Информация

Топологично свойство на ДНК

Топологично свойство на ДНК


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Четох курс за DNA Supercoiling и се спрях на това определение:

[… ] В случая на ДНК, топологично свойство е това, което не се влияе от усукване и завъртане на оста на ДНК и може да бъде променено само чрез счупване и повторно съединяване на ДНК гръбнака. (Източник)

Не разбрах какво означават, може ли някой да го изясни.


ДНК суперспирирането може да бъде описано числено чрез промени в свързващия номер $ L_k $, това е най -описателното свойство на суперспирираната ДНК.

Числото на свързване $L_k$ е еквивалентно на сумата от $Tw$, което е броят на завъртанията или завоите на двойната спирала, и $Wr$, което е броят на намотките или гърчи се.

$$L_k = Tw + Wr$$

[… ] Ако има затворена молекула на ДНК, сумата от $Tw$ и $Wr$ или свързващото число не се променя. […] Тъй като свързващият номер L на суперспиралната ДНК е броят пъти, в които двете нишки се преплитат (и двете нишки остават ковалентно непокътнати), L не може да се промени.

Не знам как да го обясня повече, но мисля основната идея е представена на изображението по-долу.

Редактиране:

От ДНК топология: Основи:

Има две важни характеристики на $ L_k $:

  1. $ L_k $ винаги е цяло число.
  2. $L_k$ не може да бъде променен от никаква деформация на ДНК вериги, тоест е така топологически инвариантно. Единственият начин да го промените е да въведете прекъсване в една или и двете нишки на ДНК, да завъртите двете нишки на ДНК една спрямо друга и да запечатате прекъсването. Точно това е ролята на ДНК топоизомеразите.

Свързан въпрос: Причина за образуването на положителни супермотки по време на репликация/транскрипция на ДНК.

Източници: ДНК суперспирал и ДНК топология.


Топологични структури в изчислителната биология

Явленията, заобикалящи и произтичащи от топологичните характеристики на нуклеиновите киселини и метричната геометрия на протеините, са в основата на много фундаментални въпроси в молекулярната биология. Инструментите на нискоизмерната топология и теорията на възлите са силно видими при предоставянето на описания на явления, свързани със суперсвиване, възли и катенация в нишки на ДНК и РНК. Много други предизвикателства в биологията изискват качествените инструменти, които топологията предоставя. Въпросите в определянето на структурата на протеина и структурната биология изискват дешифриране на връзката между локалните геометрични свойства и глобалните топологични характеристики, като например модели на сгъване. Освен това, наскоро имаше завладяваща работа за разбиране на по -широкото биологично въздействие и последиците от топологичните характеристики на макромолекулите. На по-високо ниво на абстракция има развиваща се работа за прилагане на топологични идеи за изследване на свойствата на мрежите за регулиране на гени и графиките за взаимодействие на протеини, голяма част от които включва топологични методи. Математиката на геномните данни е в процес на интензивно развитие, което би се възползвало от качествени, стабилни инструменти.

Въпреки че в биологичната общност е имало бързо възприемане на определени топологични идеи (например работата по свързване на числа и сгъване в ДНК вериги), увеличаването на ширината и дълбочината на това взаимодействие изисква смесване на изследователски общности, които този семинар ще осигури .


ДНК-базиран материал с настройваеми свойства

Вляво, моментна снимка на симулираната система - плътен разтвор на суперспириран плазмид. Вдясно по -подробен изглед на суперспирираната течност, показваща заплитания между молекулите.

Newswise — Докато ДНК често се идеализира като "молекула на живота", тя също е силно усъвършенстван полимер, който може да се използва за материали от следващо поколение. Освен факта, че тя може да съхранява информация, допълнителни очарователни аспекти на ДНК са нейните геометрични и топологични свойства, като възли и супер навиване. Наистина, много подобно на усукан телефонен кабел, ДНК често се намира навита в бактерии и други клетки и дори във вируси. Сега сътрудничество на учени от университетите в Единбург, Сан Диего и Виена започна да използва тези свойства, за да създаде „топологично регулируеми“ комплексни флуиди и меки материали на базата на ДНК с потенциални приложения в доставката на лекарства и регенерацията на тъканите, както е публикувано в Science Advances .

Добре известната двойна спирална форма на ДНК има дълбоки последици за нейното поведение. Линейна молекула на ДНК, която е молекула на ДНК с два края, може свободно да се усуква и завърта. Обратно, свързването на двата края за образуване на ДНК кръг води до това, че всяко над или под усукване на двойната спирала остава "топологично заключено", т.е. Над или под усукване имат интересни последици за това как молекулите на ДНК се подреждат в пространството и по-специално, те се навиват и закопчават върху себе си много подобно на стар телефонен кабел в така наречените свръхнавити конформации (фиг. 1). Изкривяването на ДНК облекчава стреса от свръх/под усукване и по този начин намалява общия размер на молекулата. Поради тази причина се смята, че суперсвиването е естествен механизъм, използван от клетките за пакетиране на генома им в малки пространства. Докато по -малкият размер естествено води до по -бърза дифузия на ДНК молекули в разтвор, напр. във вода или през гел пори, поради по-ниското съпротивление, това добре разбрано поведение не се случва, когато много ДНК молекули са опаковани и заплетени като спагети в купа.

„Извършихме мащабни компютърни симулации на плътни разтвори на ДНК молекули с различна степен на суперсвиване и открихме няколко изненадващи резултати.“, Обяснява Ян Смрек от Виенския университет, първият автор на изследването. „За разлика от разредения случай, колкото по-супер навити са ДНК пръстените, толкова по-голям е техният размер. Тъй като молекулите трябва да се избягват една друга, техните форми приемат силно асиметрични и разклонени конформации, които заемат по-голям обем от техните не-супернавита аналози. Интригуващо и противно на очакванията, "по -големите молекули на ДНК все още дават по -бърза дифузия." По -бързата дифузия означава, че разтворът има по -нисък вискозитет.

Свръхмотаните молекули на ДНК, които се срещат естествено в бактериите, са известни като плазмиди. In vivo клетките имат специални протеини, наречени топоизомераза, които могат да намалят количеството на свръхнавиване в плазмидите. „Благодарение на тези протеини &mdash, които могат да бъдат пречистени и използвани в лабораторията &mdash, ние сме в състояние да контролираме степента на свръхнавиване в заплетени ДНК плазмиди и да изследваме тяхната динамика с помощта на флуоресцентни багрила. Бяхме изумени да открием, че наистина ДНК плазмидите, които са били третирани с топоизомераза, а оттам и с ниско суперсвиване, са по -бавни от техните силно суперспирални аналози. " обяснява Рей Робъртсън Андерсън, която ръководи експериментите в университета в Сан Диего.

