потенциал на екстремофили и екстремозими. Хранителен Технол. Биотехнол. 42, 223–235 (2004).

Hough, D. W. & amp Danson, M. J. Extremozymes. Curr. Мнение. Chem. биол. 3, 39–46 (1999).

Danson, M. J. & amp Hough, D. W. Структурната основа на халофилността на протеините. Комп. Биохимия. Physiol. А 117, 307–312 (1997).

Madern, D., Ebel, C. & amp Zaccai, G. Халофилна адаптация на ензимите. Екстремофили 4, 91–98 (2000).

Gros, M. & amp Jaenicke, R. Протеини под налягане. Евро. J. Biochem. 221, 617–630 (1994).

Daniel, I., Oger, P. & amp Winter, R. Произход на живота и биохимията при условия на високо налягане. Chem. Soc. Rev. 35, 858–875 (2006).

Lauro, F. M., Chastain, R. A., Blankenship, L. E., Yayanos, A. A. & amp Bartlett, D. H. Уникалните гени на 16S рРНК на пиезофили отразяват както филогенезата, така и адаптацията. Appl. Околна среда. Микробиол. 73, 838–845 (2007).

Стетер, К. О. Екстремофили и тяхната адаптация към гореща среда. FEBS Lett. 452, 22–25 (1999).

Hurst, L. D. & amp Merchant, A. R. Високото съдържание на гуанин -цитозин не е адаптация към висока температура: сравнителен анализ сред прокариотите. Proc. R. Soc. Лондон. Б 268, 493–497 (2000).

Nakashima, H., Fukuchi, S. & amp Nishikawa, K. Композиционни промени в РНК, ДНК и протеини за бактериална адаптация към по-високи и по-ниски температури. J. Biochem. 133, 507–513 (2003).

Khachane, A.N., Timmis, K.N. & Martins dos Santos, V.A.P. Съдържанието на урацил в 16S rRNA на термофилни и психрофилни прокариоти корелира обратно с техните оптимални температури на растеж. Nucl. Acids Res. 33, 4016–4022 (2005).

Feller, G. & Gerday, C. Психрофилни ензими: горещи теми в студената адаптация. Нац. Rev. Microbiol. 1, 200–208 (2003).

D’Amico, S., Marx, J. C., Gerday, C. & amp Feller, G. Връзки активност -стабилност в екстремофилни ензими. J. Biol. Chem. 278, 7891–7896 (2003).

Диас, C.L. и др. Хидрофобният ефект и неговата роля в студената денатурация. Криобиология 60, 91–99 (2010).

Sicheri, F. & amp Yang, D. S. C. Лед-свързваща структура и механизъм на антифриз протеин от зимна писия. Природата 375, 427–431 (1995).

Yeh, Y. & Feeney, R.E. Антифриз протеини: структури и механизми на функция. Chem. Rev. 96, 601–617 (1996).

Jaenicke, R. & amp Böhm, G. Стабилността на протеините в екстремни среди. Curr. Мнение. Структура. биол. 8, 738–748 (1998).

Kumar, S. & Nussinov, R. Как термофилните протеини се справят с топлината? клетка. Mol. Life Sci. 58, 1216–1233 (2001).

Vieille, C. & amp Zeikus, G. J. Хипертермофилни ензими: източници, приложения и молекулярни механизми за термостабилност. Микробиол. Mol. биол. Rev. 65, 1–43 (2001).

Berezovsky, I. N. & amp Shakhnovich, E. I. Физика и еволюция на термофилната адаптация. Proc. Natl Акад. Sci. САЩ 102, 12742–12747 (2005).

Lazaridis, T., Lee, I. & Karplus, M. Динамика и разгръщащи се пътища на хипертермофилен и мезофилен рубредоксин. Protein Sci. 6, 2589–2605 (1997).

Kovacic, F., Mandrysch, A., Poojari, C., Strodel, B. & Jaeger, K.E. Структурни характеристики, определящи термичната адаптация на естеразите. Протеин инж. Дес. Sel. 29, 65–76 (2016).

Dominy, B. N., Minoux, H. & amp Brooks, C. L. III. Електростатична основа за стабилността на термофилните протеини. Протеини 57, 128–141 (2004).

Мисимър, Дж. Х. и др. Конфигурационната ентропия изяснява ролята на мрежите от солеви мостове в термостабилността на протеина. Protein Sci. 16, 1349–1359 (2007).

Roca, M., Liu, H., Messer, B. & amp Warshel, A. За връзката между термичната стабилност и каталитичната сила на ензимите. Биохимия 46, 15067–15088 (2007).

Bjelic, S., Brandsdal, B. O. & amp Åqvist, J. Студена адаптация на скоростта на ензимните реакции. Биохимия 47, 10049–10057 (2008).

Isaksen, G. V., Åqvist, J. & amp Brandsdal, B. O. Мекотата на повърхността на протеина е произходът на ензимната адаптация на трипсина към студа. PLoS компютър. биол. 8, e1003813 (2014).

Isaksen, G.V., Åqvist, J. & Brandsdal, B.O. Ензимната повърхностна твърдост настройва температурната зависимост на каталитичните скорости. Proc. Natl Акад. Sci. САЩ 113, 7822–7827 (2016).

Åqvist, J., Wennerström, P., Nervall, M., Bjelic, S. & Brandsdal, B.O. Симулации на молекулярна динамика на вода и биомолекули с алгоритъм за постоянно налягане на Монте Карло. Chem. Phys. Lett. 384, 288–294 (2004).

Kitchen, D. B., Reed, L. H. & amp Levy, R. M. Молекулна динамична симулация на солватиран протеин при високо налягане. Биохимия 31, 10083–10093 (1992).

Paci, E. Симулации на високо налягане на биомолекули. Биохим. Биофиз. Acta 1595, 185–200 (2002).

Low, P. S., Bada, J. L. & amp Somero, G. N. Температурна адаптация на ензимите: роли на свободната енергия, енталпията и ентропията на активирането. Proc. Natl Акад. Sci. САЩ 70, 430–432 (1973).

Lonhienne, T., Gerday, C. & amp Feller, G. Психрофилни ензими: преразглеждането на термодинамичните параметри на активиране може да обясни локалната гъвкавост. Биохим. Биофиз. Acta 1543, 1–10 (2000).

Siddiqui, K. S. & amp Cavicchioli, R. Студено адаптирани ензими. Анну. Rev. Biochem. 75, 403–433 (2006).

Fields, P. A. & amp Somero, G. N. Горещи точки при адаптация към студ: локализирано повишаване на конформационната гъвкавост в ортолозите на лактат дехидрогеназа А4 на антарктическите нототеноидни риби. Proc. Natl Акад. Sci. САЩ 95, 11476–11481 (1998).

Altermark, B., Niiranen, L., Willasen, N. P., Smalås, A. O. & amp Moe, E. Сравнителни изследвания на ендонуклеаза I от студено адаптирани Vibrio salmonicida и мезофилни Вибрион холера. FEBS Дж. 274, 252–263 (2007).

Liang, Z. X., Tsigos, I., Bouriotis, V. & amp Klinman, J. P. Влияние на гъвкавостта на протеините върху параметрите на трансфер на хидрид в термофилни и психрофилни алкохолни дехидрогенази. J. Am. Chem. Soc. 126, 9500–9501 (2004).

Daniel, R. M. & amp Danson, M. J. Ново разбиране за това как температурата влияе върху каталитичната активност на ензимите. Trends Biochem. Sci. 35, 584–591 (2010).

Хобс, Дж. К. и др. Промяната в топлинния капацитет за ензимна катализа определя температурната зависимост на ензимно катализираните скорости. ACS Chem. биол. 8, 2388–2393 (2008).

Arcus, V. L. Prentice, E. J. и др. В зависимост от температурата на ензимно-катализирани скорости. Биохимия 55, 1681–1688 (2016).

Нгуен, В. и др. Еволюционни двигатели на термоадаптацията при ензимна катализа. Наука 355, 289–294 (2017).

Elias, M., Wieczorek, G., Rosenne, S. & Tawfik, D. S. Универсалността на ензимната зависимост скорост-температура. Trends Biochem. Sci. 39, 1–7 (2014).

Петреску, И. и др. Ксиланаза от психрофилните дрожди Cryptococcus adeliae. Екстремофили 4, 137–144 (2000).

Smalås, A. O., Heimstad, E. S., Hordvik, A., Willasen, W. P. & amp Male, R. Студена адаптация на ензимите: структурно сравнение между сьомга и говежди трипсини. Протеини 20, 149–166 (1994).

Olufsen, M., Smalås, A. O., Moe, E. & amp Brandsdal, B. Повишена гъвкавост като стратегия за студена адаптация. J. Biol. Chem. 280, 18042–18048 (2005).

Papaleo, E., Riccardi, L., Villa, C., Fantucci, P. & amp De Gioia, L. Гъвкавост и ензимна адаптация към студ: сравнително изследване на молекулярната динамика на семейството на еластазите. Биохим. Биофиз. Acta 1764, 1397–1406 (2006).

Папалео, Е. и др. Протеинова гъвкавост в психрофилни и мезофилни трипсини. Доказателства за еволюционно запазване на протеиновата динамика в трипсин-подобни серин-протеази. FEBS Lett. 582, 1008–1018 (2008).

Åqvist, J., Kazemi, M., Isaksen, G.V. & Brandsdal, B.O. Ентропия и ензимна катализа. Съгласно Chem. Res. 50, 199–207 (2017).

Kazemi, M. & Åqvist, J. Механизми на химична реакция в разтвор от груба сила изчислителни графики на Арениус. Нац. Комуникация. 6, 7293 (2015).

Kazemi, M., Himo, F. & amp Åqvist, J. Ензимна катализа чрез ентропия без ефект на Circe. Proc. Natl Акад. Sci. САЩ 113, 2406–2411 (2016).

Åqvist, J. & Kamerlin, S.C.L. Изключително големият принос на ентропия позволява високите скорости на хидролиза на GTP върху рибозомата. Sci. Rep. 5, 15817 (2015).

Åqvist, J. & amp Kamerlin, S. C. L. Запазените мотиви в различни класове GTPases диктуват техните специфични начини на катализа. ACS Catal. 6, 1737–1743 (2016).

Уоршел, А. Компютърно моделиране на химични реакции в ензими и разтвори (Уайли, 1991).

Åqvist, J. & Warshel, A. Симулация на ензимни реакции, използвайки силови полета на валентна връзка и други хибридни квантово/класически подходи. Chem. Rev. 93, 2523–2544 (1993).

Snider, MJ, Gaunitz, S., Ridgway, C., Short, SA & amp Wolfenden, R. Температурните ефекти върху каталитичната ефективност, повишаването на скоростта и афинитета на цитидин дезаминазата в преходното състояние и термодинамичните последици за катализа на отстраняване на субстрат „котва“. Биохимия 39, 9746–9753 (2000).

