Информация

Алтернативи на PCR

Алтернативи на PCR


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

PCR използва цикли на нагряване и охлаждане за денатуриране на нишките, което изисква специални термостабилни ДНК полимерази. В клетка, по време на репликация, Хеликаза размотава ДНК без изискване за топлина. Може ли Helicase да се използва вместо топлинния цикъл за постигане на едноверижна ДНК? Това би ли елиминирало необходимостта от топлинен цикъл и следователно специални термостабилни полимерази?


Редактирано след въпросните разяснения,

Нека започнем с нормалните функции на двата ензима. Хеликаси отделя ДНК нишки, докато полимераза синтезират ДНК вериги, както е показано на следващата фигура. (Източник на изображението: Wikimedia Commons)

Гледайте тази анимация, тя ще изчисти съмненията ви относно функцията. Въпреки това, РНК полимеразата има и двете активности.

В клетките е необходимо действие на хеликаза, за да се отделят ДНК вериги. След това може да действа само полимераза. По време на PCR разделянето на нишки се извършва чрез повишаване на температурата. Този процес се нарича стопяване на ДНК. Тази температура обикновено е много висока, около $90^oC$ до $100^oC$ в зависимост от вашата последователност. При тази температура много протеини няма да функционират, следователно имате нужда от термостабилна полимараза. Преди около 40 години такъв ензим е открит от екстремофили (Chien et al 1976). Сега се предлага в търговската мрежа като Taq полимераза. Тези ензими са рекомбинантни протеини с няколко мутации, които също са увеличили добива и стабилността му (Villbrandt et al 1997).

Сега стигаме до основния ви въпрос (Което мисля, че този път правилно разбрах).

Концепцията, за която питате, вече е тествана успешно при откриване на РНК. Изследователите са използвали "Изотермична обратна транскрипция термофилна хеликаза-зависима амплификация"(Goldmeyer et al 2007). Те използваха не само хеликаза, но и обратна транскриптаза (тъй като откриваха РНК). Следното изображение (взето от хартията) показва основните стъпки в този процес. Кръговете показват ДНК полимераза, квадратите показват обратното транскриптаза, а триъгълниците показват хеликаза.

Цитиране от хартията (куршумите са мои),

Стрелките показват специфични праймери, кръгове показват ДНК полимераза, квадрати показват обратна транскриптаза, а триъгълници показват хеликаза. Първата верига сДНК първо се синтезира от обратна транскриптаза

  • (стъпки 1 и 2). След това хибридите РНК-ДНК от обратната транскрипция се разделят с UvrD хеликази, генериращи едноверижни (ss) РНК и ДНК шаблони
  • (стъпки 3 и 4). ssRNA влиза в следващия кръг от RT реакция
  • (стъпка 5-а) генериране на повече първа верига сДНК. ssDNA се превръща в двуверижна ДНК чрез ДНК полимераза
  • (стъпка 5-b) и се амплифицира едновременно в tHDA реакцията
  • (стъпки 6 до 9). Този процес се повтаря, за да се постигне експоненциално амплифициране на РНК целевата последователност.

Разработени са изотермични технологии за амплификация на ДНК. Не се нуждаете от термично циклиране, за да амплифицирате фрагменти от ДНК по този метод.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17720718


Микробиология: култура срещу молекула

Микробиологът д-р Марк Уилкс разглежда ключовите теми и послания, които се появиха от тазгодишната конференция на Британското дружество за микробни технологии.

Неотдавнашната 32 -та годишна научна конференция на Британското дружество за микробни технологии беше озаглавена „Горещи теми в микробиологията“. Той се фокусира върху области от медицинската микробиология, където промяната е бърза и вероятно ще бъде още по-голяма в близко бъдеще.

В диагностичната клинична вирусология е имало преместване на едро от култура към полимеразна верижна реакция (PCR) и наскоро секвениране. Обратно, диагностичната бактериология остава до голяма степен базирана на културата. Има много причини за това, включително разходи, необходимия набор от умения и факта, че културните методи, независимо от ограниченията, като цяло са адекватни.

Мненията са поляризирани, като някои отказват да се ангажират с новите молекулярни методи, докато други гледат отвисоко на тези, които все още използват култура, и настояват, че PCR вече е остарял и секвенирането от следващо поколение (NGS) е единственият начин. Някои предполагат, че единствената пречка за последователността с висока производителност е „вроденият консерватизъм на професията“.

Обхватът от различни теми, засегнати на срещата, показва, че всъщност няма конфликт между двата различни метода. Големи печалби се постигат с помощта на молекулярни и културни подходи за справяне с различни ситуации и в някои случаи комбинираният подход дава най-добри резултати. Нека да разгледаме как подходите се използват в някои бързо променящи се области.

Подобряване на диагностиката на сепсис

Професор Пол Дарк от Университета в Манчестър и водещият критичен специалист в мрежата за клинични изследвания на NIHR направи първа презентация на тема „Преминаване към доставяне на прецизна медицина при сепсис“.

Тук имаме необичайната ситуация, при която златният стандарт – положителната кръвна култура – ​​всъщност не е много добър. Кръвните култури са отрицателни дори при тези, при които сепсисът се подозира силно по клинични причини. Най -важната причина за това вероятно е предишното антибиотично лечение, а не неадекватността на самата култура. Освен че са безчувствени, методите на култивиране често са твърде бавни, за да бъдат полезни в случаи на тежък сепсис.

Малко вероятно е да има някакви значителни подобрения в методите на културата, така че какви са молекулярните алтернативи? Нарастват усилията за разработване на молекулярни методи за бързо откриване на бактериална и гъбична ДНК директно от кръвта, без да е необходима кръвна култура. Те не се повлияват от предишно пробно антибиотично лечение. Няколко метода с маркировка СЕ бяха прегледани и показаха голям потенциал, въпреки че цената на всеки тест беше висока.

Допълнителен молекулярен подход е да се разгледат биомаркерите на гостоприемника, като CRP и PCT, освободени в кръвообращението в отговор на остри провоспалителни стимули. Бактериалните стимули са свързани с бързи и високи реакции и, което е важно, те бързо падат при правилно лечение на бактериална инфекция. Така че, когато се използват количествено, те имат потенциала да подпомогнат решенията за започване и прекратяване на антибиотика. Въпреки че, разбира се, те не дават пряка информация за причинителя на патогена или чувствителността към антибиотици.

Вероятно комбинацията от молекулярни методи за откриване на ДНК и биомаркери на гостоприемника ще даде най-добри резултати и ще доведе до голям напредък в надеждната и бърза диагноза на сепсис.

Етиология на пневмония, придобита в общността (CAP)

Една област, в която превъзходството на молекулярните методи е ясно показано, е определянето на етиологията на придобитата в общността пневмония. В предантибиотичната ера, пневмокок може да бъде изолиран в до 95% от случаите, но в повечето случаи достоверният патоген не е изолиран. Не е ясно дали това представлява истинска промяна в етиологията на заболяването, по -широко използване на антибиотици или и двете.

Д-р Кейт Темпълтън, консултант клиничен учен, Единбург, описа скорошно забележително проучване, в което са извършили количествено мултипатогенно тестване на проби от храчки при възрастни, хоспитализирани с CAP. Те са събрали мукопурулентни проби от храчки (96%) и ендотрахеални аспирати (4%) от 323 възрастни с рентгенологично потвърдена пневмония, приети в две болници за третични грижи във Великобритания. Те извършиха количествена култура и мултиплексна PCR в реално време за 26 респираторни бактерии и вируси. С PCR те идентифицират потенциален патоген (бактериален или вирусен) при 87% от пациентите, в сравнение с 39% при използване само на култура. Очаквано, PCR открива бактерии по -често от културата при пациенти, които са получавали антибиотици (77,6% срещу 32,1%).

Разбира се, изолирането на достоверен патоген не доказва, че той е отговорен за заболяването във всеки случай, особено тъй като много от откритите бактерии се пренасят в горните дихателни пътища без видима вреда в голяма част от населението. Въпреки това резултатите от изследването са изключително обнадеждаващи.

Идентификация на микобактерии

Доказано е, че NGS за откриване на Mycobacterium tuberculosis от проби от храчки е възможно, но в момента откриването на микобактерии разчита на култура. Д-р Pieter Jan Ceyssens, ръководител на отдела за антибиотици и резистентност в Националния референтен център за микобактерии и туберкулоза в Белгия, описа използването на MALDI-TOF за бързо идентифициране на микобактерии. В този случай молекулите са протеини, а не нуклеинови киселини, както в другите описани примери.