За да обяснят изненадващо по -бързата динамика, учените използваха мащабни симулации на суперкомпютри, за да определят количествено колко са заплетени молекулите в разтворите. Въпреки че е известно, че пръстен с форма на пръстен, доста подобен на кръгова ДНК плазмид & mdash, може да бъде нарязан от друг пръстен, което означава, че последният може да пробие през окото на първия, не е известно как този тип заплитане влияе върху движението на суперсвита ДНК. Благодарение на симулациите, учените установиха, че висока степен на суперсвиване намалява проникващата площ на всяка молекула, което води до по -малко нишки между плазмидите и в крайна сметка дава разтвор с по -нисък вискозитет. Независимо от това, плазмидите все още могат да се увиват един около друг и да ограничават движението един на друг без нишки. И все пак суперсвиването втвърдява конформациите и по този начин ги прави по -малко склонни да се огъват и преплитат плътно, което намалява и този тип преплитане.

Давиде Мичилето от Университета в Единбург заключава: „Не само открихме тези нови ефекти в симулациите, но също така демонстрирахме тези тенденции експериментално и разработихме теория, описваща ги количествено. Чрез промяна на суперспирала можем да настроим вискозитета на тези сложни течности при Ще разберем много по -добре връзката между адаптивната геометрия на молекулите и получените свойства на материала.Това е не само вълнуващо от фундаментална гледна точка, но и обещава полезни приложения.С помощта на специални ензими, като топоизомеразата, човек може да проектира превключващи се меки материали на базата на ДНК с настройваеми свойства. "


МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Изучавахме системи, съставени от М (от 2 до 20) свободно съединени равностранни многоъгълници, всеки от които има н (от 4 до 20) сегменти с дължина л ограничен в сфера с радиус 2 л . Всеки сегмент е цилиндър с твърда сърцевина с радиус 10 −5 л (т.е. разстоянието между два последователни сегмента трябва да бъде по-голямо от 2 × 10 –5 л ). Този много нисък ефективен диаметър на практика премахна изключените обемни взаимодействия между сегментите и беше изчислено необходим за контролиране на топологията на симулираните полигони. Моделираната система може да изглежда твърде малка, за да отразява опаковката на хроматин в еукариотни ядра. Въпреки това, с настройката, при която моделираме 20 свободно съединени равностранни многоъгълника, всеки съставен от 20 сегмента и опакован в сферата с диаметър от четири сегмента, ние се доближаваме отблизо до ситуацията в ядрата на дрождите. Оценките на дължината на статистическия сегмент на хроматиновите влакна варират между 130 и 270 nm, докато оценките на плътността на нуклеозомите варират от 3,6 до 6 на 11 nm (25). Следователно, ако приемем, че дължината на статистическия сегмент на хроматина е 250 nm, всеки статистически сегмент ще съдържа ∼115 нуклеозоми, което ще се превърне в около 23 000 bp. В резултат на това всеки многоъгълник, съставен от 20 статистически сегмента, съответства на 460 000 bp (това е добър размер за дрождова хромозома, тъй като те варират от 200 до 2200 kb), докато всички 20 моделирани вериги съответстват на 9 200 000 bp, опаковани в сфера с диаметър около 1 µm. Така нашите симулационни системи се доближават до ситуацията в дрождевите ядра, които имат диаметър около 1,5 µm и съдържат 24 000 000 bp (на диплоиден геном). Всъщност плътността на моделирания хроматин в нашата система леко надвишава тази в ядрата на дрождите.

За извадка на конфигурационното пространство използвахме алгоритъма на Монте-Карло, описан в (26, 27). Използвахме само ходове на въртене на коляновия вал, където произволно избрани подвери се въртят по линията, свързваща първия и последния връх на подверигата. В случай на фантомни вериги, ъгълът на въртене беше произволно избран между - π и π с равномерно разпределение. В случая на нефантомните вериги първо определихме диапазона на ъглите на въртене, така че подверигата да не пресича нито един друг сегмент по време на въртенето. След това ъгълът на въртене беше произволно избран в този диапазон с равномерно разпределение. Както за фантомни, така и за нефантомни вериги не приехме нови конфигурации, произтичащи от въртенето на коляновия вал, което доведе до поставянето на който и да е връх на веригата извън ограничителната сфера. За всяка симулация стартирайте с определен брой полигони М и дадена дължина на веригата н , ние сме разработили системата за 2 × 10 9 завъртания на коляновия вал. Първите 1 × 10 6 конфигурации не бяха въведени в статистиката.

За да генерираме първоначални конфигурации, започнахме с всеки полигон в обикновена N-gon конфигурация, подредени един върху друг. Към центъра на сферата добавихме енергия, дадена от сумата на квадратното разстояние от всички върхове. Алгоритъмът на Monte-Carlo Metropolis с нефантомни вериги, описан по-рано, след това беше използван с бавно намаляваща температура, докато всички полигони се окажат вътре в сферата (вижте фигура S1A). Обърнете внимание, че първоначалните конфигурации, получени с тази процедура, са незавързани и некатенирани.

Проверихме дали достигнатото равновесно състояние е независимо от първоначалните условия, като извършихме няколко симулационни цикъла, при които първоначалните конфигурации бяха изградени от силно уплътнени отделни полигони, добре отделени един от друг (Фигура S1B).

Тук е важно да се добави, че симулациите на Монте -Карло, като тези, използвани от нас, не са подходящи за проследяване на еволюцията или кинетиката на изследваната система. Въпреки това, след достатъчно време за уравновесяване, генерираните конфигурации изваждат по много ефективен и непредубеден начин конфигурационното пространство, достъпно за моделирана физическа система, като молекули на ДНК или хроматинови влакна (26, 28, 29). Освен това този тип симулации позволяват много по-добро характеризиране на равновесието, отколкото симулационните подходи, които позволяват да се проследи еволюцията на системата и по този начин да се даде информация относно кинетиката.