Outzen, H., Berglund, G. I., Smalås, A. O. & amp Willasen, N. P. Температура и рН чувствителност на трипсини от атлантическа сьомга (Салмо салар) в сравнение с говежди и свински трипсин. Комп. Биохимия. Physiol. Б 115, 33–45 (1996).

Ghanem, M., Li, L., Wing, C. & Schramm, V.L. Променена термодинамика от отдалечени мутации, променящи човешки към говежди пурин нуклеозид фосфорилаза. Биохимия 47, 2559–2564 (2008).

Isaksen, G. V., Åqvist, J. & amp Brandsdal, B. O. Термодинамика на пуриновата нуклеозидна фосфорилазна реакция, разкрита чрез компютърни симулации. Биохимия 56, 306–312 (2017).

Leiros, H.K.S., McSweeney, S.M. & Smalås, A.O. Структурите на атомната разделителна способност на трипсина дават представа за структурните радиационни увреждания. Acta Crystallogr. д 57, 488–497 (2001).

Liebschner, D., Dauter, M., Brzuszkiewicz, A. & Dauter, Z. Относно възпроизводимостта на протеиновите кристални структури: пет атомни разделителни структури на трипсин. Acta Crystallogr. д 69, 1447–1462 (2013).

Bellissent-Funel, M.C. и др. Водата определя структурата и динамиката на протеините. Chem. Rev. 116, 7673–7697 (2016).

Pucci, F. & amp Rooman, M. Физически и молекулярни основи на протеиновата термична стабилност и адаптация към студ. Curr. Мнение. Структура. биол. 42, 117–128 (2017).

Rodriguez-Correa, D. & amp Dahlberg, A. E. Кинетични и термодинамични изследвания на пептидилтрансфераза в рибозоми от крайния термофил Thermus thermophilus. РНК 14, 2314–2318 (2008).

Siddiqui, K. S., Cavicchioli, R. & amp Thomas, T. Параметри на термодинамичното активиране на протеините на удължаващия фактор 2 (EF-2) от психротолерантни и термофилни археи. Екстремофили 6, 143–150 (2002).

Мерлино, А. и др. Структура и гъвкавост в студено адаптирани железни супероксиддисмутази: случаят на ензима, изолиран от Pseudoalteromonas haloplanktis. J. Struct. биол. 172, 343–352 (2010).

Struvay, C. & amp Feller, G. Оптимизиране на активност при ниска температура в психрофилни ензими. Int. J. Mol. Sci. 13, 11643–11665 (2012).

Harms, M. J. & amp Thornton, J. W. Еволюционна биохимия: разкриване на историческите и физическите причини за протеиновите свойства. Нац. Преподобни Genet. 14, 559–571 (2013).

Shoichet, B. K., Baase, W. A., Kuroki, R. & amp Matthews, B. W. Връзка между стабилността на протеина и протеиновата функция. Proc. Natl Акад. Sci. САЩ 92, 452–456 (1995).

Dang, L. X., Merz Jr, K. M. & amp Kollman, P. A. Изчисления на свободната енергия за стабилността на протеина: Thr-157 → Val-157 мутация на Т4 лизозим. J. Am. Chem. Soc. 111, 8505–8508 (1989).

Pan, Y. P. & amp Daggett, V. Директно сравнение на експериментални и изчислени свободни енергии на сгъване за хидрофобни делеционни мутанти на химотрипсинов инхибитор 2. Биохимия 40, 2723–2731 (2001).

Seeliger, D. & amp de Groot, B. L. Изчисления на термостабилността на протеини, използвайки алхимични симулации на свободна енергия. Биофиз. Дж. 98, 2309–2316 (2011).

Folch, B., Dehouck, Y. & amp Rooman, M. Термо- и мезостабилизиращи протеинови взаимодействия, идентифицирани чрез зависими от температурата статистически потенциали. Биофиз. Дж. 98, 667–677 (2010).

Pucci, F., Bourgeas, R. & Rooman, M. Прогнозиране на промените в термичната стабилност на протеина при точкови мутации с помощта на статистически потенциали: въвеждане HoTMuSiC. Sci. Rep. 6, 23257 (2016).

Айринг, Х. Активираният комплекс при химични реакции. J. Chem. Phys. 3, 107–115 (1935).

Evans, M. G. & amp Polanyi, M. Някои приложения на метода на преходното състояние за изчисляване на скоростите на реакцията, особено в разтвор. Транс. Фарадей Соц. 31, 875–893 (1935).

Bjelic, S. & amp Åqvist, J. Катализа и линейни отношения на свободна енергия в аспарагиновите протеази. Биохимия 45, 7709–7723 (2006).

Russell, R. J., Ferguson, J. M., Hough, D. W., Danson, M. J. & amp Taylor, G. L. Кристалната структура на цитрат синтазата от хипертермофилния археон Pyrococcus furiosus с резолюция 1,9 Å. Биохимия 36, 9983–9994 (1997).

Russell, R. J., Gerike, U., Danson, M. J., Hough, D. W. & amp Taylor, G. L. Структурни адаптации на студеноактивната цитратна синтаза от антарктическа бактерия. Структура 6, 351—361 (1998).

Leiros, H.K.S., Willassen, N.P. & Smalås, A.O. Структурно сравнение на психрофилни и мезофилни трипсини: изясняване на молекулярната основа на студовата адаптация. Евро. J. Biochem. 267, 1039–1049 (2000).

Мерегети, П. и др. Конформационен пейзаж в близост до естествено състояние на психрофилни и мезофилни ензими: изследване на модела на сгъваемата фуния. J. Phys. Chem. Б. 114, 7609–7619 (2010).

Olufsen, M., Brandsdal, B.O. & Smalås, A.O. Сравнителни изследвания на психрофилна и мезофилна урацилова ДНК гликозилаза: MD симулации показват намалена термична стабилност на ензима, адаптиран към студа. J. Mol. Графика. Модел. 26, 124–134 (2007).

Papaleo, E., Olufsen, M., De Gioia, L. & amp Brandsdal, B. O. Оптимизиране на електростатиката като стратегия за студена адаптация: казус на студени и топлоактивни еластази. J. Mol. Графика. Модел. 26, 93–103 (2007).

Мичети, Д. и др. Сравнително проучване на студено и топло адаптирани ендонуклеази А, използващо последователни анализи и симулации на молекулярна динамика. PLOS ONE 12, e0169586 (2017).

Papaleo, E., Pasi, M., Tiberti, M. & amp De Gioia, L. Молекулярна динамика на мезофилноподобни мутанти на студено адаптиран ензим: прозрения за дистални ефекти, предизвикани от мутациите. PLOS ONE 6, e24214 (2011).

Занфорлин, Л. М. и др. Олигомеризацията като стратегия за адаптация към студ: структура и динамика на GH1 β-глюкозидазата от Exiguobacterium antarcticum В7. Sci. Rep. 6, 23776 (2016).

Parvizpour, S., Razmara, J., Ramli, A.N.M., Md Illias, R. & Shamsir, M.S. Структурен и функционален анализ на нова психрофилна β-мананаза от Glaciozyma antarctica PI12. J. Comput. Aided Mol. Дес. 28, 685–698 (2014).

Ким, М. К. и др. Структурно-базирано изследване на функционалните роли на удължената бримка и сайтовете за разпознаване на субстрат в ендо-β-1,4-d-мананаза от антарктическата опашка. Cryptopygus antarcticus. Протеини 82, 3217–3223 (2014).

Гати-Лафранкони, П. и др. Развитието на стабилност в студено активен ензим предизвиква релаксация на специфичността и подчертава свързаните със субстрата ефекти върху температурната адаптация. J. Mol. биол. 395, 155–166 (2010).

Sigtryggsdóttir, Á. R., Papaleo, E., Thorbjarnardóttir, S. H. & amp Kristjánsson, M. M. Гъвкавост на адаптирани към студ и топлина субтилизиноподобни серинови протеинази, оценени с гасене на флуоресценцията и молекулна динамика. Биохим. Биофиз. Acta 1844, 705–712 (2014).

Xie, B. B. и др. Студена адаптация на цинкови металопротеази в семейството на термолизини от дълбоководни и арктически ледени бактерии, разкрити чрез каталитични и структурни свойства и молекулярна динамика: нови прозрения за връзката между конформационната гъвкавост и водородното свързване. J. Biol. Chem. 284, 9257–9269 (2009).

Adekoya, O. A., Helland, R., Willassen, N. P. & amp Sylte, I. Сравнителният анализ на последователността и структурата разкрива особености на студената адаптация на ензим в семейството на термолизина. Протеини 62, 435–449 (2006).


Структурна адаптация на студеноактивна RTX липаза от Pseudomonas sp. Щам AMS8, разкрит чрез подходи за симулация на хомология и молекулярна динамика

Психрофилният ензим е интересен предмет за изследване поради специалната си способност да се адаптира към екстремни температури, за разлика от типичните ензими. Използвайки компютърно подпомогнат софтуер, прогнозираната структура и функция на ензима липаза AMS8 (LipAMS8) (изолиран от психрофилната Pseudomonas sp., получени от антарктическата почва). Ензимът показва значителни сходства на последователността с липази от Pseudomonas sp. MIS38 и Serratia marcescens. Тези прилики помагат при прогнозирането на 3D молекулната структура на ензима. В това изследване се провежда 12 ns MD симулация при различни температури за структурен анализ на гъвкавост и стабилност. Резултатите показват, че ензимът е най-стабилен при 0°C и 5°C. От гледна точка на стабилност и гъвкавост, каталитичният домен (N-край) поддържа своята стабилност повече от некаталитичния домен (С-край), но некаталитичният домен показва по-голяма гъвкавост от каталитичния домен. Анализът на структурата и функцията на LipAMS8 дава нова представа за структурната адаптация на този протеин при ниски температури. Получената информация може да бъде полезен инструмент за нискотемпературни промишлени приложения и молекулярно инженерство в близко бъдеще.

1. Въведение

Липазата (известна също като триацилглицерол ацилхидролаза (E.C 3.1.1.3)) е серинова хидролаза, която действа във водни условия върху карбоксил естерната връзка на триацилглицерол, за да произвежда мастни киселини и глицерол [1]. Липазите показват често α/β-гидролазни гънки, които присъстват и в други хидролази [2]. Типична липаза се състои от активно място, състоящо се от каталитичната триада на серин, глутамин/аспартат и хистидин [3].

Липазите са широко разпространени сред живите организми, включително бактерии, еукария и археи, както е докладвано от Jaeger et al. [4]. Напоследък липазите, произведени от психрофилни бактерии, бяха изследвани поради ниските им оптимални температури и високата активност при много ниски температури. Съобщава се, че това се дължи на присъщата по -голяма гъвкавост в сравнение с мезофилните и термофилните ензими. Тези ензими са силно нарушени от прекомерна твърдост. Освен това особените свойства на психрофилните ензими ги правят особено полезни като ценни инструменти за биотехнологични цели и за изследване на възможните връзки между стабилност, гъвкавост и специфична активност [5, 6].