Идентифицирането на култивирани бактерии от MALDI-TOF революционизира начина на работа в повечето лаборатории в Обединеното кралство и Европа. По -голямата част от бактериите и дрождите вече могат да бъдат идентифицирани за минути с минимална подготовка. Въпреки това, микобактериите и филаментозните гъби се оказаха много по-трудни за идентифициране. Д-р Ceyssens описва някои прости методи, при които положителните култури се убиват топлина, екстрахират се с етанол, обработват се с ултразвук и след това се зареждат върху MALDI-TOF по обичайния начин. Това позволи идентифицирането на приблизително 90% от различните видове нетуберкулозни микобактерии, които се срещат в клиничните лаборатории за броени минути, огромна стъпка напред спрямо съществуващите техники, които са сложни, скъпи и отнемат няколко дни. Този евтин и бърз молекулен метод може да се окаже по -добър от NGS в повечето случаи.

Микробна тъмна материя

Професор Уилям Уейд от Лондонския университет „Куин Мери“ показа как молекулярните и културните методи могат да бъдат използвани заедно за значително увеличаване на нашите познания по микробиология в област, където ограниченията на културата може би са били твърде лесно приети. Неговото изказване беше тревожно озаглавено „Култивиране на некултурното“. Това се оказа не препратка към публиката, а към изключително гениален и старателен подход към отглеждането на нови бактерии от устата.

Оралните бактерии обикновено са придирчиви и бавно растат - изискват сложни среди и дълъг инкубационен период. Много от тях са строги анаероби, изискващи допълнителни грижи при събиране на проби, транспортиране и инкубация.

Изчерпателният културен анализ на пробите е труден, което означава, че е възможно да се анализират само малък брой екземпляри и около половината от оралните бактерии, открити чрез молекулярни методи, са некултивируеми.

Някои от тях принадлежат към съществуващи добре характеризирани фили, като например Bacteroidetes, където има много културни представители, като напр. Bacteroides fragilis, които са известни повече от век. Други представляват новооткрити дълбоки разклонени линии без култивирани представители. Причините за липсата на успех могат да включват под вземане на проби – тъй като културата е много по-трудоемка от молекулярните методи – и зависимост от други бактерии в общността. Това може да се дължи на специфични хранителни или сигнални изисквания, които са трудни за възпроизвеждане в лаборатория или самите бактерии могат да бъдат вътреклетъчни и паразитни и следователно трудно да се отглеждат в чиста култура.

Неговият разговор се фокусира върху опитите му да култивира некултивирани членове на този тип Синергизира. Основната хипотеза беше, че някои некултивирани орални бактерии изискват присъствието на други бактерии, така че може да е възможно първоначално да се отглеждат в смесена култура in vitro, с цел в крайна сметка да се отучат от тяхната зависимост от други бактерии и по този начин да се получат чисти култури.

Пробата, получена от пародонталния джоб, се култивира върху кръвен агар и се инкубира анаеробно в продължение на 10 дни. След това плочите се снимат, репликират и се попиват върху найлонови мембрани. Мембраните се хибридизират с Синергизира сонда, позволяваща площта на Синергистите колониите да бъдат бързо разположени върху оригиналната плоча. След това тези колонии могат да бъдат субкултивирани отново върху кръвен агар и така първичната култура постепенно се обогатява Синергизира. След осем пасажа, сместа се състои от четири добре описани бактерии.

Молекулярните методи показват, че има не само четирите вида бактерии, но и Синергизира тип W0 90. Чрез пасаж 12 този организъм е успял да расте независимо, макар и до култура на Parvimonas micra. Организмът е описан, наречен (Fretibacterium fastidiosum) и целият му геном е секвениран.

Не забравяйте, че всеки пасаж отне 10 дни и бяха необходими 12 пасажа, за да се получи изолатът в чиста култура, така че бяха необходими почти шест месеца усилена работа за възстановяване на организма в чиста култура.

Това можеше да стане само чрез комбиниране на традиционните културни методи с молекулярни методи и това наистина показва абсурда да се опитваме да поставим културните и молекулярните методи като взаимно антагонистични.

Марк Уилкс е водещ клиничен учен, микробиология в Barts Health NHS Trust и член на комитета на Британското дружество за микробни технологии.


Опции за достъп

Купете един артикул

Незабавен достъп до пълната статия в PDF формат.

Изчисляването на данъка ще бъде финализирано по време на напускане.

Абонирайте се за дневник

Незабавен онлайн достъп до всички издания от 2019 г. Абонаментът ще се подновява автоматично ежегодно.

Изчисляването на данъка ще бъде финализирано по време на напускане.


Резюме

Обективи Evaluer la concordance entre différentes méthodes de diagnostic et de confirmation des cas cliniques suspects d'infection àПлазмодий chez des enfants en Tanzanie et au Кения.

Методи Des gouttes de sang digital ont été colleées chez 338 enfants avec une подозрение clinique de malaria non compliquée dans les cliniques de Tanzanie et du Kenya. La présence de parazite de Плазмодий a été détectée par la microscopie, par des tests de diagnostic rapide (TDR) et moléculaires количествени бази base l'amplification des acides nucléiques (QT-NASBA) et par la PCR Резултати от сравненията и анализите за левърско съгласие.

Резултати Степента на съответствие е получена с високо ниво, като 88,6% на 100% в TDR или тестове с молекули и микроскопия. В селските зони на Кения има честота на случаите на малария, коефициент на корелация е 0,94 за TDR до 0,76 за PCR. Dans les zones urbaines de la Tanzanie avec une incidence faible des cas, pour les TDR une valeur de Р = 1,0 a été trouvée mais cette valeur était de 0,25 pour la PCR et 0,33 pour NASBA.

Изводи La malaria est surestimée lorsque le diagnostic est uniquement basé sur les signes cliniques. Dès lors, la confirmation de laboratoire est essentielle. La microscopie est une méthode fiable dans les zone rurales où la malaria est fréquemment rencontrée mais les TDR sont une bonne alternative avec l'avantage d’être simples et rapides. Les test moléculaires sont plus sensibles mais plus difficiles à implémenter dans les zone rurales. В зоните има честота плюс неуспешни, молекулярни тестове за откриване и номбре значимост плюс élevé d'infections àПлазмодий que les TDR или микроскопия. Bien que l'implémentation des tests moléculaires soit difficile, leur avantage d'offrir un système de detect simple et moins cher les présentent comme outils prometteurs dans un futur proche.


DPCR: Технологичен преглед

Цифровата полимеразна верижна реакция (dPCR) е нов метод за абсолютно количествено определяне на целевите нуклеинови киселини. Количественото определяне чрез dPCR зависи от факта, че произволното разпределение на молекулите в много дялове следва разпределението на Поасон. Всеки дял действа като индивидуален PCR микрореактор и дяловете, съдържащи амплифицирани целеви последователности, се откриват чрез флуоресценция. Пропорцията на PCR-позитивните дялове е достатъчна за определяне на концентрацията на целевата последователност без необходимост от калибриране. Напредъкът в микрофлуидиката даде възможност за настоящата революция в цифровото количествено определяне чрез предоставяне на ефективни методи за разделяне. В този преглед сравняваме основните концепции за количественото определяне на нуклеинови киселини чрез dPCR и количествената PCR в реално време (qPCR). Ние описваме основните статистически данни на dPCR и обясняваме как той дефинира своите показатели за прецизност и производителност. Преглеждаме различните микрофлуидни цифрови PCR формати, представяме техните физически принципи и анализираме технологичното развитие на dPCR платформите. Представяме новите стратегии за мултиплексиране, активирани от dPCR, и изследваме как изотермичната амплификация може да бъде алтернатива на PCR в цифровите анализи. И накрая, ние определяме дали теоретичните предимства на dPCR пред qPCR са верни, като разглеждаме проучвания, които директно сравняват анализи, изпълнени с двата метода.

Ключови думи: абсолютни количествени масиви от микроотвори dPCR цифрова PCR капчица микрофлуидни микрофлуидни камери микрофлуидни технологии микрофлуидни клапи на чип разделяне qPCR количествена PCR в реално време PCR в реално време.

Изявление за конфликт на интереси

Авторите декларират, че няма конфликт на интереси.

Фигури

( а ) Принципи на полимеразната верижна реакция (PCR). Всеки PCR цикъл...

QPCR анализ в реално време с помощта на ...