Въведение

Моделът на репликон е първият опит да се обясни как ДНК репликацията се регулира в бактериите (Яков и др, 1963). Първоначално формулиран въз основа на наблюдения, направени в Ешерихия коли, по -късно се разширява до плазмиди, фаги и хромозоми на всички прокариоти и еукариоти. Четиридесет години по-късно ключовите аспекти на модела на репликона все още са верни и през това време той вдъхнови множество значими открития (Jacob, 1993 Nordstrom, 2003). Накратко, моделът разработи темата за единиците на репликация, която авторите нарекоха репликони. Твърди се, че регулирането на репликацията на ДНК включва поне два елемента: специфичен протеин, инициатор и целева ДНК последователност, репликатор, днес известен като „произход на репликация“. Само няколко години след като Франсоа Джейкъб, Сидни Бренер и Франсоа Кузен пуснаха модела репликон на среща в Колд Спринг Харбър (Джейкъб и др, 1963 ), Gerome Vinograd и сътрудниците откриват, че кръговият геном на полиома вируса е свръхнавит ( Vinograd и др, 1965). Това наблюдение по-късно е разширено до почти цялата кръгова дуплексна ДНК (Cozzarelli, 1980). Supercoiling, което буквално означава навиване на намотка, е топологично свойство на молекулите на ДНК, при което двойната спирала се усуква около собствената си ос в триизмерно пространство (Bowater, 2002). Откритието, че ДНК е суперспирирана, заедно с откриването на топоизомерази (Wang, 1971) отвори изцяло ново поле в молекулярната биология: ДНК топология (Wang, 2002).

Основната цел на този преглед е да обобщи това, което е известно за топологичните промени, които се случват като реплика на репликон. Ние се фокусираме върху малки бактериални плазмиди, тъй като повечето от проучванията, които се занимават с този проблем, са използвали pBR322 и други малки производни като моделна система. Трябва да се отбележи обаче, че не винаги е възможно да се екстраполират наблюденията, направени върху малки плазмиди, към бактериални или еукариотни хромозоми. Плазмидите са малки топологични домейни, които не отразяват непременно условията на големите домени на хромозомите на прокариотите и еукариотите (Higgins & Vologodskii, 2004).

Грунд за ДНК топология и ДНК топоизомерази

За една ДНК молекула се казва, че е отрицателно (-) свръхнавита, когато свързващото число (минималният брой пасажи, необходими на една верига през друга за разделянето им) е по-нисък, отколкото в отпуснатата кръгова ДНК със съответния размер. И двете in vivo (Bliska & Cozzarelli, 1987) и инвитро ( Беднар и др, 1994), (-) е известно, че свръхнавитите бактериални плазмиди приемат дясна преплетена конфигурация, в която дуплекс-дуплексните пресичания имат (-) знак (вижте Фигура 1A, B за обяснение). В еукариотните клетки (-) суперсвиването е ограничено от лявата намотка на ДНК около нуклеозоми, което води до тороидална намотка, при която дуплекс-дуплексните кръстоски също имат знак (-) (Фигура 2В). Както е показано на Фигура 1А, разделянето на локални нишки чрез ДНК хеликаза в ( -) свръхмотани ДНК молекули първоначално води до отпускане на ( -) суперспиралиране, докато по -нататъшното разделяне води до натрупване на положително (+) суперспиралиране. Възникващият усукващ стрес се противопоставя на по -нататъшното действие на хеликаза и са необходими топоизомерази за по -нататъшно разделяне на нишките на ДНК.

Топоизомеразите са ензими, които взаимно преобразуват различни топологични състояния на ДНК. Те се разделят на ензими тип I и тип II, които преходно разцепват съответно едната или двете вериги на ДНК. Топоизомеразите от тип I се разделят допълнително на два подтипа: А и В. Ензимите, принадлежащи към подтип А, имат сложен механизъм на действие, който включва преминаване на неразрязаната верига през ензимно-мостовото разцепване на другата верига. Интересното е, че докато действат върху ДНК с прорези или с едноверижни области, топоизомеразите от тип IA могат да разцепят непрекъснатата верига и да позволят преминаването на сегмент от дуплексната ДНК от същата или друга ДНК молекула през отрязаната нишка. Топоизомеразите от подтип IB действат по по -прост механизъм, който включва свободно въртене на ДНК в преходното място на ник (Stasiak, 2003). Има две топоизомерази тип I в E. coli които са известни като топо I и III и двете принадлежат към подтип А (Champoux, 2001). Важното е, E. coli topo I и III почти не са активни върху по -голямата част от клетъчната ДНК, която се поддържа на физиологични нива на ( -) суперсвиване. Нефизиологично силно (-) суперсвиване или наличието на едноверижни региони активират топо I и III (Champoux, 2001). Топоизомерази тип II правят преходни двуверижни прекъсвания и позволяват преминаването на друг дуплекс през прекъсването. Обикновено те са зависими от АТФ (Gellert и др, 1976). Има две топоизомерази тип II E. coli, които са известни като ДНК гираза и топо IV (Champoux, 2001). Като с E. coli топоизомерази тип I, гираза и топо IV също са слабо активни върху по -голямата част от клетъчната ДНК и се активират чрез релаксация на ДНК в случай на гираза и чрез (+) суперсвиване в случай на топо IV. За енергийния баланс е важно да няма напразно действие на топоизомеразите върху по-голямата част от ДНК, чрез което гиразата, например, непрекъснато би използвала АТФ за въвеждане на (-) супернавиване и топо I или III би отпуснало ДНК. Следователно действието на топоизомераза трябва да бъде ограничено до биологичните процеси, които включват ДНК, като репликация, транскрипция, рекомбинация и ремонт, по време на които топологията на ДНК трябва да бъде модифицирана.