Въпреки това, адаптацията на ензима при ниски температури не е напълно разбрана, тъй като има малко изследвания върху психрофилните ензими. Някои характеристики, открити от учените, включват намален брой солни мостове, малко по -ниски съотношения [Arg/(Arg + Lys)], намален брой неполярни остатъци и по -голям брой открити неполярни остатъци [7]. По отношение на стабилността, психрофилните ензими са предимно нестабилни, както е доказано от различни демонстрации, включително флуоресцентна спектроскопия и други техники. Ензимът има тенденция да се разгръща при по-ниски температури и калориметрични енталпии [8]. Изследователите предполагат, че една от характеристиките на тези ензими е по-голям брой неполярни остатъци по повърхността им, което е отговорно за дестабилизирането на водната структура около ензимите. Освен това има по-малко остатъци от аргинин и пролин, което може да увеличи гъвкавостта на гръбнака. Имайте предвид, че изследванията относно гъвкавостта на психрофилните ензими (използвайки спектроскопски анализ, динамично гасене на флуоресценцията и симулации на молекулярна динамика) подкрепят идеята, че повишената гъвкавост на психрофилните ензими допринася за еволюцията на психрофилните ензими [9].

Значението на разбирането на структурните адаптации на екстремозимите се подчертава от тяхната полезност в различни промишлени приложения. Досега само няколко екстремофилни организми, особено психрофили, са били характеризирани и използвани като ензимни източници за промишлени процеси. Преди това нов щам психрофилни бактерии (обозначен щам AMS8) от антарктическа почва беше проверен за екстрацелуларна липазна активност и допълнително анализиран с помощта на молекулен подход. Анализът на 16S рДНК показа, че щамът AMS8 е подобен на Pseudomonas sp. Липазен ген, наречен LipAMS8 беше успешно изолиран от щам AMS8 с отворена рамка за четене от 1431 bp, която кодира полипептид, състоящ се от 476 аминокиселини. Тази сурова липаза проявява максимална активност при 20 ° С. Допълнителни генетични изследвания разкриха това LipAMS8 липсва N-терминален сигнален пептид и съдържа богата на глицин и аспартат неапептидна последователност в С-края (експериментални данни).

В това изследване структурата и функцията на липазата, изолирана от Pseudomonas sp. щам AMS8 се изследват чрез използване на структурата, предвидена с помощта на подходящ софтуер. Структурната адаптация на ензима при ниски температури също се изследва с помощта на молекулярно -динамична симулация (MD симулация). Тъй като това е новоизолиран ензим, е необходимо по -нататъшно проучване, за да се даде допълнително разбиране и разкрие потенциала на този психрофилен ензим, който може да се използва за промишлени, биотехнологични и фундаментални цели.

2. Материали и методи

2.1. Софтуер

Моделирането и симулацията на предвидената структура на ензима се изпълняваше на един компютър (CPU Intel (R) Core RM i5, 650 @ 3,2 GHz Co, 4,0 GB RAM) с операционна система Windows 7 Ultimate. Програмата Yet Another Scientific Artificial Reality Application (YASARA) [10] беше инсталирана на компютъра и беше използвана за молекулярно моделиране и симулация на молекулярната динамика (MD) на прогнозираната молекулярна структура на LipAMS8.

2.2. Подравняване на последователността на LipAMS8

Аминокиселинната последователност на ензима LipAMS8, получена от NCBI с номер за достъп ADM87309, се състои от 476 аминокиселинни остатъка с тегло 50 kDa се използва за анализ на последователността и моделиране. Програмата BLAST [11] идентифицира хомоложната последователност, която има висока идентичност на последователността с ензима LipAMS8. Последователността с най -висок резултат от идентичността на последователността е избрана въз основа на определени характеристики, включително вида на произхода и наличието на разрешените 3D структури. Впоследствие се извършва подравняване на множество последователности с помощта на отворен софтуер Biology Workbench [12] с протеиновите последователности на Serratia marcescens [13] и Pseudomonas sp. MIS38 [14], тъй като и двата шаблона отговарят на необходимите критерии, както е споменато по-горе.

2.3. Сравнително моделиране и валидиране

Шаблоните, използвани за моделирането, са кристалните структури на липазите, получени от Serratia marcescens [13] и Pseudomonas sp. MIS38 [14]. Атомните координати за липазите Serratia marcescens (PDB ID: 2qua) и Pseudomonas sp. MIS38 (PDB ID: 2z8x) са получени от протеиновата банка данни. 3D моделът е генериран с помощта на YASARA [10]. Валидирането беше извършено с VERIFY3D [15] (за оценка на годността на протеиновата последователност в настоящата му 3D структура) и графика на Рамачандран [16] (за оценка на геометричните аспекти на структурата).

2.4. Симулации на молекулярна динамика (MD) при различни температури

MD симулация даде повече информация за подробно микроскопично моделиране в молекулен мащаб. Методът следва конструктивния подход, като имитира поведението на молекулите с помощта на моделни системи. По -мощните компютри правят възможно изучаването на по -голяма сложност с реалистично очакване за получаване на смислена и полезна информация [17].

В това проучване симулацията на MD се извършва във вода. Това включва симулация на предвиден модел вътре в траекторна кутия, пълна с 6940 молекули разтворител (включително NaCl и вода) и 467 аминокиселинни остатъци LipAMS8 при температури 0 ° C, 5 ° C, 25 ° C, 37 ° C, 50 °C и 100°C. Плътността на водата варира в зависимост от температурата, тъй като теоретичната плътност на водата зависи от температурата.

Параметърът на силовото поле AMBER03 [18], внедрен в софтуера YASARA, беше използван за симулация на MD. При всяка симулация първоначалният модел беше сведен до минимум, за да се намали разликата в контактната площ (CAD) между протеиновия модел и молекулата на разтворителя. По време на минимизирането бяха използвани алгоритми за конюгирано спускане и най-стръмно спускане.

2.5. Симулационен анализ

Ензимът е изследван с помощта на 240 запазени стъпки за всяка симулация, което представлява до 6 наносекунди от производствения период. Анализът осигурява по-добро разбиране на динамичните свойства на ензима във вода при различни температури. Средното квадратно отклонение (RMSd) е изчислено за протеиновия гръбнак и остатъци, за да се провери стабилността на траекториите. Освен това, средноквадратичната флуктуация (RMSf) се изчислява на остатък, за да се изследва гъвкавостта на траекториите. Допълнителен анализ беше извършен чрез изчисляване на радиуса на гирация (Rgyration) и достъпна до разтворителите повърхностна площ (SASA) на ензима в рамките на 6 наносекунди (ns) от времето на производство.

3. Резултати и дискусия

3.1. Сравнително моделиране на LipAMS8
3.1.1. Моделиране на LipAMS8

Подравняването на последователността търси подходящи шаблони за конструиране на 3D структурата на липаза AMS8 (LipAMS8), използвайки сравнително моделиране. В това изследване кристалните структури от Pseudomonas sp. MIS38 липаза и Serratia marcescens LipA ​​(с резултат 80% и 69% за идентичност на последователността) бяха избрани като шаблони за моделиране, тъй като и двете имат най -високи резултати от идентичността на последователността, когато са подравнени с последователността LipAMS8. И двата шаблона също имат решени структури, които могат да бъдат получени от RSCB PDB Data Bank, което е важно за прогнозиране на 3D структурата на ензима.

Два шаблона бяха използвани при моделирането на LipAMS8 по такъв начин, че от всеки шаблон се формира модел, както и хибриден модел, който се формира въз основа на най-добрата конфигурация на протеин, използвайки двата избрани шаблона. Z-оценката на всеки модел обаче е най-важният параметър, тъй като най-добрата стойност на Z-резултатите, получена от всеки получен модел, ще означава за точността и качеството на самия модел. Впоследствие хибридната структура, която се очаква да бъде най-добрият модел за LipAMS8, е отхвърлена поради лош Z-резултат в сравнение с този, получен само с Pseudomonas sp. MIS38 като шаблон.

Моделът беше валидиран с помощта на графика на Рамачандран (Фигура 2). Моделът има 89,5% от остатъците, пребиваващи в най -благоприятния разрешен регион. Въпреки че най -добрите резултати са 90.0% и по -високи, полученият резултат се счита за приемлив, тъй като моделът е модел за предсказване, а не кристална структура (т.е. кристалната структура е напълно разрешена структура в сравнение с предвидената). В предишно проучване серинът от каталитичната триада, който се намира в отрицателната/забранена област на участъка от Рамачандран, е предложен за активна конформация на ензима [19]. Въпреки това, от това изследване, Ser 207 от каталитичната триада на LipAMS8 се намира в разрешения регион на участъка от Рамачандран. Това предполага, че ензимът е в неактивна конформация, която се поддържа от наблюдаваната структура на капака на ензима (затворена конформация). Предсказването на активната конформация на ензима също може да се извърши чрез наблюдение на структурата на капака.

В сравнение със структурата на шаблона, използвана за моделиране на LipAMS8, както е показано в наслагвано изображение на фигури 1 (б) и 1 (в), прогнозираният модел на LipAMS8 също показва две основни области: каталитичните (зелени) и некаталитични (сини) области, както е показано на фигура 1 (а). Каталитичният домен в N-терминала е богат на α спирали, докато некаталитичният домейн на С-терминала е доминиран от β- нишки. Каталитичният домен също показва присъствието на α/β-хидролазна гънка и каталитична триада, която включва остатъци Ser 207, His 255 и Asp 313. Ser 207 се появява в пентапептида на мотивите G-X-S-X-G (където X представлява His 206 и Leu 208) и се намира на острия завой между β-верига и α-спирала, която наподобява нуклеофилния лакът (обикновено присъства в структурното семейство на α/β-хидролази) [20]. Това предполага, че каталитичният серин е подпомогнат от оксианионен отвор, който стабилизира отрицателния заряд, генериран по време на нуклеофилна атака от Ser Oγ [19].


(а)
(б)
(° С)
(а)
(б)
(° С) (а) LipAMS8 прогнозира 3D структура. Структурата се състои от каталитични (зелени) и некаталитични (сини) области. Капакът е оцветен в (червен). (b) и (c) са наслагване на структурата на LipAMS8 (лилаво) с 2QUA (сребро) и 2Z8X (жълто).


Рамачандран сюжет на 3D структурата LipAMS8. Структурата има 89,5%, което означава, че 89,5% от остатъците се намират в най -облагодетелствания регион.