QPCR анализ в реално време, използващ стандартна крива. ( а ) Криви на усилване за ...

Принципи на цифрова PCR. В…

Принципи на цифровата PCR. Пробата е разделена на много независими дялове, като ...

Сравнение на PCR-базирани техники. В…

Сравнение на PCR-базирани техники. При конвенционалната PCR, амплификационните продукти се анализират при ...

Точност на количествено определяне на dPCR. В…

Точност на количествено определяне на dPCR. Точността на dPCR не е еднаква и зависи от ...

Платформи за активно разделяне. ( а…

Платформи за активно разделяне. ( а ) Схема на избутващ клапан в...

Платформи за пасивно разделяне. ( а…

Платформи за пасивно разделяне. ( а ) Мегапикселов цифров PCR с помощта на планарни емулсионни масиви.…

Самозапълващи се и разделящи платформи. (…

Самонапълващи и разделящи платформи. ( а ) Геометрия за шахматна конфигурация на капан...

Платформи на базата на микрофлуидни капчици. ( а…

Платформи на базата на микрофлуидни капчици. ( а ) Схема, илюстрираща генерирането на капчици с ...

Мултиплексни капкови dPCR анализи. dPCR…

Мултиплексни капкови dPCR анализи. dPCR анализите могат да бъдат мултиплексирани чрез кодиране на нивото...


Разработване на норми за предоставяне на биологични лаборатории в контексти с ниски ресурси: Сборник на семинар (2019)

Чарлз Чиу, MD, PhD, член на комитета за планиране на семинара, направи презентация, озаглавена &ldquoМолекулярна диагностика в настройки с ниски ресурси.&rdquo Той описа &ldquoclassical&rdquo (т.е. немолекулярни) микробиологични методи за тестване, включително:

  • Култура
  • Серология
  • Микроскопия
  • Биохимично профилиране
  • Директно тестване на антиген: Имуноанализ със страничен поток и матрична лазерна десорбция/йонизация (MALDI) за бактериална, вирусна и гъбична идентификация

Молекулярната диагностика или &ldquoDNA-базирано откриване&rdquo включва различни нови и дори експериментални технологии, като например:

  • Хибридизация (сонди), например, групирани редовно разпръснати къси палиндромни повторения (CRISPR)-Cas базирани анализи
  • Генотипиране
  • Секвениране, включително секвениране на нанопори
  • Усилване на сигнала
  • Целева амплификация (полимеразна верижна реакция [PCR]): единичен и мултиплекс

Молекулярните диагностични тестове предлагат някои предимства за настройките с ниски ресурси. Патогените са инактивирани за тестване, така че боравенето с тях е по -безопасно, отколкото при методи, които изискват използването на заразни живи организми, намалявайки потенциала за професионално излагане. Те не разчитат на амплификация, базирана на култура, което е важно, тъй като много патогени

не са култивирани. Тъй като подобно молекулярно тестване позволява извършване на диагностика с неинфекциозни инактивирани патогени, необходимостта от скъпо и сложно ограничаване на BSL-3 или -4 е премахната за диагностична работа върху много опасни патогени. Молекулните методи също предлагат по-бързо време за изпълнение и не изискват големи обеми на пробите.

Д -р Чиу обаче продължи, молекулярните тестове също имат значителни недостатъци. Първо, тези методи са по-скъпи от класическите техники. Един участник отбеляза например, че цената на един комплект за PCR е равна на около 1 година & rsquos заплата за лабораторен работник в условия с ниски ресурси. Второ, оценката на ефективността, валидирането и регулаторното одобрение на много от тези методи са предизвикателство, особено ако работата се извършва извън силно контролирани клинични лабораторни среди, които може да не са налични в условия с ниски ресурси. Д-р Чиу прегледа някои области, в които липсват стандарти за молекулярно тестване, особено за среди, които не са строго регулирани: положителни и отрицателни контроли, платформи, аналитична производителност, целеви патогени и референтни бази данни. Поради тази липса на стандартизация, един и същ анализ в две различни лаборатории може да даде различни резултати, а потвърдителното тестване е бавно и скъпо.

В допълнение, субектите, които обикновено сертифицират и/или одобряват такива тестове (например Американската администрация по храните и лекарствата [FDA], Националният институт по стандарти и технологии на САЩ, Световната здравна организация (СЗО) и различни неправителствени организации) имат все още не е направено за повечето от новите молекулярни технологии. В Съединените щати регулаторната рамка, Измененията за подобряване на клиничната лаборатория (CLIA), ръководи клиничните лабораторни тестове. Той определя минимални стандарти, при които работят всички клинични лаборатории. Лабораториите на CLIA са сертифицирани чрез инспекция от агенция като Колежа по американска патология. Съответствието с CLIA изисква валидиране и осигуряване на качество за всички лабораторни тестове, използвани в клиничната помощ, включително & ldquoлабораторно разработени тестове. & Rdquo Институтът по клинични и лабораторни стандарти (CLSI) също издава & ldquoНасоки & mdashCLSI Молекулярни диагностични методи за инфекциозни заболявания & rdquo), CLI Но сертифицирането по тези рамки не е същото като одобрението на FDA. Освен това много лаборатории в условия с ниски ресурси може да не отговарят на CLIA или подобни регулаторни стандарти за проверка на уменията, включване на стандартизиран контрол и т.н.

Преданалитични, аналитични и пост-аналитични проблеми съществуват за молекулярната диагностика, обясни д-р Чиу. Предварително аналитичните опасения включват необходимостта от подходящи методи за събиране на проби, подходящи срокове, подходящи условия за съхранение както за организмите, така и за компонентите на анализа (напр.

поддържане на студена верига, което е особено важно в условия с ниски ресурси и с лабилна рибонуклеинова киселина [РНК]), и контрол на замърсяването. Аналитичните проблеми се фокусират върху оценката на ефективността на теста и чувствителността, специфичност, прецизност, точност, линейност, матричен ефект, смущения, възпроизводимост и ограничения. Постоналитичните проблеми включват правилното отчитане на резултатите, копия/ml или IU/ml или Log IU/ml, положителни и отрицателни прогнозни стойности (съответно PPV и NPV) и диагностична стойност и клинична полезност.

Въз основа на тези и други съображения, д-р Chiu предостави списък на съответните въпроси, които трябва да бъдат разгледани в контекста на молекулярното тестване в условия с ниски ресурси:

  • Кой ще плати за тест и кой е обучен и сертифициран да го проведе?
  • Колко често ще се провежда тестът? Какви обеми материал са необходими? Оправдават ли конкретните обстоятелства разходите?
  • Могат ли клинично значими организми да бъдат идентифицирани и количествено определени в проби от пациенти или от култура?
  • Ако културата не е възможна, молекулярните методи могат да бъдат оправдани. Но ако те ще се използват за прогноза, наблюдение за насочване на интервенциите в общественото здраве или диагноза за насочване на терапията за отделни пациенти, ще предоставят ли необходимата точна информация?
  • Къде ще се проведе тест и в какви настройки? Подходящи ли са тези настройки за постигане на точни резултати?

След това д-р Чиу описа накратко всяка технологична категория, която изброи в началото на презентацията си, и коментира тяхното състояние на развитие (виж каре 4.1 в края на тази глава).

Д-р Чиу обясни, че директните методи за откриване, като секвениране, не могат напълно да заменят серологията, клонът на лабораторната медицина, който изследва кръвния серум за откриване на антитела и антигени. 1 Той разглежда молекулярните тестове като допълващи, но не заместители на класическите методи за изпитване. Той също така описва етапа на развитие и използване за всяка от молекулярните технологии:

  • PCR е налице, но остава предизвикателство поради липсата на стандартизация.
  • Последователността от следващо поколение все още е ограничена. Въпреки че все още не е одобрен от FDA, в тази област се използва известно нанопорно секвениране.
  • CRISPR-Cas е много обещаващ, но остава във фаза на изследване.
  • MALDI обикновено е твърде скъп за настройки с ниски ресурси.
  • Multiplex PCR е наличен, но също така е скъп.
  • Възможно е анализите, базирани на отговора на домакина, да се развиват бързо в бъдеще.
  • Метагеномното секвениране е обещаващо, но също така скъпо и все още не е широко достъпно.