Изтегляне на въже между (-) и (+) суперспирали

За да инициират тяхната репликация, бактериалните плазмиди трябва да бъдат ( -) суперсвити, тъй като това улеснява отделянето на нишките в началото на репликацията (Фигура 1A Funnell и др, 1987 Марианци и др, 1986). След като инициацията е завършена, удължаването протича посредством сложен ансамбъл от ензими, известен като реплизома. Настоящото мнение е, че по време на репликацията ДНК преминава през неподвижен реплисом. Пред този реплизом, хексамерна ДНК хеликаза разделя родителските нишки, които трябва да се използват като шаблони. Това разделяне на нишките води до пренавиване (положително супернавиване) на дуплекса пред вилицата (фиг. 1А Александров и др, 1999 Петър и др, 1998 Ullsperger и др, 1995). Въпреки това ( -) суперспирингът е важен за отварянето на двойната спирала на ДНК (Crisona и др, 2000 Kanaar & Cozzarelli, 1992). Как тогава междинните продукти за репликация (RI) успяват да останат ( -) суперсвити, докато вилицата напредва? Първата улика за отговор на този въпрос дойде с откриването на ДНК гираза (Gellert и др, 1976). Смята се, че непрекъснатото действие на гиразата върху нереплицираната част от репликиращите се плазмиди намалява броя на свързване на родителския дуплекс (Александров и др, 1999 Петър и др, 1998 Ullsperger и др, 1995). По този начин гиразата помага да се компенсира навиването на дуплекса с напредването на вилицата. Скоростта на прекъсване на връзката чрез гираза обаче е бавна и може да е недостатъчна за поддържане на скоростта на движение на вилицата в E. coli (Петър и др, 1998). Освен това, ДНК -гиразата може активно да причини прекратяване на връзката само когато действа върху нереплицираната част от репликиращите се плазмиди (Gellert и др, 1976 г. Кампранис и др, 1999). В ранните етапи на репликация, когато нереплициращата се част е достатъчно дълга, няколко молекули гираза могат да работят паралелно, за да поддържат висока скорост на прекъсване на връзката. Тъй като дължината на нерепликираната част обаче се свива, има по-малко място за действие на гиразата. Всяка молекула на гираза се нуждае от около 150 базови двойки, за да се свърже с ДНК (Bates & Maxwell, 1989), и така претоварването, причинено от прогресиращата вилка, в крайна сметка може да се натрупа. Този потенциален проблем за първи път беше признат от Джеймс Шампу и Майкъл Бийн (Champoux & Been, 1980), които осъзнаха, че този дефицит на гираза в крайна сметка ще доведе до натрупване на (+) суперсвиване в по -късните етапи на процеса на репликация. За да разрешат тази дилема, те предложиха суперспирирането да може да се разпространи в репликационната вилка и да се преразпредели както пред, така и зад вилката. В този модел другата топоизомераза тип II, топо IV, която е основната декатеназа в E. coli (Zechiedrich & Cozzarelli, 1995 Zechiedrich и др, 1997), помага на gyrase да компенсира намотката, която се натрупва с напредването на вилицата. Брайън Питър и колеги (Питър и др, 1998) използва електронна микроскопия, за да потвърди дифузията на суперспиралиране през вилицата в an инвитро анализ, който дава частично реплицирани плазмиди, съдържащи блокирани вилици. Те нарекоха преплитането на сестринските дуплекси в репликираната част „прекатенани“, за да ги разграничат от суперспирала в нереплицираната част (Фигури 2А и 3В, D, E). Възникващата идея беше, че разединяването на родителския дуплекс по време на репликацията на ДНК се осъществява чрез въвеждане на гираза ( -) супер -намотки преди вилицата и topo IV, премахване на прекатенани зад вилката. Това би обяснило защо прогресията на репликационната вилка е възпрепятствана, когато както гиразата, така и топо IV са мутирани или инхибирани (Hiasa и др, 1994 Ходурски и др, 2000 Левайн и др, 1998). Важно е да се отбележи, че за да може супернавиването да се разпространи през репликационната вилка, сестринските дуплекси трябва да могат да се въртят свободно един около друг при вилките. Любопитното е, че за ( -) суперсвърта RI инвитро, родителският дуплекс се върти около себе си с дясна ръка пред вилицата, докато зад разклонението сестринските дуплекс се навиват по лява ръка ( Postow и др, 2001а). Обратното се случва в случай на (+) свръхнавита RI (вижте фигури 2A и 3B, D, E). По-скоро не е интуитивно, че посоката на преплитане на противоположни двуверижни области се променя между нереплицираните и репликираните части на RI, който е под стрес на усукване. Въпреки това е добре известно, че еластичният преход от тороидални към преплетени форми на супернавиване променя възприеманата способност на преплитането, като същевременно поддържа същия топологичен знак (Фигура 2B Bauer и др, 1980). По подобен начин, въпреки че възприеманата ръчност на дуплекс -дуплекс, преплитаща се в репликирани и нереплицирани части от суперсвързани РИ, е различна, топологичният знак на тези пресичания в двете части остава един и същ (Фиг. 2А).

Както бе споменато по -рано, ( -) суперспирингът подпомага всеки процес, който изисква отваряне на двойната спирала (Crisona и др, 2000 Kanaar & Cozzarelli, 1992). Нещо повече, наскоро беше показано, че за частично възпроизведените молекули, съдържащи блокирани вилици, въвеждането на нетна (+) суперспирализация инвитро води до обръщане на вилицата за репликация чрез образуване на разклонено четирипосочно кръстовище, подобно на Холидей, така наречената структура „пилешко стъпало“ (Olavarrieta и др, 2002в Постоу и др, 2001b Сого и др, 2002 Вигера и др, 2000). Накратко, смята се, че координираното действие на гираза и топо IV ще позволи на RI да останат ( -) суперсвити в процеса на репликация. Следователно, във всеки един момент по време на репликацията, степента на супернавиване би била резултат от баланса между действието на поне трите различни вече споменати ензима: ДНК хеликаза, което води до натрупване на (+) супернавиване пред вилицата ДНК гираза, която въвежда ( -) суперспиринг в нереплицираната част и топо IV, премахвайки прекатенани зад вилицата (Петър и др, 1998 Постоу и др, 1999, 2001a).

Образува се двуизмерна (2D) агарозна гел електрофореза на непокътнати молекули in vivo с вилицата, спряна на различни разстояния от произхода, показва, че тези плазмиди с вилица, спряла по -близо до началото, са по -свръхсвити от тези с вилицата, блокирана на нарастващи разстояния (Olavarrieta и др, 2002c). Това наблюдение предполага, че въпреки че RI остават ( -) суперсвити през цялото време на репликация, те постепенно се отпускат с напредването на вилицата. Тези резултати обаче трябва да бъдат изследвани с повишено внимание, тъй като те не отразяват непременно ситуацията по време на безпроблемна репликация на ДНК. В тези плазмиди, съдържащи блокирани вилици, може да има излишък от ( -) напрежение, дължащо се на непрекъснатото действие на гиразата, след като вилицата е спряла.