По принцип липазата може да съществува в 2 конформационни състояния: активно и неактивно. Конформацията на капака (отворена или затворена) определя дали ензимът е в активна или неактивна конформация. Активната конформация на липазата е необходима за каталитичната активност [19]. В това проучване има структура, подобна на капак, която покрива каталитичното място на каталитичния домен, което предполага неактивната конформация на ензима. Предишни проучвания показват, че активната форма на ензима е с отворен капак, което позволява влизането на субстрата в мястото на свързване за катализа [21]. По този начин, затворената конформация на капака в това изследване означава, че нуклеофилният Ser 207 не може да атакува субстрата.За отваряне на капака е необходим интерфейс вода-масло, така че капакът да може да бъде модулиран, за да разкрие каталитичното място, осигурявайки достъп до каталитичния джоб за субстратите [19]. Това повишава активността на LipAMS8. Капак номер 1 на LipAMS8 има голям брой хидрофобни остатъци, включително Ala 51, Leu 53, Val 54, Val 57 и Val 58. Това може да позволи ефективно взаимодействие между хидрофобните остатъци на капака с липидния интерфейс и да допринесе за по-лесно отваряне на капака.

От това проучване, LipAMS8 се състои от RTX мотиви в некаталитичния домен, което предполага, че LipAMS8 е една от RTX липазите, които принадлежат към подсемейство I.3. Това се доказва допълнително от липсата на остатъци от цистеин [22]. Обърнете внимание, че RTX мотивът присъства в различни грам-отрицателни микроорганизми [6]. Този мотив (състоящ се от богати на глицин неапептидни последователности) обикновено се намира в карбокси-крайната част на ензим [22]. В 3D структурата на LipAMS8, последователността от RTX мотиви представлява паралел β-рол, който първите 6 остатъка от всеки мотив образуват за прикрепване на калциеви йони (Ca 2+). Останалите 3 остатъка са къси β-вери, които водят до дясната спирала на β-верига върху некаталитичния домен. Точната функция на RTX мотивите остава неясна. Въпреки това, те могат да бъдат рецептор свързващи домейни, подобрители на секрецията и вътрешни шаперони [6].

В прогнозирания модел на LipAMS8 има метални йони, включително 6 атома Ca 2+ и 1 атом Zn 2+. Обърнете внимание, че металните йони са необходими от значителна част от ензимите за извършване на каталитична активност. Металните йони също могат да допринесат за активиране на субстрата и електростатично стабилизиране на ензимната структура. В това изследване Asp 128, Asp 130 и лигандът взаимодействат в местата за свързване на Zn 2+. Zn 2+, присъстващ в този LipAMS8, не се намира в каталитичното място, така че може да не допринесе за каталитичната активност на ензима. Наред с приноса си към каталитичната активност, йоните могат да осигурят локална и цялостна структурна стабилност, подобно на функцията на дисулфидите [23]. В заключение, има метални йони в предвидената структура на LipAMS8, което може да допринесе за цялостната структурна стабилност. Наблюдава се обаче, че ензимът има малко или никакви аргинини в сравнение с лизините, ниско съдържание на пролин и липса на солен мост, което според съобщенията допринася за адаптацията на психрофилните ензими при ниски температури. Освен това се предвижда ензимът да има по -голяма гъвкавост в сравнение с мезофилните или термофилните ензими, което позволява на психрофилните ензими да бъдат активни при ниски разходи за енергия [7].

3.1.2. Молекулярно -динамични (MD) симулации

Беше извършена MD симулация, за да разкрие промени в структурата, гъвкавостта и динамиката на LipAMS8, когато се симулира при повишени температури. Конформационното вземане на проби е ограничено до 12 ns. Предполага се, че LipAMS8 е студено активен ензим. Следователно, структурата трябва да се денатурира или разгъне, когато температурата се повиши от 25 ° C до 100 ° C поради нарушаването на междумолекулните сили, поради увеличаването на кинетичната енергия при повишени температури. В това изследване обаче не се наблюдава особено разгръщане на вторичната структура, дори когато ензимът се симулира при по -висока температура. Това може да се дължи на ограничението на конформационното вземане на проби, което е максимум 12 ns. Може да се наложи удължаване на времето за симулация, за да се видят структурните промени.

3.1.3. Анализ на данни за симулация на молекулярна динамика

Стойностите на средно квадратното отклонение (RMSd) на атомите на гръбнака в първоначалните модели оценяват конвергенцията на протеиновата система. В това проучване RMSd стойностите от минимизираната прогнозирана структура на модела по време на MD симулация при 0°C, 5°C, 25°C, 37°C, 50°C и 100°C са показани на фигура 3. При 5° С, протеинът остава естествен и се уравновесява със средно 1,83 Å от минимизираната структура. Това показва стабилността на ензима при 5°C. В сравнение с 5°C, стойността на RMSd при 0°C показва, че 3D структурата на протеина става нестабилна, когато достигне 1000 ps. Стойността на RMSd започва да се колебае до стойности, по -високи от 2 Å и дори достига стойност от 3,45 Å при 2525 ps. Стойността падна до 1.807 Å при 3675 ps и се повиши до повече от 2 Å при 4000 ps. Нестабилната флуктуация на RMSd е в съответствие с разликата в елементите на вторичната структура, наблюдавана по време на симулацията. Въпреки това, структурната стабилност се наблюдава след 5500 ps, ​​тъй като моделът на флуктуация на RMSd се поддържа и не се отклонява повече от 2 Å към края на симулацията при 12 ns.


Тенденцията на флуктуация за стабилността на ензима при 25 ° C, 37 ° C, 50 ° C и 100 ° C се увеличава по време на симулацията, като стойностите на RMSd остават по -високи от 4.0 Å при 3000 ps през останалата част от симулационния период. Нестабилното състояние на този ензим се подкрепя от експериментални данни, които установяват, че ензимната активност на LipAMS8 е намалена, когато температурата се повиши над 25 ° C. От изследването заключаваме, че при 25 ° C, 37 ° C, 50 ° C и 100 ° C глобалната 3D структура на протеина губи своята естествена структура, за да адаптира молекулата към промените в температурата и плътността на водата ( разтворителя). По този начин този резултат показва, че промените в геометричните координати и разгъването на протеина са резултат от намалената стабилност на системата.

Ние заключихме, че най -стабилните температури за LipAMS8, симулирани във вода, са 0 ° C и 5 ° C, тъй като ниската температура насърчава по -малко конформационно движение, поддържайки структурна цялост и стабилност. От друга страна, при температури между 25°C и 100°C структурата на ензима е нестабилна и силно се отклонява от първоначалната си структура. По -голямото отклонение на ензимната структура, когато се симулира във вода при 25 ° C до 100 ° C, може да бъде свързано с нарушаване на молекулярните сили, което води до по -висока кинетична активност на молекулите. Въпреки това, структурните промени на ензима, симулиран във вода, не са толкова критични в сравнение със структурните промени, които настъпват, когато ензимът се симулира в органичен разтворител [24].

Интересното е, че средните резултати от RMSd за 0 ° C и 5 ° C бяха стабилни по време на симулацията. Въпреки това, стабилността е адаптирана само към каталитичния домен на ензима, за който се смята, че се насърчава от присъствието на метални йони като Zn 2+ и Ca 2+ . От друга страна, нестабилното състояние на този ензим, което се допринася от високата гъвкавост на некаталитичния домен при ниски температури като 0 ° C и 5 ° C, обаче е някак предвидимо, тъй като ензимът трябва да се адаптира към ниската температура, при което кинетичният енергията бавно намалява. Ако ензимът не увеличи гъвкавостта си в този момент, структурата може да стане твърде твърда и да не може да компенсира намаляването на температурата на катализа.

Фигура 4 показва средните квадратни колебания (RMSf) на остатък за LipAMS8, симулирани във вода при температури от 0 ° C до 100 ° C. Средните резултати за RMSf на остатък за всички температури варират от 1,12 Å до 4,1 Å. Най -високата оценка на колебанията е при 100 ° C. Този резултат е еквивалентен на ефекта на по -високата температура върху гъвкавостта на ензима. Въпреки това, когато се сравнява гъвкавостта на ензима при 0°C и 5°C, стойността на RMSf намалява от 1,43 на 1,12 Å. По -високата гъвкавост на ензима при по -ниска температура може да предполага адаптиране на ензима, за да противодейства на „замръзващия ефект“ при спадане на температурите.


На каталитичното място резултатите от RMSf не показват по -голяма гъвкавост на остатъците, симулирани във вода при различни температури. Гъвкавостта се поддържа на стойност под средния RMSf резултат при различни температури. Това предполага, че стабилността на каталитичната триада се подкрепя от цифрата RMSd на остатък.

Като цяло моделът на колебания на остатък е подобен на модела, показан на фигурата на RMSd на остатък. И двете фигури показват, че по-висока флуктуация възниква в некаталитичния домен. Най-последователното колебание в температурите се наблюдава при остатъци 393–476, които се намират в некаталитичния домен, при който присъстват повторенията на RTX. Гъвкавостта на домейна може да възникне поради наличието на високи глицинови остатъци, за които е известно, че въвеждат гъвкавост в протеиновата структура, тъй като им липсват странични вериги [25]. Повишената гъвкавост на LipAMS8 (която произхожда от ниската стабилност на некаталитичния домен) може да означава, че некаталитичният домен е решаващата част от молекулната структура на LipAMS8. Този домен може да допринесе за висока ензимна активност при ниска температура.

Проучването на структурната гъвкавост на структурата на капака показва, че капак номер 1, съставен от остатъци 51–58, няма по -висок от средния RMSf резултат при всяка температура. Въпреки това, капак номер 2, който се състои от остатъци 148–167, има флуктуация при остатъци 148–153 при повечето температури. Това доказва гъвкавостта на остатъците от капака, когато се симулира във вода при различни температури. Този резултат доведе до хипотезата, че капак номер 2 на LipAMS8 може да бъде в състояние да претърпи конформационен преход при правилните условия, като наличието на субстрати. Остатъците 148–153 на капака номер 2, който е по -гъвкав, може да действа като държач, който отваря структурата на капака, за да изложи мястото на свързване при междуфазова активация. За разлика от капак номер 1, капак номер 2 е по-гъвкав. По този начин капак номер 2 може да бъде първият капак, който се отваря, когато има субстрати. Интерфейсът вода-масло около отвора на първия капак е по-малко гъвкав за свързване на субстрата с каталитичното място. Имайте предвид, че отварянето на капака е решаваща стъпка в липазата с подобна на капака структура. Гъвкавостта на остатъците, които се намират в структурата на капака, е важна за определяне скоростта на движение на капака, която играе важна роля в адаптацията на ензимната функция при ниски температури [7].

Структурната гъвкавост, наблюдавана върху структурата на LipAMS8, симулирана във вода при различни температури, може да намалее, ако се симулира в органичен разтворител. Предишно проучване предполага по -висока твърдост на ензима в органичен разтвор [26]. На молекулярно ниво обаче няма много информация, която да приеме или отхвърли предложението. За да се провери структурната гъвкавост на ензима както във водна, така и във неводна среда, е необходима допълнителна симулация за сравняване на структурната основа на ензима.

