Информация

Има ли биологична или техническа причина за 40 Ct прекъсване в анализа за откриване на нуклеинова киселина?

Има ли биологична или техническа причина за 40 Ct прекъсване в анализа за откриване на нуклеинова киселина?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Разработих и утвърдих модифициран тест за нуклеинова киселина (NAT) за откриване на SARS-COV-2, използвайки RT-PCR в реално време (известен още като rRT-PCR, известен още като RT-qPCR). Моят анализ не е за диагностична употреба, а за скрининг на донори (които са сходни, но достатъчно различни, за да изискват независими валидации). Етапът на PCR е достатъчно чувствителен, за да открие приблизително едно копие на ген за реакция, но не винаги с под 40 Ct (което може или не може да бъде проблем).

Виждате ли, протоколът е изграден около комплекти праймер/сонда, публикувани за първи път от американския CDC, така че първоначално приех критериите в протокола на CDC EUA, които предвиждат Ct стойност <40,00, за да се класифицира целта като положителна. Това означава, че усилването със стойност на Ct от 39,99 се класифицира като положително, докато почти идентична крива на усилване с Ct от 40,01 се класифицира като отрицателна. Разглеждайки подобни NAT за диагностика in vitro, повечето използват същата граница. Изглежда доста често срещано при тестове за други патогени.

За малко предистория, използването на ограничение като това намалява потенциала за субективни грешки при класификацията между потребителите, като осигурява качествена, двоична интерпретация за привидно количествено отчитане на данни. Компромисът е, че неправилно зададеното прекъсване може да доведе до систематични грешки в класификацията, които са универсални за всички потребители. Всеки, който е използвал един от протоколите, базирани на CDC сонди, е забелязал, че двата комплекта праймери/сонди, насочени към вирусен геном на SARS-CoV-2, не се представят еднакво добре. Обичайно е резултатите от тестовете да се класифицират като „неубедителни“, когато едната вирусна мишена е положителна, но другата е „отрицателна“ поради стойността на Ct точно над границата от 40Ct. (Вече настроих своя протокол, за да намаля този вид грешки, но не можах да го премахна напълно).

Докато пиша това за публикуване, се чудя дали би било по -добре (по -честно) да препоръчам прекъсване на Ct, което отразява емпиричния диапазон от стойности на Ct в моите проучвания за валидиране, за разлика от запазването му в някакъв привидно произволен кръг номер (дори и да е почти универсален сред подобни тестове). Това не би променило нито едно от основните констатации, които докладвам (чувствителност, специфичност и т.н.), но би променило някои от числовите стойности. По-важното е, че мисля, че това би могло да помогне за предотвратяване на неправилно класифициране на късно усилващи се проби като отрицателни.

Някой знае ли биологична или техническа причина, поради която този предел не трябва да надвишава Ct 40? Може би това е просто някаква конвенция, която се пренася сляпо; или може би има някаква странност на химията на TaqMan, за да оправдае тази стойност, за която просто не съм наясно.


Това се прави, защото в един момент започвате да усилвате глупостите и не получавате смислен сигнал. Ако (а това най -често не е така) имате идеалното удвояване на вашия ДНК шаблон във всеки цикъл, можете да изчислите с колко малко ДНК започнете, за да го откриете само около цикъл 40 - или обратното: Какво ще направите усилват и виждат като "сигнал" дотогава.

Ако имате шаблони, които винаги наистина идват толкова късно, бих използвал повече ДНК (и вероятно повече РНК за стартиране на rtPCR), докато това дойде поне 2-3 цикъла по-рано и след това направя серийни разреждания на вашия шаблон, за да видя дали този сигнал е истински или не. Ако е така, трябва да видите връзка между Ct и разреждането.

За да направите това, имате нужда от отрицателна контрола, която остава наистина отрицателна, докато се появи сигнал на пробата - което е трудно само по себе си, защото в един момент ще видите някакъв вид самоусилване на праймера. Ако това се случи в същия диапазон като вашата проба, вашият сигнал не може да се използва. Ако по технически причини не могат да се използват други праймери, понякога трябва да се обмисли вложен PCR.

И не на последно място, всички ваши реактиви се разграждат с течение на времето, като ги циклират 40 пъти чрез PCR програмата (също и полимеразата), което влияе върху ефективността на реакцията.