Д -р Чиу предложи следните съобщения за изнасяне:

  1. Вероятно ще е необходима комбинация от традиционни методи (например имунофлуоресцентни ленти, PCR в реално време) и най-съвременни подходи (например, секвениране на нанопори, CRISPR-Cas анализи, мултиплексирана PCR) за напред.
  2. Разходите и други практически съображения благоприятстват истинската молекулярна диагностика на мястото на грижа (например имуноанализи на страничен поток, CRISPR-Cas).
  3. Ще бъде важно да се реши дали фокусът трябва да бъде върху диагностичните тестове или надзора. Кой (в локо, в страната, международни) какво трябва да правите? Нововъзникващите инфекциозни заболявания не зачитат границите.
  4. Последователността е оказала най -голямо влияние в геномното наблюдение, но все още не в молекулярната диагностика.
  5. MALDI, мултиплексирани PCR платформи (например BioFire, Luminex) и дори PCR инструменти с единичен комплекс (например Cepheid GeneXPert) остават твърде скъпи за използване при диагностика, но могат да бъдат приемливи за целенасочено наблюдение, например по време на огнища.
  6. Спешно е необходима евтина мултиплексирана диагностика, готова за работа, но не съществува.
  7. Подходите за директно откриване вероятно няма да заменят серологията (напр. анализи на страничен поток) скоро.
  8. Сложните данни от геномно секвениране и други методи ще изискват облачни изчислителни ресурси за бързо разпространение на резултатите, което е от решаващо значение за сценариите за обществено здраве.

Д-р Чиу завърши презентацията си, като заяви, че ефективността и точността на много от молекулярните технологии трябва да бъдат демонстрирани, преди те да станат широко използваеми в условия с ниски ресурси. Въпреки че някои тестове се извършват в настройки с ниски ресурси, остава да се свърши много работа.

По време на дискусията, която последва, един участник каза, че неговата група работи за разработване на непробни PCR техники, опитвайки се да използва мултиплексни имуноанализи за серология и осигуряване на Sanger секвениране, използвайки

отдалечен анализ, когато е необходимо, като резервно копие на полеви приложения за PCR. Той отбеляза, че истинските въпроси са как да доставим новите инструменти на полето и да обучим хората на всички тези нови умения, особено боравене с данни, съхранение и сигурност. Някои от наличните сега инструменти не изискват поддръжка и имат патрони за еднократна употреба. Един от подходите за данни е използването на облачна биоинформатика за анализ на данни и връщане на резултатите, така че за тази цел не е необходим местен талант по биоинформатика, при условие че съществува интернет връзка. Друг участник обаче заяви, че комуникациите са реален проблем в областта, тъй като честотната лента е недостатъчна. Следователно облачните подходи може да не работят в ситуация на огнище.

Участник попита дали може да се направи довод за стремеж към самодостатъчност на реагентите. Д -р Чиу отговори, че това е така, защото пазарът на реактиви не е много конкурентен и конкуренцията вероятно ще намали разходите. Същият участник каза, че анализ на разходите и ползите, който не съществува, но е необходим, може да помогне на донорите да решат какъв вид подкрепа трябва да предоставят.

С резюме на д -р Chiu & rsquos за състоянието на техниката и неговите заключения относно технологичната готовност, участниците бяха готови да разгледат практическите аспекти на разгръщането и използването на място. Джонатан Таунър, д-р от Центровете за контрол и превенция на заболяванията в САЩ (CDC) направи презентация за своя опит на място по време на няколко хеморагични вирусни огнища, включително епидемията от ебола в Западна Африка през 2014-2015 г. Опитът на д-р Таунър&rsquos илюстрира прилагането на наличните техники към реални реакции при големи епидемии. Първият му опит на терен е в Уганда през 2000-2001 г., където CDC използва както ELISA, така и PCR базирани тестове. Работата е извършена в болнична лаборатория и повече от 1000 проби са обработени за 3-месечен период, с повече от 280 положителни теста за вируса. През 2005 г. той участва в отговора на огнището на вируса на Марбург в Ангола. Отново бяха използвани ELISA и PCR и този път работата беше извършена в съществуваща лаборатория, създадена за диагностика на ХИВ. Този път 180 от 505 проби от кръв или серум, кърма или тампони бяха установени положителни за вируса. От 2010 до 2016 г. д -р Таунер участва в програма за засилено наблюдение и диагностика на вирусна хеморагична треска (УКВ) в Уганда, за да осигури обучение за местния медицински и друг персонал. Тази програма настани персонала на CDC в страната и помогна за постигане на значително намален брой по-късни случаи на УКВ, както и за намаляване на времето за диагностициране.

След това през 2014 г. настъпи огромното огнище на ебола в Западна Африка, което засегна сериозно Гвинея, Сиера Леоне и Либерия. Това събитие привлича, по думите на д -р Таунер & rsquos, & ldquo Обединени нации & rdquo на полеви отговор с

Германия, Франция, Италия, Белгия, Холандия, Англия, Канада, Съединените щати, Нигерия, Южна Африка, Китай и Русия изпращат хора, оборудване и друга помощ във впечатляващ отговор и усилия за сътрудничество. Американските агенции включват CDC, Националните здравни институти и Министерството на отбраната. Целта беше да се осигури бърза диагностика на място. Общо 27 полеви лаборатории са създадени в Западна Африка.

Мащабът на отговора на епидемията от западноафриканска ебола породи собствени предизвикателства. Например, много различни PCR анализи в реално време бяха използвани в голямата мрежа от лаборатории, създавайки необходимост от качествени панели и опити за стандартизиране на анализите. За панелите, разпространени от CDC в Сиера Леоне и Гвинея, 2 от 6 лаборатории са давали грешни резултати при процент от 10 процента, което изисква прилагане на подобрения. Появи се необходимостта от двуцелеви анализ на Ебола, плюс PCR контрол на клетъчна РНК, за да се намали процентът на фалшиво положителни или отрицателни резултати, когато се използва само една мишена. Липсата на контрол на клетъчната РНК също увеличава риска от фалшиво-отрицателни резултати.

Имаше и предизвикателства пред базата данни, документация и отчитане. Беше трудно да се попълнят формуляри за подаване на проби, така че значителен брой проби имаха малка или никаква документация. Липсваха уникални идентификатори за проби и случаи и трудности при свързването на лабораторни, клинични и епидемиологични данни. Информацията за датата на начало често липсваше, както и информацията дали тампоните са от трупове (подходящи) или живи пациенти (неподходящи). И накрая, имаше проблеми с времето за изпълнение на резултатите, недостатъчен брой обучени флеботомисти и транспортиране на проби.

Д -р Таунер заключи, че много е постигнато, въпреки тези проблеми. Пиковите тестове са настъпили през периода октомври-декември 2014 г., като най-голям брой проби са тествани на 180 на ден през юли 2015 г. Средно 71 % от пробите са тествани в деня на пристигането им в лабораторията, а 99,9 % са били тествани или същия или на следващия ден. Пробите са получени за около 14 месеца от 12 от 14 области и са били основно устни тампони от цяла кръв и труп. Като цяло бяха тествани повече от 27 000 проби. Лабораторията на д-р Towner&rsquos продължи да функционира в продължение на 406 дни, без почивни дни или прекъсвания в тестовете. Пилотно проучване за вирусна персистираност при оцелели мъже започна на 23 май и доведе до тестване на повече от 500 проби от сперма. Изпитването на ваксината в Сиера Леоне, или STRIVE, започна на 24 май и бяха тествани 51 проби от 30 участници. Двадесет и осем екипа от персонал от 17 различни клона в CDC бяха обучени в Атланта за лабораторните протоколи и процедури на Bo и след това бяха разположени, за да помогнат за поддържането на лабораторията да функционира.

След като кризисната фаза на епидемията приключи, д-р Айа Леби от университета Njala в Сиера Леоне беше избран за получател на 3-годишно споразумение за сътрудничество на CDC за провеждане на екологично наблюдение на УКВ радиостанции в региона & rsquos прилепи. Лабораторните съоръжения на университета и rsquos претърпяха основни лабораторни ремонти от март до август 2017 г. Сега има стабилно и правилно поддържано електричество, фризери и друго работно оборудване. Закупуването е оперативно, въпреки че доставката на бързоразвалящи се стоки остава проблем. Това споразумение с университета ще осигури образователни, както и ползи за общественото здраве за региона и илюстрира какво може да постигне партньорството. Събрани са приблизително 5000 екземпляра прилепи, всички от гористи райони. Има две полеви станции, една на остров Тивай в Сиера Леоне, който започва ремонт, и друга в националния парк Gola Rainforest в Либерия.