Възли от мехурчета като репортери на ДНК топология in vivo

Веднага след като бяха открити ДНК топоизомеразите, се разбра, че в живите клетки могат да се образуват ДНК възли. Експериментални доказателства за възлови молекули in vivo, обаче беше оскъдна (Лиу и др, 1981 Шишидо и др, 1989 Шишидо и др, 1987). Следователно беше изненадващо, когато проучванията на бактериални плазмиди със закъсали вилици разкриха, че такива плазмиди могат да бъдат възелени in vivo и че те образуват характерно подреждане „мъниста върху нишка“ на ДНК ленти в 2D гелове ( Santamaría и др, 1998 , 2000 Вигера и др, 1996). Стратегията, използвана за идентифициране на тези възли мехурчета, включва разцепване в нерепликираната част от плазмидите и води до идентифициране на възли, затворени в репликационните мехурчета. Характеризирането на ръчността на тези възли мехурчета за репликация чрез електронна микроскопия (Sogo и др, 1999) посочва, че частично репликираните молекули са били (-) свръхнавита при възникване на възел ( Postow и др, 1999 ).

Анализите на възли мехурчета за репликация в частично репликирани молекули с вилица, спряна на различни разстояния от началото, показват, че броят и сложността на възлите мехурчета за репликация се увеличават с напредването на вилицата (Olavarrieta и др, 2002б). Може да се твърди, че вероятността от възел се увеличава с размера на балона. Не е толкова просто обаче, тъй като мехурчетата със същия размер показват повече възли в малки плазмиди, в които вилицата спира към края на репликацията (Olavarrieta и др, 2002c) в сравнение с големи плазмиди, в които вилицата спира в началото на процеса (Olavarrieta и др, 2002b). Като цяло тези наблюдения предполагат, че вероятността за образуване на възел зад вилицата е обратно свързана с плътността на прекатенана (Фигура 3В – Е ’). За редовно навитите прекатенани, дуплексно-дуплексните пасажи е малко вероятно да „уловят“ друг сегмент от същата молекула, докато това не е така за хлабаво навитите прекатенани (Sogo и др, 1999 ).

След като репликацията приключи, останалите прекатенани и възли репликационни мехурчета автоматично се превръщат в катенани (фиг. 3F), които се елиминират от топо IV, за да позволят сегрегация на новосъздадените сестрински дуплекси (Лукас и др, 2001 Zechiedrich & Cozzarelli, 1995 Zechiedrich и др, 1997). Трябва обаче да се отбележи, че за E. coli хромозома in vivo може да има алтернативни начини за десетиране на сестрински дуплекси (Ip и др, 2003 г.). Във всеки случай, увеличаването на броя и сложността на възлите репликационни мехурчета би увеличило броя на възлите в катенана (броят пъти, когато всеки дуплекс се навива около сестра си) и това се очаква да има вредни ефекти върху сегрегацията на прясно репликирани ДНК молекули. Летисия Олавариета и колеги (Olavarrieta и др, 2002a) тества тази хипотеза, като сравнява броя на възли мехурчета за репликация в плазмиди, в които транскрипцията на избран ген и репликацията се случват в еднакви или в противоположни посоки. Очаква се прогресията на транскрипция и репликация в противоположни посоки да стимулира натрупването на (+) суперсвиване между вилиците, докато се приближават една до друга (Brewer, 1988 Wu и др, 1988). Миграцията на тази (+) супер -навивка зад вилката ще отпусне редовното преплитане на сестрински дуплекси и ще намали броя на прекатенаните. Броят и сложността на възлите репликационни мехурчета наистина са значително по -високи, когато транскрипцията и репликацията протичат един срещу друг (Olavarrieta и др, 2002а).

Зоопарк от междинни продукти за репликация

В обобщение, настоящият топологичен изглед на репликона може да бъде обобщен, както следва: кръговите плазмиди трябва да бъдат ( -) суперсвити, за да инициират репликация (Фигура 3А). След инициирането суперспирингът се разпределя между нереплицираните и репликираните части (Фигура ЗВ). RI постепенно се отпускат с напредването на вилицата и към края на репликацията те могат да загубят всички естествени ( -) суперспирали (Фигура 3C). На по -късните етапи те дори биха могли да придобият мрежова (+) суперспирал (фиг. 3D), която обаче би била елиминирана чрез комбинираното действие на гираза и топо IV за възстановяване на естествената ( -) суперсвивка (фиг. 3Е). И накрая, след като репликацията приключи, всички останали прекатенани стават катенани (Фигура 3F) и тяхното декатениране чрез topo IV позволява на двата сестрински дуплекса да се разделят свободно, за да завършат цикъла. Вероятността за завързване зад вилицата е обратно пропорционална на плътността на прекатенана. Поради тази причина възли от мехурчета могат да се образуват, по -специално към края на репликацията (Фигура 3Е ’). RI, носещи възли мехурчета за репликация, могат да бъдат или (-) или (+) свръхнавита. Тези възли мехурчета могат да бъдат развързани от topo IV по време на репликация или по друг начин да станат катенани, след като репликацията приключи. Като алтернатива, преходното натрупване на (+) супернамотка може да доведе до спиране на вилицата и регресия чрез образуването на структурата „пилешко краче“. Тези преходни междинни съединения обаче биха могли да бъдат спасени чрез комбинираното действие на топо IV и ДНК гираза за възстановяване на ( -) суперсвиване и обратна регресия на вилицата (Фигура 3D ’).