Анализът на средноквадратичната флуктуация (RMSf) на остатък и средноквадратичното отклонение на остатък (RMSd) на гръбначните атоми се използват за анализ на атомните колебания на прогнозирания модел на LipAMS8. Фигура 5 показва RMSd на остатък при 0°С, 5°С, 25°С, 37°С, 50°С и 100°С. Средният RMSd за всички остатъци, включително крайния остатък, измерва качествено протеиновата гъвкавост за връзката между протеиновата конформационна гъвкавост и динамика.


От данните средните стойности на остатъците RMSd са почти еднакви между 0°C и 5°C. Въпреки това, при 25 ° C, 37 ° C, 50 ° C и 100 ° C средните стойности на RMSd се увеличават до 6,29 Å. Моделът на средните стойности на RMSd на остатъци е подобен на средните стойности на средноквадратната флуктуация (RMSf) при всички температури.

Отклонението на структурната геометрия на ензима се наблюдава главно в некаталитичния домен. Стойностите на RMSd на остатък при остатъци 412-425 и 436-470 са по -високи от средния резултат на RMSd при всяка температура. От това дестабилизирането на ензима не включва целия протеин, както се предлага от едно проучване [19]. Вместо това, дестабилизацията на ензима може да включва част от ензима (както се наблюдава в това проучване). Освен това данните също отхвърлят постулата, че дестабилизацията на ензима се случва най -вече в каталитичния домен [8]. Дестабилизирането на ензима се случва най -вече върху некаталитичния домен, което може да бъде причинено от наличието на остатъци, които причиняват загуба на стабилност на ензимната 3D структура. Интересното е,

-roll се предлага за поддържане на стабилността на Pseudomonas sp. MIS38. Изтриването, промяната и мутацията на този рол, който се образува от присъствието на RTX мотиви и Ca 2+, биха причинили промени в структурната конформация и денатурация на ензима. Въпреки това, ние предложихме, че всъщност по -кратък/по -малък брой RTX повторения, по -малък брой метални йони в този аналог на Pseudomonas sp. MIS38, може да е причината LipAMS8 да е в състояние да се адаптира в изключително студена среда.

Изследването на каталитичния домен показва, че Asp 128 и Asp 130, които взаимодействат със Zn 2+, имат RMSd за остатък по -високи от средните резултати на RMSd при всяка температура. По този начин Asp 128 и Asp 130 са сред онези остатъци, които се колебаят и мобилизират адаптацията към температурата. Съотношенията на колебания на Asp 128 и Asp 130 към средните резултати на RMSd при всяка температура намаляват с повишаване на температурата. Това предполага по-високо взаимодействие между металите и Asp 128 и Asp 130 при по-високи температури. Този резултат е силно съгласуван с предишно проучване, което предполага, че Zn 2+ насърчава структурната стабилизация в активна конформация на ензима при повишени температури [27]. Този резултат предполага по-висока вероятност за адаптация на ензима при по-високи температури, особено в каталитичния домен, тъй като Zn 2+ стабилизира ензимната структура.

Както е показано от Фигура 4, се запазват оценките за тези остатъци, които взаимодействат с Ca 2+ в каталитичния домен. Това показва, че металът допринася за стабилизирането на каталитичния домен, така че структурата да не се отклонява от първоначалната си структура. Този резултат е в съответствие с функцията на Са 2+ в структурната стабилност на липазата, предложена в предишно изследване на B. glumae липаза [28]. Експерименталните данни за ефекта на калция върху активността на LipAMS8 също подкрепят идеята, че Ca 2+ може да насърчи структурната стабилност на ензима. По този начин се поддържат ензимните свойства и се подобрява каталитичната активност, за да се осигури по -голям добив. За разлика от остатъците, които взаимодействат с Ca 2+ в каталитичния домен, Ca 2+ в некаталитичния домен има по -високи стойности на RMSd и RMSf, което показва дестабилизиране и гъвкавост на остатъка. Приносът на Ca 2+ върху стабилността на остатъка не е в съгласие с предположението, че той насърчава стабилността. Резултатите от RMSd и RMSf на остатъка, който взаимодейства с Ca 2+ в некаталитичния домен, може да се дължи на процеса на адаптация от Ca 2+, така че каталитичният домен да остане стабилен. Това предотвратява разгъването на каталитичния домен, който е отговорен за каталитичната активност, и дисфункция поради промени в структурната стабилност и конфигурация.

Радиусът на въртене (Rgyration) на ензима при различни температури в рамките на траекториите при 12 ns е показан на фигура 6. Параметърът предоставя информация за тенденцията на протеиновите структури да се разширяват по време на динамична симулация. При 5 ° C резултатът от Rgyration се поддържа по време на симулацията в сравнение с Rgyration резултата на ензима, когато се симулира при по -високи и по -ниски температури. Най-високият резултат на радиус на въртене на LipAMS8 е при 25 ° C, резултатът се увеличава до 27,128 Å в рамките на 12 ns симулация. Това е последвано от резултати от други температури, с изключение на резултата при 5 ° C. Това показва адаптирането на ензимната структура, за да се предотврати загубата на естествената компактност на структурата при ниска температура. Като цяло резултатът е пропорционален на отклонението на ензимната структура, както е показано на фигура 3. Докато SASA показва прехвърлянето на свободна енергия, необходима за преместване на протеин от воден към неполярен разтворител [29], както е показано на фигура 7, Резултатите от SASA при 5 ° C и 0 ° C показват модела на колебания, който се поддържа през 12 ns на симулацията. В сравнение с 25°C, цифрата се увеличава, което показва разгръщане на ензима в рамките на периода на симулация. Разгръщането на ензима при тази температура е пропорционално на структурните промени на вторичната структура на ензима. Увеличаването на SASA резултата се наблюдава и при температури от 37 ° C, 50 ° C и 100 ° C.


Материали и методи

Свръхекспресия и пречистване на протеини

В EaBglA-pET28a експресионен вектор се трансформира в Ешерихия коли BL21 (DE3) клетки (Agilent Technologies, Санта Клара, САЩ). Клетките се отглеждат в 1 L среда LB при 37 ° С и експресията на протеин се индуцира с 0.4 mM изопропил-D-тиогалактопиранозид (IPTG) при 37 ° С в продължение на 3 часа. Клетките се събират чрез центрофугиране при 7000 xg (20 минути, 4 ° С), ресуспендиран в буфер А (20 тМ натриев фосфат, 500 тМ NaCl, 20 тМ имидазол, рН 7,5), допълнен с 1 тМ PMSF и лизиран чрез третиране с лизозим, последвано от ултразвук. Клетъчният екстракт се избистря чрез центрофугиране (20 000 xg, 30 min, 4 ° C) и супернатантата се нанася върху 5 mL Hi-Trap хелатираща HP колона (GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, САЩ), свързана към система ÄKTA (GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, САЩ) и предварително уравновесена с буфер А. Свързаните протеини се елуират с нелинеен градиент на буфер В (20 тМ натриев фосфат, 500 тМ NaCl, 500 тМ имидазол, рН 7,5). Фракциите с β-глюкозидазна активност се обединяват, концентрират до 5 ml с помощта на центробежни единици Amicon Ultra и се подлагат на хроматография с изключване на размера, използвайки колона Superdex 75 16/60 (GE Healthcare Biosciences, Питсбърг, САЩ), предварително уравновесена с 20 mM натриев фосфат , 150 mM NaCl, рН 7.5, при дебит 0.5 mL/min. Тетрамерните и мономерните форми бяха успешно разделени в два различни пика чрез този хроматографски етап и показаха висока чистота според SDS-PAGE анализ. Концентрацията на протеин се оценява чрез А280nm използвайки коефициента на екстинкция от 110 030 M −1 cm −1 .

Биохимични ензимни анализи

Ензимната активност се измерва с помощта на колориметричния субстрат 4-нитрофенил β-D-глюкопиранозид (стрNPG, Sigma-Aldrich Co, Сейнт Луис, САЩ). Експериментите бяха проведени трикратно в 100 μL реакции при условия на насищане на субстрата (0.5 mM стрNPG) в 40 mM натриев фосфатен буфер рН 7,0. Крайната концентрация на ензима е 20 nM. Реакциите се инкубират в продължение на 10 минути при оптимални условия за каталитична активност (30 °C и pH 7,0) и се спират със 100 μL 1 М натриев карбонат (Na2CO3).Ензимната активност се измерва спектрофотометрично при 405 nm, следейки освобождаването на стр-инитрофенол с помощта на четец за микроплаки Infinite® 200 PRO (TECAN Group Ltd., Männedorf, Швейцария). Измерванията се изразяват като относителна активност (%), като се има предвид максималната каталитична активност, наблюдавана за биологичната единица на ензима (тетрамер).

Кръгов дихроизъм

За оценка на глобалната конформация на EaBglA както в тетрамерни, така и в мономерни конформации. CD измерванията бяха получени на JASCO J-815 CD спектрометър, контролиран от CDF-426S/15 система за контрол на температурата на Peltier (Jasco Analytical Instruments, Oklahoma, EUA). За всички CD експерименти беше използвана кварцова кювета с дължина на пътя от 1 cm и всеки спектър беше средно от поне три сканирания. Концентрацията на протеин е 5,8 μM (за тетрамер и мономер) в 20 mM натриев фосфат, 150 mM NaCl, рН 7,5. Всички спектри са получени при 20 ° C в диапазона 200-260 nm с честотна лента 2 nm и време на реакция 4 s/nm. CD данните бяха извадени от буфера и нормализирани към моларната остатъчна елиптичност, позволявайки сравнението между формите.

Динамично разсейване на светлината

Хидродинамичен радиус (Rз) на мономерната форма на EaBglA се определя чрез динамично разсейване на светлината (DLS). Данните са записани при 20 ° C на Malvern Zetasizer Nano ZS 90 (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) с 633 nm лазер, в кварцова клетка с ъгъл на разсейване 90 °. Пробите, пречистени от хроматографията с изключване на размера, бяха анализирани в различни концентрации (0,3 до 1,2 mg/mL) и хидродинамичните радиуси бяха получени след средно 20 цикъла от екстраполацията на коефициента на транслационна дифузия (Dt) според Стоукс- Уравнение на Айнщайн

Аналитично ултрацентрофугиране (AUC)

Експериментите със скорост на утаяване (SV) бяха проведени с помощта на аналитична ултрацентрифуга на Beckman Optima XL-A (Beckman Coulter Inc, Brea, EUA). Данните бяха събрани при 35 000 оборота в минута и 20 ° С, използвайки оптичната система за абсорбция както за 220, така и за 280 nm детекции. EaBglA се получава в различни концентрации (0.2, 0.4 и 1 mg/mL) в 20 mM натриев фосфат, 150 mM NaCl, рН 7.4. SV сканирането се анализира с помощта на метода c (s) в програмата SEDFIT (v14.4d) 36, за да се определи молекулната маса на протеина. Приложено е конвенционално c(s) разпределение с фиксирано ниво на доверие на регулиране от 0,95 и коефициент на триене (ƒ/ƒ0) се използва като параметър за регуляризация. Стандартните коефициенти на утаяване (s20, w) бяха определени от максимума от пиковете на непрекъснатите c(S) криви след корекции за премахване на смущенията, причинени от вискозитета, плътността и температурата на буфера (ρ = 1,0039 g/mL и η = 0,0102643 Poise бяха получени от програмата SEDNTERP ). s°20, w стойност при безкрайно разреждане е получена чрез линейна регресия на s20, ш като функция от концентрацията на протеини 37.