След презентацията на д -р Towner & rsquos един участник отбеляза, че новите молекулярни технологии намаляват риска, така че са необходими минимални нива на ограничаване, ако патогени като Ебола и Марбург са местни за определено населено място. В такъв случай лаборатории с BSL-3 и -4 вероятно не са необходими, но някои получатели търсят съоръжения с високо съдържание за престиж, а не за реални нужди. Друг участник повтори необходимостта да се прави разлика между лаборатории, провеждащи наблюдение и тези, които провеждат диагностика, и отбеляза, че референтните лаборатории са необходими за идентифициране на щамове и за изследвания. Може би ниското задържане е подходящо за полето, докато за референтните лаборатории е необходимо по-високо задържане.

Въпреки че д-р Чиу каза, че разходите за молекулярните технологии трябва да бъдат намалени, преди да могат да бъдат използвани в условия с ниски ресурси, един участник заяви, че приемливите разходи могат да зависят от заболяването, броя на засегнатите пациенти, разходите за грижи и лечение и други фактори. Това се изразява в често срещани заболявания, които се нуждаят от по-евтини аналитични възможности. Някои технологии вече се разпространяват. Например, 165 машини & ldquoGene Expert & rdquo вече са разположени в Демократична република Конго, въпреки че, както посочи един участник, тяхната производителност е ниска. В допълнение, тези машини откриват само щама Ebola Zaire, който, ако мутира, може да бъде незабелязан като другите щамове. Друг участник отбеляза, че финансиращите лица трябва да отчитат вече разгърнатите способности, когато вземат решения за поддръжка.

Един участник подчерта различните нужди от нормални оперативни ситуации спрямо отговорите на епидемиите. Неговата организация използва тестове Luminex, но това, което е подходящо, зависи от това дали изследователят търси един специфичен патоген или повече. Друг участник заяви, че всичко ново, което се строи, трябва да бъде свързано със съществуващи съоръжения, които са

вече е част от мрежа, за да могат да се споделят реагенти и други ресурси.

Д -р Chiu заяви, че директното откриване на интересуващия организъм е стандартът ldquogold. Клиницистите са по -консервативни от изследователите, така че може да минат 5 до 10 години, преди новите типове тестове да бъдат приети като основа за лечение на пациенти. Тъй като в развиващите се страни вече са се случили неприятни инциденти с тестване на лекарства и ваксини, има особена нужда да бъдем консервативни с молекулярната диагностика като нови инструменти за насочване на медицинското лечение и на тези основания.

Участник повтори, че цената на реагентите е проблем, особено поради малките бюджети на страните с ниски ресурси. Друг участник посочи, че самите технологии са много скъпи и донорите трябва да бъдат посъветвани да разчитат на доказани технологии като базова линия. В светлината на факторите на разходите, друг участник каза, че има смисъл да се използват разпределени набори от лаборатории за основни тестове и да се резервират скъпите, високопроизводителни възможности за централни местоположения. Още един участник отбеляза, че извънредните ситуации са специални, но реагирането при извънредни ситуации ще се подобри, ако повече лаборатории бъдат оборудвани да се справят с нормалния бизнес. Наличието на лаборатория за нормална работа също така поддържа персонала и веригите за доставки обучени и практикувани. Донорите също трябва да се поинтересуват за системите за управление на качеството. В развиващите се страни може да няма налични референтни лаборатории и други ресурси за улесняване на стандартизацията, проверката и други необходими стъпки.

Участник каза, че "ldquoWild West" rdquo може да се дължи на липсата на регулаторен надзор & mdasheven в Съединените щати, но повече в някои развиващи се страни. Друг участник отбеляза обаче, че Франция осигурява надзор във франкофонските страни. Друг участник заяви, че липсата на реактиви и на поддръжката и ремонта на оборудването е кошмар на донорите и rsquos и че обучението за тези последни функции е много необходимо. Друг участник обаче отбеляза, че нивата на образование в някои населени места са толкова ниски, че концепцията за поддръжка не съществува и поради това осигуряването на такова обучение за местния персонал е много трудно. Освен това транспортът представлява пречка за изграждането на референтни възможности. Необходими са партньорства за осигуряване на гориво, сух лед и други лабораторни продукти. Многонационални корпорации, като Coca Cola и петролни компании, например, предоставиха някои от тези доставки. Африканският съюз, Икономическата общност на западноафриканските държави и Южноафриканската общност за развитие са разработили начини за решаване на някои от тези проблеми,

Участник предложи биобанките да бъдат разположени на защитени места, като военни бази. Друг участник отбеляза, че биобанките са сигурни и

признават стойността на живите проби, но може да нямат планове какво да правят с тях, което повдига въпроси дали те трябва да имат колекции без ясно определени цели.

Участниците призоваха за по -широка визия, за да се осигури подготовка за следващото огнище. Те също така поставиха въпроса как да заинтересуват донорите за подобряване на това, което вече съществува, вместо за изграждане на нови съоръжения. И накрая, те се чудеха как донорите могат да помогнат за &ldquolease&rdquo съоръжения след епидемия, както беше направено в Сиера Леоне след избухването на Ебола през 2014 г.

КУТИЯ 4.1 Състоянието на развитие на молекулярната диагностика: Резюме

Д -р Чарлз Чиу описва състоянието на развитие на молекулярната диагностика. Той започна с обяснението, че при &ldquoprobe hybridization&rdquo или неамплифицирани сонди за нуклеинова киселина, вериги на ДНК или РНК с по-малко от 50 базови двойки от проба се изследват за специфична последователност на нуклеинова киселина &ldquotargets&rdquo, която показва наличието на определени патогенни организми. ДНК или РНК нишките са белязани с ензими, антигенни субстрати, хемилуминесцентни молекулни субединици или радиоизотопи. Те се свързват с висока специфичност към комплементарни последователности или на ДНК, или на РНК, което се нарича „ldquohybridization.“ Rdquo Сондите се свързват бързо, при строги условия, и могат да открият дори единична промяна на нуклеотиди в последователност на нуклеинова киселина. Те могат да се използват директно върху проби от пациенти или върху културни изолати. Те обаче са 100-10 000 пъти по-малко чувствителни от методите на амплификация и това ниво на чувствителност може да не е достатъчно за откриване на организми, като вируса на Ебола, които имат нисък брой копия в тъканни проби, като кръв. Хибридизацията на сондата традиционно се използва, когато присъстват голям брой организми, въпреки че, както беше отбелязано, методът не е много чувствителен. Установено е, че е особено полезно за потвърждаване на наличието на видове микобактерии, системни гъби, Campylobacter, Enterococci, Haemophilus influenzae, стрептококи от група А и В, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus и Listeria.

Анализите, базирани на CRISPR-Cas (CRISPR е съкращение от Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats и Cas за CRISPR-асоциирана система) получиха огромно количество напоследък публичност като средство за редактиране на генома. Тези системи, получени от естествен бактериален защитен механизъм срещу вируси, които ги заразяват, са направили редактирането на генома чрез добавяне, замяна или премахване на двойки ДНК бази много по -прецизни, ефективни, гъвкави и по -евтини спрямо предишните стратегии за промяна на гена последователности (Национална академия на науките, Национална академия по медицина, 2017). Те могат да се прилагат при нечовешки организми, хора и микроорганизми. Тези постижения предизвикаха експлозия на интерес от цял ​​свят по потенциалните начини, по които редактирането на генома може да подобри човешкото здраве. Д-р Chiu заяви, че молекулярната диагностика, базирана на CRISPR-Cas, може да бъде „ldquogame-changer“ rdquo за диагностика на инфекциозни заболявания, наблюдение на нововъзникващи патогени, вирусно генотипиране, откриване на антибиотични резистентни фактори, скрининг на рак и други приложения.

Според д-р Chiu CRISPR-Cas & минусовите анализи имат предимства и недостатъци. Сред предимствата е, че тези анализи са силно чувствителни, имат време за изпълнение по -малко от 2 часа и имат голяма гъвкавост на дизайна, изисквайки по -малко от 1 седмица от проектирането до изпълнението. Те са изключително преносими, не изискват електричество или скъпи инструменти и могат да осигурят колориметрични показания, които са относително лесни за интерпретиране. Калифорнийският университет в Бъркли наскоро показа, че човешкият папиломен вирус може да бъде открит директно от гениталната тъкан без екстракция за 1 час с помощта на CRISPR-Cas. В момента се използва и за идентифициране на вируси Зика и денга в клинични проби. Недостатъците обаче включват няколко фактора, свързани с факта, че CRISPR-Cas остава във фазата. Той има неясна способност за мултиплексиране, изисква стъпка на целево усилване, което може да доведе до проблеми със замърсяването, а неговата ефективност в повечето действителни клинични употреби все още не е доказана. Съществуват и важни регулаторни въпроси, както и опасения относно наличието на тестове, тъй като много от предвидените употреби може да са под патент.