Парадоксът на десетилетие на топо IV

Наскоро беше установено, че topo IV отпуска (+) супер-бобини с 20 пъти по-бърза скорост от (-) супер-бобини (Crisona и др, 2000). Освен това, инвитро анализите показват, че topo IV разпознава хиралните кръстоски, наложени от лявата суперспирала на (+) суперспирирана ДНК (Чарвин и др, 2003 Камък и др, 2003 Trigueros и др, 2004). Това наблюдение разкри нов парадокс. Както беше посочено по -горе (Фигури 2А и 3В), за ( -) суперсвъртени РИ инвитро, родителският дуплекс се навива около себе си по дясно пред вилката, докато зад вилката сестринският дуплекс се навива по ляво. Ако и тази ситуация се отнася in vivo, прекатенаните с лява ръка в (-) суперсвъртени РИ ще бъдат разпознати и елиминирани от топо IV по преференциален начин. В такъв случай действието на topo IV би било вредно, тъй като в крайна сметка би увеличило свързващия брой на родителските нишки. Обърнете внимание, че гиразата ще изгаря АТФ, за да изпомпва (-) супер-намотки преди вилицата, докато топо IV ще изгаря повече АТФ, за да елиминира същите тези (-) супер-бобини, след като те се разпръснат през вилицата и станат прекатенани за лява ръка. Нещо повече, прекатенаните с дясна ръка, присъстващи в (+) суперсвъртени РИ, няма да бъдат елиминирани от topo IV. Тези наблюдения поставят под въпрос модела на предкатенана. Възможно е при активно репликиращи се молекули супернавиването да не дифундира през репликационните вилици, защото те може да не са в състояние да се въртят свободно. The observation that replication complexes are anchored to the bacterial membrane ( Levine и др, 1998 ) suggests that there is a topological barrier that would prevent diffusion of the (+) supercoiling generated in the unreplicated portion as the fork advances to the replicated part. In this case, precatenanes would not form. Experimental evidence for precatenanes in vivo is not abundant and the few cases reported in the literature are indirect. The occurrence of knotted replication bubbles ( Olavarrieta и др, 2002a , b , c Sogo и др, 1999 Viguera и др, 1996 ) was considered to be the best available evidence indicating that precatenanes may form in (−) supercoiled, partially replicated molecules in vivo ( Postow и др, 1999). Further evidence supporting the occurrence of precatenanes in vivo comes from experiments using small circular plasmids replicated in Ксенопус cell extracts. The significant increase in the number and complexity of catenanes after partial inhibition of eukaryotic topo II (the equivalent of prokaryotic topo IV) could only derive from pre-existing precatenanes ( Lucas и др, 2001). In most of these cases, though, replication was impaired either by stalling the forks or by inhibiting topo II. It is possible that precatenanes could form in vivo only if progression of the replication forks is permanently stopped or severely impaired. In other words, precatenanes might not form in vivo during unimpaired DNA replication. They would readily form инвитро, however, after DNA isolation and deproteinization, as then the forks would be free to rotate. It is interesting to note that in E. coli cells, the majority of topo IV activity is concentrated close to replication factories at the cell centre and occurs mainly late in the cell cycle ( Espeli и др, 2003 Sherratt, 2003 ). These findings could explain how topo IV is prevented from eliminating left-handed precatenanes in (−) supercoiled RIs if such precatenanes eventually form.

The topological changes that take place as a replicon replicates are just beginning to be unravelled. Until this apparent topo IV decatenation paradox is finally solved, it seems that during replication all the possible topological forms RIs can adopt could have some role. The topological cycle of a replicon appears to involve supercoiling, precatenation, knotting, catenation and decatenation (see Fig 3). Whether or not the changes that have been observed for small plasmids also apply to the large topological domains of bacteria and linear eukaryotic chromosomes remains to be shown.


Topological Transformations of Synthetic DNA Knots

Прегледите на статии са съвместимата с COUNTER сума от изтеглянията на пълни текстови статии от ноември 2008 г. (както в PDF, така и в HTML) във всички институции и лица. Тези показатели се актуализират редовно, за да отразяват употребата до последните няколко дни.

Цитатите са броят на други статии, цитиращи тази статия, изчислен от Crossref и актуализиран ежедневно. Намерете повече информация за броя на цитиранията Crossref.

Алтернативният рейтинг на внимание е количествена мярка за вниманието, което научна статия е получила онлайн. Кликването върху иконата на поничка ще зареди страница на altmetric.com с допълнителни подробности за резултата и присъствието в социалните медии за дадената статия. Намерете повече информация за алтернативния резултат на вниманието и как се изчислява резултатът.

Забележка: Вместо резюме, това е първата страница на статията.


3 ALGORITHM

An implementation of this approximation to topological entropy is available at: http://www.math.psu.edu/koslicki/entropy.nb

3.1 Comparison to traditional measures of complexity

Other measures of DNA sequence complexity similar to this approximation of topological entropy include: previous implementations of topological entropy ( Kirillova, 2000), special factors ( Colosimo and de Luca, 2000), Shannon's metric entropy ( Farach et al., 1995 Kirillova, 2000), Rènyi continuous entropy ( Rènyi, 1961 Vinga and Almeida, 2004) and linguistic complexity (LC) ( Gabrielian and Bolshoy, 1999 Troyanskaya et al., 2002).

The implementation of topological entropy in Kirillova (2000) does not produce a single number representing entropy, but rather an entire sequence of values. Thus, while the implementation of Kirillova (2000) does distinguish between artificial and actual DNA sequences, Kirillova notes that the implementation is hampered by high-dimensionality and finiteness problems.

In Colosimo and de Luca (2000), it is noted that the special factors approach does not differentiate between introns and exons.

Low topological entropy of a sequence implies that it is ‘less chaotic’ and is ‘more structured’.

Thus, LC is the only other similar measurement of sequence complexity that produces a single number representing the complexity of a sequence. Like our implementation of topological entropy, the implementation of LC contained in Troyanskaya et al. (2002) also runs in linear time. A comparison of our implementation of topological entropy and LC is contained in Section 4.4.


Материали и методи

Антитела.

The generation of the mAbs JJ316 and JJ319 has been previously described (12, 15). The other anti–rat CD28 mAbs used in this study originated from these published experiments but had not yet been characterized in detail. Anti–mouse CD28 (clone 37.51 reference 16), mouse anti–phosphotyrosine (clone 4G10), and mouse anti–human CD3 (clone UCHT1) was purchased from BD Biosciences. Mouse anti–human TCRζ (clone 6B10.2) and rabbit polyclonal antibodies to nuclear factor (NF)-κB p50, c-rel, and USF-2 were from Santa Cruz Biotechnology, Inc., and mouse anti–human ZAP-70 (clone 3.3.1 reference 17) was provided by A.D. Beyers (University of Stellenbosch, Matieland, South Africa). The generation of the anti–rat TCR mAb R73 was previously described (18).

Generation of mAbs Specific for Human CD28.

BALB/c mice were immunized repeatedly intraperitoneally with recombinant human CD28-Fc fusion protein and a CD28-transfected B lymphoma cell line. 3 d before cell fusion, animals were boosted intravenously. Fusion of spleen cells from immunized mice and X63Ag8.653 myeloma cells was performed by polyethylene glycol treatment according to standard protocols (15). Routinely, hybridoma cells secreting CD28-specific mAbs were subcloned once. Superagonistic anti-CD28 mAbs were subcloned twice.

Животни.

Lewis rats and C57BL/6 mice were bred at the Institute for Virology and Immunobiology, University of Würzburg. Mesenteric lymph nodes were taken from young adult animals and single cell suspensions were used for FACS ® analysis and T cell proliferation assays.