Малък ъгъл на разсейване на рентгенови лъчи

Измерванията на рентгеново разсейване с малък ъгъл (SAXS) бяха извършени с помощта на монохроматичен рентгенов лъч (λ = 1.488 Å) от линията на лъча D01A-SAXS2 в Бразилската лаборатория за синхротронна светлина (LNLS, Campinas, Бразилия). EaBglA проби се приготвят в 20 mM натриев фосфат, 150 mM NaCl, рН 7.4 при концентрации от 1 и 2 mg/mL. Пробите се центрофугират в продължение на 30 минути при 23 000 xg и 4 ° C за отстраняване на потенциални агрегати преди всички експерименти с SAXS. Разстоянието между пробата и детектора беше настроено на 1000 mm, за да се получи обхватът на вектора на разсейване (q) от 0,013 до 0,33 Å -1 , където q означава големината на q-вектора, определен от q = 4π sinθ/λ ( 2θ е ъгълът на разсейване). Пробите бяха анализирани при 20 ° C в 1-милиметрови клетки от слюда с дължина на пътеката и профилите на разсейване бяха записани в десет последователни кадъра (всеки с продължителност 10 s) за наблюдение на радиационните повреди и стабилността на лъча. Получените SAXS криви бяха буферно извадени и интегрирани с помощта на програмата FIT2D 38 . Радиусът на въртене (Rж) се определя от уравнението на Гиние 39 и чрез метода на непряко преобразуване на Фурие, използвайки пакета 40 на GNOM. Програмата GNOM също беше използвана за генериране на разпределението на разстоянието на частиците p(r) и максималния диаметър, Dмакс. Програмата DAMMIN 41 беше приложена за получаване ab initio модели за EaBglA (модел на сляп атом), чрез симулирана процедура за оптимизация на отгряване, която най -добре отговаря на експерименталните данни за разсейване. Формата на протеина беше реконструирана чрез средно 20 различни ab initio модели, използващи пакета DAMAVER 42 . Полученият модел с ниска разделителна способност и кристалната структура се наслагват с помощта на програмата SUPCOMB 43. Теоретичната крива на разсейване е генерирана от кристалографски атомни координати, използвайки програмата CRYSOL 44 и сравнена с експерименталните данни за разсейване.

Диференциална сканираща калориметрия

Термична стабилност на EaBglA беше изследван чрез диференциална сканираща калориметрия (DSC). EaBglA, при концентрация от 2 mg/mL в 20 mM натриев фосфат, 150 mM NaCl и рН 7,4, се сканира със скорост 1 ° C/min във VP-DSC устройство (Microcal, GE Healthcare, Northampton, САЩ) в диапазона 15–90 ° C на стъпки от 0,5 ° C. Профилът на DSC се изважда от буфера, нормализира се концентрацията и получените ендотерми се интегрират след разпределяне на базови линии преди и след прехода. Тъй като термично индуцираното разгъване на EaBglA беше необратим при тествани условия, анализът беше фокусиран върху стойностите на преходните температури (Tм).

Кристализация на протеини

Експериментите по кристализация бяха проведени по метода на дифузия на пара в 96-ямкови плаки, използвайки автоматизирана система Honeybee 963 (Digilab, Marlborough, MA). EaBglA кристализира при 18 ° C в седнали капки, съдържащи 0,5 μl протеинов разтвор при 15 mg/mL и 0,5 μL от условията на кристализация. ° С2221 кристалите се отглеждат в състояние, съдържащо 0,1 М CAPS (рН 10,5), 0,2 М литиев сулфат и 2 М амониев сулфат, използвайки на място протеолиза (1: 1000 (w/w) съотношение на трипсин:EaBglA). P21 кристали се получават в среда, съдържаща 0,1 М TRIS (рН 8,5), 2% (v/v) PEG400 и 1,45 М литиев сулфат.

Събиране на данни и определяне на структурата

Данни от рентгенова дифракция на ° С2221 и P21 кристали (криозащитени с 20% (об./об.) глицерол) бяха събрани на линията на лъча MX2 от LNLS (Campinas, Бразилия) и на линията на лъча I03 от Diamond Light Source (Оксфордшир, Великобритания), оборудвани съответно с детектори PILATUS 2M и PILATUS3 6M. Данните бяха индексирани, интегрирани и мащабирани с помощта на XDS пакет 45. Кристалната структура е решена чрез молекулярни заместващи методи, използващи програмата PHASER с атомни координати на β-глюкозидазата от H. orenii (PDB ID: 4PTV) като модел за търсене. Структурите бяха усъвършенствани редуващи се цикли на TLS, двойно усъвършенстване (P21 кристал) и сдържано усъвършенстване (включително локални ограничения на NCS) с помощта на REFMAC5 46 и ръчно изграждане на модел с помощта на COOT 47. Двата последни остатъка бяха подредени във всички вериги от двата кристала и не бяха моделирани. Крайните структури бяха валидирани с помощта на MOLPROBITY 48. Статистиката за събиране на данни и прецизиране са обобщени в Таблица 3. Структурните фактори и атомните координати на двете кристални форми, P21 и C2221, бяха депозирани в PDB под кодовете за присъединяване 5DT5 и 5DT7, съответно.

Структурни анализи

Структурните наслагвания бяха извършени с помощта на услугата за сравнение на протеиновата структура PDBeFold (http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/ssm) 49. Вътремолекулните взаимодействия и протеиновите интерфейси бяха анализирани с помощта на сървърите PIC (http://pic.mbu.iisc.ernet.in/) 50 и EPPIC (http://www.eppic-web.org/ewui/) 51, съответно. Обемът на протеиновите кухини се изчислява с помощта на KVFinder 52 и CASTp 53. Фигурите бяха приготвени с помощта на PYMOL 54.

Симулации на молекулярна динамика

Създадени са симулационни системи, използващи явна солватация за биологичните единици на EaBglA и хоBglA (PDB ID: 4PTX). Извършена е симулация на молекулна динамика от 100 наносекунди, използвайки силовото поле YAMBER3 с времеви ход от 5 фемтосекунди, запазвайки моментна снимка на всеки 250 пикосекунди, използвайки YASARA 55. Всяка от системите беше симулирана при 10 и 30 °C с помощта на термостат Berendsen за контрол на температурата. Налягането се следи с помощта на плътността на разтворителя като сонда и се поддържа постоянно по време на симулацията чрез изотропно преоразмеряване на симулационната клетка, за да съответства на адекватните стойности на плътността на разтворителя, когато е необходимо.

Анализи на молекулярната динамика

Средноквадратичните колебания на корена, както и водородните връзки, солевите мостове и зоната, достъпна за разтворители, бяха изчислени с помощта на персонализирани скриптове и координатите на последните 80 наносекунди от симулациите от 100 наносекунди. Водородните връзки бяха идентифицирани, като се вземе предвид енергията на връзката от 6,25 kJ/mol като праг, като се има предвид, че енергията на връзката е функция от разстоянието на водород-акцептор. Електростатичните двойки се разглеждат, когато техните атоми (не водород) са по-близо от 4 Å един от друг. Достъпната за разтворителите повърхност е изчислена с помощта на процедури, внедрени в софтуера YASARA.

Филогенетичен анализ

Протеиновите последователности на β-глюкозидази от психротрофни бактерии бяха използвани като примамки при BLASTp търсения срещу нелишната база данни на NCBI. Бяха избрани максимум четири протеинови попадения с идентичност на последователността, варираща от 60 до 95% за всяка заявка. За сравнение, хомоложните протеини на хоBglA също бяха извлечени по същите критерии. Всички протеинови последователности бяха подравнени с помощта на софтуера MUSCLE 56. Позициите, съдържащи пропуски или липсващи данни, бяха частично изключени от подравняването на множество последователности, като се използва ограничение на покритието на сайта от 80%. Въз основа на полученото подмножество от данни е изведено еволюционно дърво с помощта на метода на максималната вероятност (ML) и най-добрия модел на заместване на аминокиселини, посочен от софтуера MEGA (версия 6.0) 57 , който е LG матрицата, като се приема, че скоростта варира между места според гама разпределение (+G) и отчитане на наличието на инвариантни места (+I). Доверието на топологията на дърветата беше оценено с помощта на Bootstrap анализ на базата на 1000 реплики на bootstrap. Таксономията на видовете бактерии е извлечена от базата знания на Uniprot 58 . Бактериите са класифицирани въз основа на тяхната оптимална температура на растеж, когато е налична, или при минималната температура, която могат да растат като психрофилни/психротрофни (Tизбирам & lt 20 ° C Tмин & lt 5 ° C), мезофилен (20 ° C & lt T.избирам > 40 °C Tмин > 5 °C) и термофилни (Tизбирам & gt 40 ° C Tмин > 40 ° C) (Таблица S5).


Студена адаптация в протеини, на последователно и структурно ниво - Биология

Моментна снимка на експериментални данни

  • Метод: & nbspРЕНТГЕНОВА ДИФРАКЦИЯ
  • Резолюция: & nbsp2,09 Å
  • R-стойност безплатно: 0,236 & nbsp
  • Работа с R-стойност: & nbsp0,184 & nbsp
  • Наблюдавана R-стойност: 0,184 & nbsp

Проверка на wwPDB& nbsp & nbsp3D отчет Пълен отчет

Структурни адаптации на студеноактивната цитратна синтаза от антарктическа бактерия.

(1998) Структура & nbsp6: 351-361

  • PubMed: & nbsp9551556 & nbsp Търсене в PubMed
  • DOI: & nbsp10.1016/s0969-2126(98)00037-9
  • Основно цитиране на свързани структури:  
    1A59
  • PubMed Резюме: & nbsp

Структурната основа на адаптирането на ензимите към ниска температура е слабо разбрана. Димерната цитрат синтаза е използвана като моделен ензим за изследване на структурната основа на термостабилността, като структурата на ензима от организми, живеещи в местообитания при 55 градуса С и 100 градуса С, е била предварително определена.