Д-р Чиу описа технологиите за усилване на сигнала и целта. Най -широко използваният метод за усилване на сигнала за диагностика е технологията с разклонена верига. Тази технология отдавна се използва за определяне на вирусния товар за ХИВ и хепатит С (Tsongalis, 2006). Може да се използва за откриване на протеини и нуклеинови киселини, както ДНК, така и РНК. Концентрацията на пробата или целта не се променя, но чувствителността се увеличава с повишена концентрация на белязани молекули, прикрепени към целевата нуклеинова киселина. Неговото предимство пред методите за амплифициране на целта, като PCR, е, че откриването & ldquosignal & rdquo е директно пропорционално на количеството на мишената в проба, което позволява по -лесно количествено определяне. Съществува и намален риск от заразяване и инхибиторите не са проблем.

Целевите методи за амплификация, като PCR и транскрипционно-медиирана амплификация (TMA), използват ензимно-медиирани процеси за създаване на копия на целева нуклеинова киселина. Резултатът е, че анализаторът получава милиони или милиарди от целта, което може да доведе до проблеми със замърсяването и фалшиво положителни резултати. Световната здравна организация е издала стандарти за PCR (СЗО, 2016).

PCR е сравнително проста техника за амплифициране и откриване на ДНК и РНК последователности, такива, свързани с генетичния материал на патогени. В сравнение с традиционните методи за клониране и амплификация на ДНК, завършването на които може да отнеме дни, PCR изисква само няколко часа. Двуверижната ДНК първо се топлинно денатурира, за да раздели нишките. След това праймерите се подравняват към отделените ДНК вериги (отгряване), а ДНК полимеразата след това разширява праймерите. Резултатът е две копия на оригиналната ДНК верига. Процесът на денатурация, отгряване и удължаване представлява един цикъл на усилване, който се повтаря 20-40 пъти. След това амплифицираният продукт може да бъде анализиран.

Методът се използва широко за амплифициране на ДНК за експериментална употреба, генетично тестване и откриване на патогенен материал. PCR е силно чувствителен и изисква само малки обеми проби. Д-р Chiu подчертава документ от 2010 г. (Boehme et al., 2010), който показва, че PCR-базирана техника може бързо да открие наличието на туберкулоза, включително резистентни на антибиотици форми, от проби от храчки. Boehme отбеляза, че глобалният контрол на туберкулозата е възпрепятстван от бавни и нечувствителни диагностични методи, особено за откриване на резистентна на лекарства туберкулоза. Ранното откриване намалява смъртността и прекъсва предаването, но сложността и инфраструктурните нужди на чувствителните методи ограничават тяхната достъпност и ефект в условия с ниски ресурси. Тестът за бързо откриване, разработен от Boehme et al. беше бързо разгърнат в Африка и другаде, въпреки че е скъп.

Съществуват и многобройни случаи на междулабораторни несъответствия в резултатите от PCR, което показва разлики в ефективността между лабораториите, въпреки че PCR анализите са валидирани, акредитирани и рутинно използвани в някои лаборатории. В допълнение, &ldquogenomic drift&rdquo влияе върху тези анализи и PCR ефективността се влошава с времето, тъй като вирусите мутират. Мултиплексният PCR, който е желана, но все още не напълно реализирана цел, би позволил анализ на множество цели в една и съща проба. Д -р Chiu цитира документ от Mahoney et al. (2007) за разработването на мултиплекс PCR панелен тест за откриване на 20 човешки респираторни вируси.

Специфичната област на д-р Chiu&rsquos е секвенирането на ДНК. В момента съществуват много устройства и методи за секвениране на ДНК. Например, за бактерии, 16S РНК е част от бактериалната рибозома. Тези РНК фрагменти съдържат области със силно запазена и ldquohypervariable & rdquo последователност, която може да се разглежда като молекулярна & ldquofingerprint & rdquo, която може да се използва за идентифициране на бактериални родове и видове. Тези запазени региони могат да бъдат насочени към усилване на широк спектър от бактерии от клинични проби. Техниката обаче не е количествена поради вариация в броя на копията. Основното предимство на този подход е, че няма нужда от култура, така че може да се използва върху много широк спектър от организми. При този подход ДНК се извлича от клинична проба, като тъкан или телесна течност. 16S РНК гените се амплифицират, секвенират и сравняват с референтна база данни, като GenBank, за да се търси съвпадение. Този вид тестове тепърва стават достъпни в клинични условия. Подобен подход, използващ гените 18S, 28S и ITS, е наличен и за еукариотни патогени (гъбички и паразити).

Друг подход е времето за йонизационна йонизация с лазерна десорбция с помощта на матрица (MALDI-TOF MS). Тази технология се появи като инструмент за идентифициране и диагностициране на непознати микроби от непокътнати клетки или клетъчни екстракти, използвайки протеините, транслирани от микробни геноми. Той е бърз, чувствителен и икономичен. Той е приет от микробиолозите за идентификация на микроби и типизиране на щамове, епидемиологични изследвания и откриване на биологични бойни агенти, патогени, пренасяни от вода и храна,

фактори на резистентност към антибиотици и патогени на кръвта и пикочните пътища (Singhal et al., 2015).

Масспектрометрия (MS) включва йонизиране на химични съединения в заредени молекули и измерване на съотношението им маса към заряд (m/z). MS се използва от началото на 1900 -те години в химическите науки, но развитието на йонизацията с електронно пръскане (ESI) и MALDI през 80 -те години увеличава приложимостта му към големи биологични молекули, като протеини.

Както ESI, така и MALDI се основават на & ldquosoft йонизационни & rdquo методи, които не предизвикват значителна загуба на целостта на пробата. При йонизация и от двете, протеините се превръщат в йони чрез добавяне или загуба на един или повече протони. MALDI-TOF MS има определени предимства пред ESI-MS, тъй като произвежда единично заредени йони, което улеснява интерпретирането на данните. В допълнение, предварително разделяне чрез хроматография е необходимо за ESI-MS, но не и за MALDI-TOF MS, което е напълно автоматизирано. Високата пропускателна способност и скорост, свързани с MALDI-TOF MS, го направиха превъзходен за широкомащабна протеомична работа.

Пробата за анализ чрез MALDI-TOF MS се приготвя чрез смесване или покриване с разтвор на енергийно абсорбиращо органично & ldquomatrix & rdquo съединение. И матрицата, и пробата, уловена в нея, кристализират чрез изсушаване, а пробата в матрицата се йонизира с лазерен лъч. Това генерира протонирани йони от пробата, които след това се ускоряват, така че да се отделят един от друг въз основа на съотношението им маса към заряд (m/z). Съотношението се измерва чрез определяне на времето, необходимо на йона да измине дължината на TOF тръбата (оттук &ldquotime на полета&rdquo). Въз основа на информацията за TOF се генерира характерен спектър, наречен пептиден мас пръстов отпечатък (PMF) за аналити в пробата. Микробите се идентифицират чрез сравняване на MS спектъра на неизвестен микробен изолат със спектрите на известни изолати в референтна база данни. Очевидно ограничението на технологията е, че точното идентифициране на нови изолати е възможно само ако референтната база данни съдържа PMF на типовите щамове на специфични родове, видове и подвидове в пробата.

Темата за неизвестните е много важна при инфекциозните заболявания. Д-р Чиу посочи, че от първите три често срещани заболявания &mdashpneumonia, менингит/енцефалит и треска/сепсис&mdash15-62 процента, 40-60 процента и 20 процента, съответно, са причинени от неизвестни организми и се пропускат в болничните диагностични лаборатории дори в развити страни. Това прави идеята за възможността за секвениране на всичко в пробите на пациента привлекателна, което вече може да се направи с помощта на метагеномно секвениране от следващо поколение. Метагеномиката преодолява двойните проблеми на невъзможността да се култивират повечето микроорганизми и справянето с огромното геномно разнообразие от микроби. Това са най-големите пречки пред напредъка в клиничната и екологичната микробиология (National Research Council, 2007). Метагеномиката се стреми да разбере

биология на агрегирано ниво, надхвърляща отделните организми и фокусирайки се върху гените в цяла микробна общност, независимо дали това е от проба от почвата или от човешкото тяло. Това също така изисква разработването на усъвършенствани изчислителни методи, които максимизират разбирането за генетичния състав и дейностите на общностите, толкова сложни, че те могат да бъдат подбрани, но никога напълно характеризирани (Национален изследователски съвет, 2007).