Cloning of DNA Constructs.

The rat CD28 cDNA (15, 19) was inserted into the cloning vector Bluescript pBS KS (−). Sequence analysis revealed that amino acid (aa) at position 85 is identical to the homologue mouse CD28 aa in contrast to the data bank (NCBI protein) information. Mouse CD28 cDNA was amplified from whole mouse lymph node cDNA using 5-GCGTCGACGGCCCTCATCAGAACAATGAC-3′ as the sense primer and 5-GGAAGCTTCCCTGTCAGGGGCGGTACGCT-3′ as the antisense primer and then cloned into the pCR 3-uni-expression vector (Invitrogen) or the cloning vector Bluescript pBS KS (−).

To generate the r/mCD28 1–37, the EcoNI/XhoI mouse CD28 cDNA fragment was cloned into the corresponding EcoNI/XhoI site present in the rCD28 sequence in pBS KS (−). The resulting chimeric construct was then cloned into the expression vector pCR 3-uni. The chimeric construct m/rCD28 1–37 was generated by inserting the EcoNI/XhoI rat CD28 cDNA fragment into the corresponding EcoNI/XhoI site present in mCD28 in pBS KS (−) and then cloned into the pCR 3-uni expression vector.

For the m/r CD28 1–66 construct, the rat part of the chimeric molecule was amplified by PCR using 5′-TCGCTCGAATGCCGAGTTCAACTGTGATGG-3′ as the sense and 5′-TTTTGCTCGAGCCCTGTCAGGGGCGGTACG-3′ as the antisense primer and cloned into the Mva1269I/XhoI site present in mCD28 in pBS KS (−). The chimeric construct was then subcloned into the expression vector pHβAPr-1-neo, as this vector exhibited a higher transfection efficiency in L929 cells compared with pCR 3-uni.

All point mutants were generated using the Quick Change kit (Stratagene) according to the manufacturer's instructions. The following primers were used: mCD28 A64V, E65G: sense 5′-CCCAGTTTCGCTCGAATGTGGGGTTCAACTGCGACGGG-3′, antisense 5′-CCCGTCGCAGTTGAACCCCACATTCGAGCGAAACTGGG-3′ mCD28 S62P, A64V, E65G: sense 5′-CCAGTTTCGCCCAAATGTGGGGTTCAA-3′, antisense 5′-TGGAACCCCACATTTGGGCGAAACTGG-3′ mCD28 S62P, A64V, E65G, D71N: sense 5′-AACTGCGACGGGAATTTCGACAA-3′, antisense 5′-TTGTCGAAATTCCCGTCGCAGTT-3′ mCD28 S62P, A64V, E65G, D71N, R109K: sense 5′-GACAACGAGAAGAGCAATGGAACT-3′, antisense 5′-AGTTCCATTGCTCTTCTCGTTGTC-3′ mCD28 S62P, A64V, E65G, D71N, R109K, F98V: sense 5′-TGCAAAATTGAGGTCATGTACCCTC-3′, antisense 5′-GAGGGTACATGACCTCAATTTTGCA-3′ mCD28 S62P, A64V, E65G, D71N, T125A, S127T: sense 5′-TCTTTGTCATGCTCAGACGTCTCCTAAGC-3′, antisense 5′-GCTTAGGAGACGTCTGAGCATGACAAAGA-3′ mCD28(h) F60V, R61T, N63K, A64T, E65G: sense 5′-CCCAGTTTCGCTCGAAAACGGGGTTCAACTGCGA-3′, antisense 5′-TCGCAGTTGAACCCCGTTTTCGAGCGAAACTGGG-3′, as well as sense 5′-TATCAGCCCCAGGTTTACTCGAAAACGG-3′, antisense 5′-CCGTTTTCGAGTAAACCTGGGGCTGATA-3′. All point mutants were cloned into the expression vector pHβAPr-1-neo. The correct generation of all chimeric constructs and point mutants was verified by sequencing.

The constructs mCD28 S62P, A64V, E65G and mCD28(h) F60V, R61T, N63K, A64T, E65G were amplified using the primers sense 5′-GCGCCAATTGCCCTCATCAGAACAATGAC-3′ and antisense 5′-ATTTCGGATCCTGTCAGGGGCGGTACGCT-3′ and then cloned into the EcoRI/BamHI site of the retroviral pczCFG5 IZ vector. This is a derivative of the described pEYZ/MCS retroviral vector (20) in which the open reading frame coding for the EYFP-zeocin fusion protein was removed and an IRES/zeomycin cassette introduced instead. As control, a construct was used that contained the extracellular domain of rat CD28 coupled to the transmembrane and cytoplasmic domain of mouse CD28 (hereafter referred to as extracellular WT rat CD28). For this, the mouse part of the molecule was amplified using the primers sense 5′-TGCTCAGACGTCTCCTAAGCTGTTTT-3′, antisense 5′-GGAAGCTTCCCTGTCAGGGGCGGTACGCT-3′ and the PCR product was cloned into the AatII/HindIII site of rat CD28 in Bluescript pBS KS (−). The chimeric construct was cloned into the EcoRI site of pczCFG5 IZ.

Expression of Constructs in Cell Lines.

The constructs in the expression vectors pCR 3-uni or pHβApr-1-neo were stably transfected into L929 cells using lipofectamin (Life Technologies) according to the manufacturer's recommendations. Transfected cells were selected using RPMI 1640 medium (5% FCS Life Technologies) containing G418 (Pan Biotech GmbH) at a final concentration of 1 mg/ml. After 2 wk of selection the percentage of cells expressing the appropriate construct ranged between 30 and 90%. If the transfection efficiency was low (as the case for m/r CD28 1–66, mCD28 S62P, A64V, E65G and mCD28 S62P, A64V, E65G, D71N, R109K), the transfected cells were stained with anti-CD28 and positive cells were sorted using a FACSVantage™ cell sorter (Becton Dickinson) and further propagated in RPMI 1640 medium containing G418.

The TCR − 58 mouse T cell hybridoma (21) was first retrovirally transduced with a rat myelin basic protein-specific TCR (provided by T. Herrmann, University of Würzburg, Würzburg, Germany, and Herrmann, T., personal communication). The CD28 constructs in the retroviral vector pczCFG5 IZ were then introduced into these cells using retroviral infection. Recombinant retroviral vector supernatants were generated by cotransfection with vectors encoding VSV-G and pHIT 60 as previously described (22, 23). >90% of the cells were positive for the expression of the appropriate molecules when tested by FACS ® analysis.