Структурната основа на адаптацията на ензимите към ниска температура е слабо разбрана. Димерната цитратна синтаза е използвана като моделен ензим за изследване на структурната основа на термостабилността, като структурата на ензима от организми, живеещи в местообитания при 55 градуса С и 100 градуса С, е предварително определена. Тук изследването се разширява, като включва цитратна синтаза от антарктическа бактерия, което ни позволява да изследваме структурната основа на студената активност и термостабилността в целия температурен диапазон, през който е известно, че животът излиза.


ОБЩИ ВЪПРОСИ ЗА БИОЛОГИЯ

1. Спирална/спирална форма толкова компактна
2.Молекулата е неразтворима, така че осмотично неактивна (не влияе на водния потенциал)
3. Разклонен, така че глюкозата е лесно достъпна от ензими, за да се разгради за дишане
4. Голяма молекула, така че не може да напусне клетката/напречната клетъчна повърхност
мембрана

2. свързани чрез кондензация за образуване на гликозидна връзка

4. & quotflipping over & quot на алтернативни молекули

5. водородни връзки, свързващи дълги прави вериги

6. целулозата прави клетъчните стени здрави

7. може да устои на тургорно налягане/осмотично налягане

8. връзка трудно се разрушава

2. Свързани чрез пептидни връзки

3. Които се образуват от конденз

4. Първичната структура е от порядъка на аминокиселините

5. Вторичната структура е сгъване на полипептидна верига поради водородна връзка

6. Третична структура е 3-D сгъваема поради водородна връзка и йонна / дисулфидна
облигации

2. Разбита в едноетапна реакция, която гарантира, че енергията е налична бързо

3. Фосфорилира веществата, за да ги направи по -реактивни

НЕ НАМАЛЯВАЩА ЗАХАР
1. Направете тест на Бенедикт и останете сини/отрицателни
2. Вари се с киселина, след което се неутрализира с алкали
3. Загрейте с Бенедиктовото и стане червено/оранжево (утайка)

2.(Предизвиква) промяна в аминокиселинната последователност

3. Мутациите се натрупват с течение на времето

4. Повече мутации / повече разлики (в аминокиселина / основа / нуклеотидна последователност / първична)
структура) между отдалечено родствени видове
ИЛИ
Малко(повече) мутации/разлики (в аминокиселина/база/нуклеотидна последователност/първична структура) в
тясно свързани видове

НАТРИЕВИ ЙОНИ
1. Съвместен транспорт на глюкоза/аминокиселини (в клетките)
2. (Тъй като) натрият се изнася чрез активен транспорт/натриево -калиева помпа
3. Създава градиент на концентрация/дифузия на натриеви йони
4. Влияе на потенциала на осмоза/вода

Активното място е гъвкаво и усилвателят може да се формира около субстрата

2. Активният сайт само допълва малтозата

3. Описание на индуцираното прилягане

4. Ензимът е катализатор, който понижава енергията на активиране, необходима за реакцията

(Конкурентно инхибиране),
2. Инхибиторът има подобна форма на субстрата
3. Свързва се с активното място (на ензима)
4. Инхибирането може да бъде преодоляно чрез добавяне на повече субстрат

Поддържане на ниска концентрация на натрий в епителната клетка в сравнение с
лумен

Глюкозата преминава в епителната клетка с натрий
Чрез протеин носител/канал
Глюкозата преминава в кръвта

2. Ендопептидазите разграждат полипептидите на по-малки пептидни вериги

3. Екзопептидазите премахват крайните аминокиселини

2. Много митохондрии произвеждат АТФ за активен транспорт
3. Протеини носители, присъстващи за активен транспорт

4. Канал / протеини носители за улеснена дифузия

5. Съвместният транспорт на натрий и глюкоза, постигнат чрез протеин носител за натрий (йони) и глюкоза

2. Фосфолипид (двуслоен) предотвратява движението/дифузията на полярни/неразтворими в липиди вещества

3. Протеините носители позволяват активен транспорт

4. Канал/носители протеини позволяват улеснена дифузия/ко-транспорт

5. Формата/Зарядът на канала/носителя определя кои вещества се движат

6. Броят на каналите/носителите определя колко движение

7. Площта на мембраната определя колко дифузия/движение

2. Дълга / голяма молекула, така че може да съхранява много информация

3. Спирала / навита толкова компактно

4. Базовата последователност позволява съхраняването на информация (образуване на протеин)

5. Двойно верижни, така че репликацията може да се случи полуконсервативно, както съществува
нишките могат да действат като шаблони чрез допълващо сдвояване на основите

2. сдвояване на база, държано заедно чрез водородни връзки

3. водородните връзки слаби, така лесно се скъсват, което позволява на нишките да се разделят

4. основите са изложени и действат като шаблон
5. A с T, C с G

2. Разкъсва водородните връзки между двойките основи, излагайки ги

3. Само една ДНК верига действа като матрица

4. РНК нуклеотиди, привлечени от открити основи

5. (Привличане) според правилото за базово сдвояване (A-U & amp C-G)

6. РНК полимераза свързва РНК нуклеотидите заедно, за да образува пре-мРНК

3. молекулите на тРНК носят аминокиселини в рибозомата

4. За специфична аминокиселина съществува специфична молекула на тРНК

5. Антикодон на тРНК, комплементарен на кодона върху тРНК

6. Пептидни връзки се образуват между съседни аминокиселини

7. tRNA се отделя и напуска, за да събере друга аминокиселина

2. Промяна в аминокиселинната последователност

3. Това променя позицията на водородните/йонни/дисулфидни връзки

2. хромозоми, направени от две идентични хроматиди, поради репликация в интерфаза

3. хромозомите се преместват в екватора на клетката

4. Хромозомите се прикрепят към отделни влакна на вретеното

5. Влакната на шпиндела се свиват и центромерите се разделят

6. Сестринските хроматиди се преместват на противоположни полюси

7. Всеки полюс получава цялата генетична информация

2. Хромозомите се свързват в своите хомоложни двойки

3. Кръстосването става между хромозомите, чрез образуване на хиазма

4. Хромозомите се свързват към вретеновите влакна, чрез там центромери

6. Хомоложните хромозоми се преместват на противоположни полюси

2. Самостоятелен асортимент (сегрегация на хомоложни хромозоми) в мейоза I

3. Независим асортимент (сегрегация на хроматиди) при мейоза II

+ Всякакви три от:
4. Кара индивидите да имат различни адаптации, което прави някои по-добре адаптирани

7. Те предават гена / алела

2. Вземете тънък участък от растителна тъкан и поставете върху предметно стъкло

3. Оцветете с йод в калиев йодид.

2. Филтрирайте, за да премахнете големи отломки / цели клетки

3. Използвайте изотоничен разтвор, за да предотвратите увреждане на митохондриите/органелите

4. Дръжте на студено, за да намалите щетите от ензими/ използвайте буфер, за да предотвратите денатурация на ензима

5. Центрофугирайте с по -ниска скорост, за да отделите ядра / фрагменти от клетки / тежки органели

2. Малки / неполярни / липидноразтворими молекули преминават през фосфолипиди / двуслой
ИЛИ
Големите / полярни / водоразтворими молекули преминават през протеини

3. Водата се движи чрез осмоза от висок воден потенциал към нисък воден потенциал

4. Активен транспорт срещу градиента на концентрацията

5. Активният транспорт/улеснената дифузия включва протеини/носители

6. Активният транспорт изисква енергия/АТФ

2. Не може да премине липидния двуслоен слой

3. Хлоридни йони, транспортирани чрез улеснена дифузия, използвайки
канален/носещ протеин

4. Кислородът не е зареден/неполярен

2. Много митохондрии произвеждат АТФ / освобождаване или осигуряват енергия за активни
транспорт

3. Протеини носители за активен транспорт

4.Канал/носещи протеини за улеснена дифузия

5. Съвместен транспорт на натриеви йони и глюкоза, използвайки протеин симпорт / носител

2. Активно включва производството на антитяло от плазмени клетки / клетки с памет

3. Пасивното включва антитела, въведени в тялото отвън

4. Активен в дългосрочен план, тъй като антитялото се произвежда в отговор на антигена

5. Пасивно краткосрочно, тъй като даденото антитяло се разгражда

2. Погълнат / погълнат патоген

3. Затворени във вакуола, образуващи фагозома

4. Вакуолни сливания с лизозома

5. Лизозомата съдържа ензими, които се изпразват във вакуолата

Плазмените клетки произвеждат антитела

2 антиген се свързва с комплементарни рецептори на В лимфоцит

3 лимфоцит се активира

4 (В) лимфоцити се възпроизвеждат чрез митоза

2. Антигенът се показва върху антиген-представящи клетки (макрофаги)

3. Помощни Т-клетки с комплементарен рецепторен протеин се свързват с антигена

4. Помощната Т -клетка стимулира В -клетките

5. С комплементарното антитяло на повърхността му

6. В клетката секретира големи количества антитяло

3. При второ излагане клетките на паметта произвеждат стават активни и произвеждат антитела

4. Бързо произвежда антитела/ произвежда повече антитела

2. Формата на третичната структура на мястото на свързване

3. В допълнение към антигените

Ензимът използва HIV РНК, за да направи ДНК копие

ДНК се присъединява към ДНК/хромозома на клетката гостоприемник

ДНК, използвана за направата на РНК копия на HIV

И ХИВ капсидни протеини/ензими

Сглобяване на нови вирусни частици

2. Сега вентрикулът има по -високо налягане от атриума (поради пълнене / свиване).
Това води до затваряне на атриовентрикуларните клапи

3. Вентрикулът има по -високо налягане от аортата, което води до отваряне на полумесечна клапа

4. Това води до по-високо налягане в аортата, отколкото в вентрикула (като сърце
отпуска), което води до затваряне на полулунната клапа

2. Едноклетъчни дебели стени - намалява разстоянието на дифузия

3. Сплескани (ендотелни) клетки – намалява дифузионното разстояние

4. Фенестрации - позволява преминаване на големи молекули

5. Малък диаметър / тесен - придава голяма площ на обем / къса
дифузионно разстояние

6. Тесен просвет - намалява дебита, като дава повече време за дифузия

2. Разтворимите молекули в течности и усилватели изпадат

3. Протеините и големи молекули остават отзад

4. Това намалява водния потенциал

5. Водата се връща обратно във венозния край на капиляра
чрез осмоза

2. пода на устата е спуснат

3. навлиза вода поради понижено налягане и усилвател
увеличен обем

4. устата се затваря, оперкулумът/оперкуларната клапа се отваря

5. повдигането на пода води до повишено налягане и усилване на намален обем

хрилни плочи или вторични ламели

голям брой капиляри -& gt за премахване на кислорода / за поддържане на градиент

тънък епител -& gt къс път на дифузия

промени в налягането -& gt за вкарване на повече вода / за поддържане на градиента

2. Стените на алвеолите са тънки, за да осигурят кратък път на дифузия

3. Капилярните стени са тънки между алвеолите, така че осигурява кратък път на дифузия

4. Стените на капилярите/алвеолите имат сплескани клетки

5. Клетъчна мембрана, пропусклива за газове

6. Много кръвоносни капиляри осигуряват голяма повърхност

7. Междуребрени мускули и мускули на диафрагмата, използвани за вентилация на белите дробове, за да се поддържа дифузия
градиент

8. Широка трахея и усилване на бронхите/бронхиолите за ефективен въздушен поток


МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Примерна колекция

Пареледон sp., Robson 1932, е събран през януари от под леда в станция Макмърдо, Антарктида. Събраният образец е любезно предоставен от д-р Крис ДеВрис. Октопод бимакулат, Verrill 1883, е събрана от гмуркане SCUBA от Wrigley Marine Lab, Two Harbours, остров Каталина, Калифорния, САЩ. Октопод дефилипи, Vérany 1851, е събрано от Рио Гранде, Пуерто Рико. Octopus digueti, Perrier и Rochebrune 1894, е събрана от залива Сан Лукас, Санта Розалия, Южна Калифорния, Мексико. Bathypolypus arcticus (Prosch 1847) и Benthoctopus piscatorum (Verrill 1879) са събрани край северния бряг на архипелага Свалбард, Норвегия. От всички проби звездните ганглии бяха разчленени, запазени в РНК по -късно (Ambion, Austin, TX, САЩ) и замразени при –80 ° C.