Въпреки че все още е сравнително нова наука, метагеномиката е създала много нови знания за некултурния микробен свят, използвайки радикално нови начини за правене на микробиология. Цялата работа по метагеномика започва със същата първа стъпка: ДНК се извлича директно от всички микроби, присъстващи в определена проба. Тази смесена ДНК проба може след това да се анализира директно или да се клонира във форма, поддържана в култивируеми лабораторни бактерии. Това дава възможност на изследователите да създадат библиотека от геноми на всички микроби, открити в тази проба. Тази библиотека от своя страна може да бъде изследвана или чрез анализ на нуклеотидните последователности на клонираната ДНК, или чрез определяне на какви протеини правят клонираните гени, когато се експресират. Техниката се поддава на сортиране на сложни болестни ситуации, които могат да имат много различни причини. Например, тропическите фебрилни заболявания могат да бъдат причинени от множество видове бактерии, вируси или паразити, докато имат подобни симптоми, а използването на метагеномика може да помогне да се определи кой конкретен организъм причинява треска при засегнатите пациенти.

Метагеномната библиотека е аналогична на хиляди пъзели, смесени в една кутия, и повторното сглобяване на пъзелите е едно от големите предизвикателства на метагеномиката. Подходът вече е възможен поради наличието на евтино, високопроизводително ДНК секвениране и усъвършенстваните изчислителни възможности, необходими за осмисляне на милионите произволни последователности, съдържащи се в библиотеките на генома. Последното изисква стабилен биоинформатичен тръбопровод, като например последователния базиран ултра-бърз идентификатор на патогени (SURPI), посочен от д-р Chiu.

Като пример за технология за метагеномика, която може да бъде подходяща за използване в условия с ниски ресурси, д-р Chiu обсъди секвенирането на нанопори, което позволява откриване на метагеномни патогени в реално време при пациенти с треска/сепсис. Предимствата на секвенирането на нанопори включват способността му да извършва анализ на последователности в реално време, дълги четения и директно секвениране на ДНК, РНК и протеин от проби. Той е преносим с помощта на устройство с джобен размер, не изисква интернет връзка и предлага потенциално бързо време за изпълнение, което е ключово за последователността на инфекциозните заболявания. Недостатъците му са, че използването му е скъпо (500 долара за проточна клетка), все още има процент на грешки от 8-12 процента, а качеството на неговите проточни клетки може да бъде променливо. Все пак, секвенирането на нанопори е успешно използвано за наблюдение на Ебола в реално време в Западна Африка (Quick et al., 2016). Бързо и др. показват, че са генерирали резултати за по-малко от 24 часа след получаване на положителен резултат за ебола

проба, като процесът на секвениране отнема само 15-60 минути. Това илюстрира, че геномното наблюдение в реално време е възможно в условия с ниски ресурси и може да бъде установено бързо за наблюдение на огнища. Групата на д-р Chiu&rsquos от Калифорнийския университет в Сан Франциско също публикува скорошен документ (Thézé et al., 2018), който описва използването на метагеномика за реконструкция на въвеждането и разпространението на вируса Zika в Мексико и Централна Америка.

В друга статия, цитирана от д -р Chiu, Gardy and Loman (2017) се посочва, че:

&ldquoПоследните епидемии от Ебола и Зика демонстрират необходимостта от непрекъснато наблюдение, бърза диагностика и проследяване в реално време на нововъзникващите инфекциозни заболявания. Бързо, достъпно секвениране на геноми на патогени, което сега е основен елемент на микробиологичната лаборатория на общественото здравеопазване в условия с добри ресурси, може да засегне всяка от тези области. Свързването на геномната диагностика и епидемиологията с иновативни цифрови платформи за откриване на болести повишава възможността за отворена, глобална, цифрова система за наблюдение на патогени. Когато е информирана от подхода на едно здраве, при който здравето на хората, животните и околната среда се разглеждат заедно, такава базирана на геномика система има голям потенциал за подобряване на общественото здраве в условия, в които липсва стабилен лабораторен капацитет.&rdquo

Въпреки това има предизвикателства за реализирането на този потенциал. Гарди и Ломан описват някои от тези предизвикателства за вируса Зика, който проявява ниски вирусни титри, малък геном (& lt11 килобази) и преходна виремия. Взети заедно, тези фактори усложняват откриването на вирусна нуклеинова киселина чрез метагеномен подход. Гарди и Ломан също съобщават, че получаването на достатъчно количество вирусна нуклеинова киселина за секвениране на генома извън простата диагностика може също да изисква PCR и подход за секвениране на ампликон. Други предизвикателства могат да включват & ldquoдостъп до надеждни интернет връзки, възможност за събиране на примерни метаданни и превеждане на геномни находки в препоръки в реално време, които могат да се прилагат. & Rdquo


Виртуални лаборатории и симулации по биология

Ето моите любими виртуални лаборатории и симулации за изучаване и изследване на биология, когато практически опции не са налични.

Разширяем софтуер за ума

За първи път открих този скъпоценен камък на сайт, когато миналата година търсех алтернативи на дисекции на животни. Въпреки че това е един ресурс, който не е безплатен, си заслужава много разумната цена.

Лабораторията за виртуална дисекция на eFrog

На този сайт ще намерите първокласни виртуални дисекции на животни. Налични са много дисекции: риба (минога, акула и костур), котка, фетално прасе, дъждовен червей, жаба и безгръбначни (калмари, морски звезди и раци).

За всяка дисекция студентите могат да изследват както външната, така и вътрешната анатомия. Тъй като използват виртуалните пинсети за отстраняване на органи, се предоставя обяснение за всеки орган. Освен това учениците могат да изберат да гледат видеоклип, свързан с този конкретен орган. Например, при извършване на дисекция на виртуална жаба, ученикът може да гледа видеоклипове на чревната перисталтика, изпомпването на сърцето и надуването на белите дробове.

В допълнение към виртуалните дисекции, този сайт има и други виртуални лаборатории.

В лабораторията Animacules учениците могат да разглеждат различни клетки чрез виртуален микроскоп.

Просто съм луд по лабораторията на eFly. Учениците изследват генетични кръстоски, докато на практика размножават плодови мухи. Докато анализират потомството на плодовите мухи на своите кръстоски, те се запознават с Punnett Squares, доминиращи и рецесивни генни алели и черти, свързани с пола.

Това е далеч един от любимите ми ресурси за виртуални лаборатории! Те имат възможност да изпробват лабораториите в демо режим, преди да закупят.

BioInteractive

В допълнение към някои фантастични видеоклипове, учебни планове и други дейности, Biointeractive има някои хубави виртуални лаборатории по биология.

Докато завършва лабораторията за бактериална идентификация, студентът се ръководи през процеса на използване на PCR за идентифициране на неизвестни бактерии, изолирани от паничка на Петри.

В лабораторията за идентификация на бактерии студентът се води през процеса на използване на PCR за идентифициране на неизвестни бактерии, изолирани от петриева паничка.

Във виртуалната лаборатория по кардиология студентът изследва 3 пациенти и използва резултатите, за да определи диагнозата. Това е фантастична симулация за тийнейджъри, които обмислят кариера в медицината и смятам да използвам тази година с моите студенти по анатомия и физиология.

Научете генетиката

Виртуалната лаборатория за PCR от Learn Genetics

От години Learn Genetics е един от любимите ми сайтове за идеи за преподаване на ДНК и генетика. Имат и някои виртуални лаборатории и симулации. Техните интерактивни симулации помагат на студентите да разберат процедурите, които учените използват за изследване на клетки и ДНК, включително PCR, гел електрофореза, поточна цитометрия, екстракция на ДНК и ДНК микрочипове.

Биоман Биология

Bioman Biology предлага игри и виртуални симулации на своя уебсайт. Това са малко повече като игри, отколкото виртуални лаборатории, но се правят по начини, които помагат на учениците да разберат материала.

В симулацията на дихателното пътуване учениците пътуват през всички части на дихателната система: първо като молекула кислород, а след това като молекула на въглероден диоксид.

Симулация, която смятам да използвам в моя клас по анатомия и физиология, се нарича Respiratory Journey.