FACS ® Analysis.

For FACS ® analysis, 5 × 10 5 cells were resuspended in PBS/0.1% BSA/0.02% NaN3 and incubated for 30 min with 0.5 μg purified antibody (for JJ316 and JJ319) or 100 μl culture supernatant (for all other anti–rat CD28 mAb) on ice followed by development with PE-labeled donkey anti–mouse IgG (Dianova). Flow cytometric analysis was performed with a FACScan™ flow cytometer (Becton Dickinson) and CellQuest™ software using logarithmic amplification of fluorescence signals from scatter-gated live cells.

T Cell Proliferation Assays.

Rat T cells were purified from lymph node cell suspensions by nylon wool passage. Routinely, T cells were enriched to >90% by this method whereas B cells and monocytes were efficiently depleted and made up <1% of the cell suspension. 10 5 purified T cells were used for the proliferation assay using either costimulatory conditions (immobilized anti-TCR mAb R73 and soluble anti-CD28 mAb) or mitogenic conditions (immobilized sheep anti–mouse Ig plus anti-CD28 references 12 and 13). Proliferation was determined by [ 3 H]thymidine incorporation.

Human T cells from freshly drawn peripheral blood were obtained from ficoll-purified PBMC and nylon wool passage. Routinely, purity was >90%. Cells were adjusted to 5 × 10 5 /ml and cultured in RPMI 1640 medium containing 10% autologous serum in 200 μl final volume in 96-well plates (Costar) that had previously been coated with 40 μg/ml donkey anti–mouse Ig antiserum (Dianova), followed by extensive washing and incubation with 0.003 μg/ml anti-CD3 mAbs (costimulation) or without anti-CD3 mAbs (direct stimulation) for 15 min on ice. After washing, soluble anti-CD28 mAbs were added to the cultures at a final concentration of 3 μg/ml (see Fig. 4, A and B) or as indicated (see titration in Fig. 4 C). As positive control, cells were stimulated with 5 μg/ml PHA and 200 U/ml IL-2. After 72 h, proliferation was measured by [ 3 H]thymidine incorporation.

Stimulation of 58 T Hybridoma Cells and IL-2 Measurement.

58 T hybridoma cells (21) transfected with either extracellular WT rat CD28, mCD28 S62P, A64V, E65G or mCD28(h) F60V, R61T, N63K, A64T, E65G were stimulated with either plate-coated anti-TCR mAb, a mitogenic anti-CD28 mAb (JJ316 for rat, 5.11A1 for human), a nonmitogenic anti-CD28 mAb (JJ319 for rat, 37.51 for the chimeric molecules), both at final concentrations of 10, 5, 2.5, and 1 μg/ml, or left untreated. After 2 d, the IL-2 content in the supernatant was tested using an Opti EIA mouse IL-2 detection kit (BD Biosciences) according to the manufacturer's instructions.

Modeling of the Mouse CD28 Structure.

The human CD28 monomer was modeled on the murine CTLA-4 structure (24) using the sequence alignment derived by Metzler et al. (25) and the program O (26). The dimer was constructed on the basis of the CTLA-4 homodimer observed in the crystals of the complex of human CTLA-4 and CD80 (26). Fig. 3 was drawn using BOBSCRIPT (27).

Stimulation, Immunoprecipitation, and Preparation of Nuclear Extracts.

T cells obtained by leukopheresis were purified to ∼90% purity by nylon wool passage. 10 8 cells were incubated for 1 h at 4°C with 5 μg/ml conventional (7.3B6) or mitogenic anti-CD28 (5.11A1) antibodies, or a mixture of 5 μg/ml anti-CD3 (OKT3) and 0.5 μg/ml conventional anti-CD28 antibodies. Cells were washed, incubated for 30 min at 4°C with 10 μg/ml rat anti–mouse IgG, and incubated for 0.5 min at 37°C before the addition of NP-40 lysis buffer (final concentration 1% NP-40, 25 mM Tris, pH 7.5, 140 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM pefabloc, 5 mM iodoacetamide, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF). Lysates were centrifuged (14,000 rpm for 10 min at 4°C) and the supernatant was added to protein G–Sepharose precoated with 5 μg ZAP-70 and TCRζ antibody. Beads were incubated with rotation for 2 h at 4°C, washed four times with lysis buffer, and samples were resolved by SDS-PAGE and Western blotted. Membranes were probed with anti-phosphotyrosine antibody and reprobed with antibodies to TCRζ and ZAP-70 to ensure comparable loading. For preparation of nuclear extracts, 2 × 10 7 cells were stimulated for 20 h on sheep anti–mouse IgG-coated plates as previously described (13) and the protocol of Schreiber et al. (28) was followed. Protein concentration was measured using the Bradford assay (Bio-Rad Laboratories) and 6 μg protein per lane was resolved by SDS-PAGE, Western blotted, and probed with antibodies to c-Rel and USF-2.


Резюме

It has been proposed that new transcription modulations can be achieved via topological coupling between duplex DNA and DNA secondary structures, such as G-quadruplexes, in gene promoters through superhelicity effects. Limited by available methodologies, however, such a coupling has not been quantified directly. In this work, using novel magneto-optical tweezers that combine the nanometer resolution of optical tweezers and the easy manipulation of magnetic tweezers, we found that the flexibility of DNA increases with positive superhelicity (σ). More interestingly, we found that the population of G-quadruplex increases linearly from 2.4% at σ = 0.1 to 12% at σ = −0.03. The population then rapidly increases to a plateau of 23% at σ < −0.05. The rapid increase coincides with the melting of double-stranded DNA, suggesting that G-quadruplex formation is correlated with DNA melting. Our results provide evidence for topology-mediated transcription modulation at the molecular level. We anticipate that these high-resolution magneto-optical tweezers will be instrumental in studying the interplay between the topology and activity of biological macromolecules from a mechanochemical perspective.


Признания

The authors thank Wayne L. Miller and Martin B. Ulmschneider for contributing figures, and are grateful to Nicholas N. Nickerson and Dyanne Brewer for their helpful comments and critical reading of the manuscript. S. T. I. is the recipient of a CIHR Frederick Banting and Charles Best Canada Graduate Scholarship doctoral award, a CIHR Michael Smith Foreign Study award, a CFC doctoral studentship, and an Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology. J. S. L. holds a Canada Research Chair in Cystic Fibrosis and Microbial Glycobiology.