Молекулярно клониране

Общата РНК се екстрахира от всеки звезден ганглий с помощта на комплект RNAqueous-Micro (Ambion) и се използва като шаблон за синтез на кДНК с комплекта за синтез на първа верига на cDNA SuperScript III (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, САЩ). α-субединиците Na + /K + -ATPase с пълна дължина бяха амплифицирани чрез PCR с помощта на Taq полимераза (за O. bimaculatus и Пареледон sp.) или Phusion полимераза (O. defilippi, O. digueti, B. arcticus и B. piscatorum) и праймери на базата на UTR на a Loligo opalescens Na + /K + -ATPase а -субединичен клон [GenBank: EF467998 (Colina et al., 2007)]. За да се получи консенсусна последователност, множество клонове на кДНК бяха секвенирани до завършване.

Функционален израз в Ксенопус ооцити

Кодиращият регион на Na + /K + -ATPase α-субединицата за всеки вид беше клониран в Ксенопус експресионен вектор pBSTA (Liman et al., 1992) и използван като шаблон за синтез на cRNA с комплекти, базирани на T7 промотор (mMessage mMachine T7 Ultra, Ambion или mScript mRNA производствена система, Epicentre, Madison, WI, USA). cRNA също е направена за естествената β-субединица на системата от гигантски аксони на калмари [GenBank: EF467996 (Colina et al., 2007)]. Ооцитите се инжектират с 80 ng от еквимоларна смес от α- и β-субединици cRNAs. Експериментите бяха проведени 3-4 дни след инжектирането. Ооцитите се отстраняват хирургично и се дефоликулират чрез ензимно третиране с колагеназа. Ооцити от етап V и VI бяха избрани за инжектиране. След инжектирането, ооцитите се поддържат в продължение на 3-4 дни при 18 ° C в разтвор на ND-96 (в mmol l -1: 96 NaCl, 2 KCl, 1.8 CaCl2, 1 MgCl2 и 5 Hepes рН 7.6). Непосредствено преди записването, ооцитите се зареждат с Na + в продължение на 45 минути в разтвор за зареждане с Na + (в mmol l -1: 100 Na-глутамат, 2,5 Na-цитрат и 5 Hepes рН 7,5) (Rakowski et al., 1991 ).

Експериментални решения за електрофизиологични измервания

Извънклетъчните разтвори, използвани за оценка на функцията на помпата по време на това изследване, са 5 mmol l –1 K + разтвор (в mmol l –1: 100 Na-глутамат, 5 K-глутамат, 5 BaCl2, 2 NiCl2, 5 хепес, 2 MgCl2 и 0,3 нифлуминова киселина) и разтвор без К + (същия като 5 mmol l –1 K + разтвор, с изключение на 5 mmol l –1 н-метил d -глюкамин е заместен с 5 mmol l -1 K +). Ouabain беше използван при концентрация от 100 μmol l –1 и в двата разтвора без 5 mmol l –1 K + или K +. Когато се използва техниката „отрязана ооцитна вазелинова празнина“ (виж по-долу), вътрешният разтвор съдържа (mmol l -1): 80 Na-глутамат, 20 TEA-глутамат, 10 MgSO4, 10 Hepes, 5 EGTA и 5 MgATP. За да се получи електрически достъп до вътрешността, ооцитите се проникват с 0,2% (w/v) сапонин във вътрешния разтвор. РН на всички експериментални разтвори се регулира до 7,5 с н-метил d-глюкамин при стайна температура и беше определено да варира с 0,2 единици между 30 и 5°С.

Нива на експресия на Na + /K + -АТФаза

Нивата на експресия се оценяват като общия чувствителен към уабаин ток, записан от цели ооцити, експресиращи която и да е от конструкциите. Ооцитите се захващат с помощта на конвенционален усилвател за напрежение с два микроелектрода (GeneClamp 500B Axon Instruments, Фостър Сити, Калифорния, САЩ). Аналоговите сигнали бяха филтрирани при 1 kHz и цифровизирани с помощта на A/D конвертор SBC6711 на Innovative Integrations (Simi Valley, CA, САЩ). Софтуерът GPATCH беше любезно предоставен от д-р Франциско Безанила. Ооцитите се държат при 0 mV и помпите се активират напълно с разтвора 5 mmol l -1 K +, последвано от добавяне на уабаин. Експресията на ендогенна помпа се записва от неинжектирани ооцити. Всички експерименти за оценка на нивото на експресия се провеждат при стайна температура (∼22°C).

Изследвания на зависимостта от напрежението и скоростта на оборота

Експериментите с зависимостта от напрежението и скоростта на текучеството се извършват с помощта на техниката „отрязана ооцитна вазелинова празнина“ (Taglialatela et al., 1992). Ооцитите бяха захванати с високопроизводителна скоба за ооцити Dagan CA-1B (Dagan Corporation, Минеаполис, Минесота, САЩ), вземане на проби изключително от животинския полюс, за да се сведе до минимум сигналът от ендогенни помпи (Holmgren and Rakowski, 1994). В тези експерименти ооцитите се държат при 0 mV и се пристъпват към различни потенциали, вариращи от –200 до +50 mV с стъпки от 10 mV. Дължината на импулсите е 35 или 60 ms. Иновационна интеграция SBC6711 A/D платка със софтуер GPATCH беше използвана за управление на протоколи за напрежение и дигитализиране на аналогови сигнали. Записите на бавна времева база („записи на диаграми“) бяха събрани с помощта на платка MiniDigi 1A и софтуер AxoScope 9.0 (Axon Instruments). Сигналите се получават при 100 kHz и се филтрират при 10 kHz. Вътреклетъчното напрежение се измерва с пипета с 0,2-0,3 MΩ, напълнена с 1 mol l-1 NaCl, и мостове, пълни с 3 mol l-1 Na-MES (4-морфолинетансулфонова киселина натриева сол) в 3% (w/v) агароза. Във всички експерименти стабилността на записите се оценява чрез времеви контроли, получени от разликата между ток -напрежение (азV) отношения, получени при същите експериментални условия на еквивалентни интервали от време. Тези експерименти са проведени при ∼22 ° C.

Зависимостта от напрежението на Na + /K + -АТФазния ток беше оценена чрез изпълнение на протокола за напрежение в 5 mmol l –1 K + разтвори преди и след добавянето на 100 μmol l –1 ouabain. Разликата между тези записи даде чувствителния към уабаин ток на помпата. Стационарният ток, генериран при всяко напрежение, беше измерен и начертан. Потенциалът за полумаксимален ток (средна точка ± s.e.m.) за всяка конструкция Na + /K + -ATPase се измерва от азV график за всеки експеримент и след това осреднено. Значимостта на средните стойности е тествана с помощта на две популации T-тест с α = 0,05.

Температурна чувствителност на скоростта на оборот на Na + /K + -АТФаза

Температурната чувствителност на помпите беше изследвана в цели ооцити, използвайки двумикроелектродна скоба за напрежение. Ооцитите се държат при 0 mV в камера, където температурата се контролира с помощта на устройства на Пелтие. Помпите се активират с 5 mmol l –1 K + при 30°C. След като се активира напълно, температурата постепенно се понижава до ∼5 ° C и след това се връща до 30 ° C. След това този протокол се повтаря в присъствието на уабаин за оценка на течовете на течове. По време на текущите записи температурата се записва едновременно чрез поставяне на термодвойка непосредствено до ооцита. Изходът на термодвойката беше калибриран и събран при 1 kHz онлайн. Температурно-зависимият теч беше незначителен в сравнение с тока на помпата. За всеки експеримент количеството на уабаин-чувствителния ток при всяка температура се нормализира до стойността при 22°C. Нормализираните стойности, получени от индивидуални експерименти, след това бяха осреднени за множество ооцити. Оценки за количеството ендогенен поток на ток при всяка температура бяха направени, като се използва величината на ендогенния ток в неинжектирани ооцити при 22 ° C и температурната чувствителност на ендогенния ток (виж допълнителен материал, фиг. S1). След това ендогенните стойности се изваждат от данните за инжектираните с клонинг ооцити. Тези стойности (средно ± s.m.) бяха преобразувани в оборотни норми въз основа на оборотите, определени при 22 ° C. В някои случаи данните се нормализират до текущата стойност при 28 ° C.


Фигура S1. ΔB'-стойности на психрофилна серинова протеаза (PDB:

Допълнителен файл 1: 1ELT) и мезофилна серинова протеаза (PDB:1ЕАИ) на всяка позиция на аминокиселина в подреждане по двойки. Графика на ΔB'-стойности от сдвоен протеин 1ELT и 1EAI. Най -отгоре е вторичната структура на психрофилния ензим. Един видим твърд регион от (аминокиселини 1-110) и един гъвкав регион (аминокиселини 111-235) се получават, като се използва методологията на ΔB'-стойността. Фигура S2. Таблица с броя на позициите, открити във всяка вторична структура в психро/мезофилна двойка. Таблица с броя на позициите, открити във всяка вторична структура в 20-те психро/мезофилни двойки. Фигура S3. Графика на заровени, кристалографски води на всяка психронно/мезофилна двойка. График на заровени кристалографски води от 20-те психро/мезофилни двойки. В случаите, когато в кристалната структура присъстват множество вериги, стойностите се осредняват. Забележка: 1a59 не съдържа докладвани кристалографски води. (PDF 1 MB)


Гледай видеото: ZÜLALLARIN QURULUŞU VƏ FUNKSİYASI. (Декември 2022).