В него вие контролирате пътя на една кислородна молекула, докато тя си проправя път през дихателната система: през трахеята, в белите дробове, през стените на авеолите и в кръвния поток, през сърцето и до клетките на тялото. След това учениците изтеглят кислородната молекула в митохондриите на клетката и наблюдават как тя се използва за производство на АТФ. След това те поемат молекула въглероден диоксид (отпадъци от клетъчното дишане) и насочват пътуването й обратно през вените към сърцето, обратно към белите дробове и обратно навън в трахеята.

Това е наистина страхотно интерактивно изживяване и очаквам, че ще помогне на учениците да направят множество връзки между общата анатомия и клетъчните процеси.


Предложение за алтернативен праймер за мултиплексния PCR на мрежата ARTIC за подобряване на покритието на секвенирането на генома на SARS-CoV-2

Група биолози, ARTIC Network, предложи мултиплексиран набор от PCR праймери за анализ на целия геном на новия коронавирус, SARS-CoV-2, скоро след разкриването на епидемиите от този патоген. Изглежда, че комплектът праймери вече е адаптиран от много изследователи по целия свят и допринася за висококачествената и бърза геномна епидемиология на този потенциален пандемичен вирус. Видяхме също така отличното представяне на техния набор от праймери и протокол, наборът от праймери беше в състояние да усили всички желани PCR продукти с приказни малки амплификационни пристрастия от клинични проби със сравнително висок вирусен товар. Въпреки това, ние наблюдавахме рязък спад на показанията, получени от два конкретни PCR продукта, 18 и 76, от 98 -те посочени продукта, тъй като вирусният товар на пробата намалява. Подозирахме, че причината за този проблем с ниско покритие се дължи на образуването на димер между праймерите, използвани за амплификация на тези два PCR продукта. Тук предлагаме да се замени само един от тези праймери, nCoV-2019_76_RIGHT(−), с новоразработен праймер. Резултатът от подмяната на праймера показа подобрение в покритието в двата региона, насочени към продуктите, 18 и 76. Очакваме тази проста модификация да разшири границата за целия анализ на генома на SARS-CoV-2 до проби с по-нисък вирусен товар и да увеличи геномния епидемиология на този патоген.


Методи за идентифициране и типизиране за изследване на бактериални инфекции: кратък преглед и микобактериални като случай на изследване

Грасиела Castro-Escarpulli 1, Nayelli Maribel Alonso- Aguilar 1, Gildardo Ривера S & aacutenchez 3, Virgilio Bocanegra-Garcia 4, Xianwu Guo 5, Сара R Ju & aacuterez-Enr & iacutequez 6, Жулиета Luna-Herrera 2, Cristina Majalca Mart и iacutenez 5, Агилера-Arreola Ма Гуадалупе 1*

1 Laboratorio de Bacteriolog & iacutea M & eacutedica, Departamento de Microbiolog & iacutea, Мексико

2 Laboratorio de Inmunoqu & iacutemica II, Departamento de Inmunolog & iacutea, Escuela Nacional de Ciencias Biol & oacutegicas del Instituto Polit & eacutecnico Nacional, Мексико DF, 11340, Мексико

3 Laboratorio de Biotecnología Ambiental, Мексико

4 Laboratorio de Medicina de Conservación, Мексико

5 лаборатория. Biotecnología Genómica Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico Nacional, Рейноса, 88710, Мексико

6 Laboratorio de pruebas especiales, Centro M & eacutedico Nacional 20 de Noviembre del Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de los Trabajadores del Estado, Мексико DF, 03229, Мексико

*Кореспондент автор: д-р Ма. Гуадалупе Агилера Арреола
Laboratorio de Bacteriolog & iacutea M & eacutedica
Отделение за микробиология и иакутея
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
IPN, еск. Prolongación de Carpio y Plan de Ayala s/n
Полковник Каско де Санто Том и Дел Мигел Идалго
CP. 11340. México City, DF, Мексико
Тел: (+52-55) 57296300, разширение 62374
Факс: (+52-55) 57296207
Електронна поща: [имейл и#160 защитени]

Дата на получаване: 25 октомври 2015 г Дата на приемане: 05 декември 2015 г. Дата на публикуване: 15 декември 2015 г.

Цитат: Aguilera-Arreola MG. Методи за идентифициране и типизиране за изследване на бактериални инфекции: кратък преглед и микобактериални като случай на изследване. Arch Clin Microbiol. 2015 г., 7: 1.

Резюме

Няколко техники, базирани на молекулярна биология и аналитична химия е разработена, за да намали някои от ограниченията на бактериалната характеристика. Молекулярните методи представляват най -добрата алтернатива за идентифициране бактериални щамове изолирани от различен произход и за подобряване на изследванията в контекста на молекулярните епидемиология. Тези методологии обаче са трудоемки и скъпи в сравнение с фенотипните или класическите техники и няма надеждни рутинни лаборатории. Този преглед ще предостави основни елементи за разбирането на тези методологии и ще повиши интереса към тяхното съвместно използване между аналитичните лаборатории, където бактериалната идентификация и типизиране са приоритетни, тъй като молекулярните методи не се прилагат универсално, но са налични в изследователски и референтни лаборатории.

Ключови думи

Идентификация Характеристика Бактериални инфекции

Въведение

Една от основните задачи на микробиологичната лаборатория е да идентифицира напълно микроорганизмите, участващи в процеси, свързани с инфекция или свързани с хората. Това позволява да се знае техните етиопатогенни последици, тяхната клинична еволюция, както и да се приложи ефективна антимикробна терапия [1].

Идентифицирането и характеризирането на бактерии в миналото се основаваше на различни фенотипни и генотипни методи (маса 1) обаче през последните десетилетия се наблюдава, че генотипните методи могат да представляват по -добра алтернатива за установяване идентичността на бактериите и за обогатяване на епидемиологичните изследвания на инфекциозните болести [2].

Фенотипни методи Генотипни методи
Биохимични реакции Хибридизация
Серологични реакции Плазмиден профил
Чувствителност към антимикробни агенти Анализ на полиморфизма на плазмидите
Податливост към фаги Рестрикционни ензими храносмилане
Чувствителност към бактериоцини Реакция и разделяне чрез гел електрофореза с импулсно поле (PFGE)
Профил на клетъчните протеини Риботипиране
Полимеразна верижна реакция (PCR) и нейните варианти
Лигазна верижна реакция (LCR)
Система за усилване на базата на транскрипция (TAS)
Многолокусно въвеждане на последователност (MLST)
Сполиготипиране и MIRUS-VNTR

Маса 1: Методи, използвани в клиничните лаборатории за идентифициране или типизиране на бактерии.

Бактериалните инфекции причиняват заболеваемост и смъртност и са отговорни за увеличаването на разходите и времето за хоспитализация на пациентите. Времето, необходимо за идентифициране на патоген въз основа на неговите фенотипни характеристики, е първото предизвикателство, тъй като пробата трябва да бъде засадена и инкубирана за най-малко 24 часа и след това конвенционалните биохимични тестове трябва да се извършат за поне още 24-часов период, състояния, които забавят резултатите и компрометират здравето на пациента и пациента.

Понастоящем в много микробиологични лаборатории използването на автоматизирани или полуавтоматизирани търговски системи за идентификация на бактерии е обичайна практика, като например: API ENTEROTUBE, VITEK, PHOENIX, MALDI-TOF MS и системата GENOTYPE MYCOBACTERIUM CM за микобактерии. Някои от характеристиките, които се вземат предвид при избора на идентификационна система, са: леснота за инокулиране на пробите, характеристиките, които трябва да се определят, необходимото боравене за обработка на пробата след инкубация, както и наличието и обхвата на бази данни [3].

Фенотипните методи не винаги могат да идентифицират микроорганизма до видовото ниво и още по -малко до нивото на щама. Следователно, ако трябва да се определи пробив, при който е отговорен само един клонинг, се изисква повече време и използването на генотипни (молекулярни) или по -специфични имунологични техники. Въпреки ограниченията си, фенотипните техники осигуряват първоначална идентификация, която позволява вземане на решения и е по-достъпна в клиничните лаборатории или болници поради ниските си разходи и достатъчно обучение на персонала в тази здравна област [4].

Методите за изолиране и идентифициране на организми от човешки проби, биологични продукти или от всеки друг произход включват изолирането в чиста култура на интересуващия организъм, последвано от необходимите тестове за разпознаване на микробния метаболизъм и/или чрез различни имунологични техники което ще улесни идентификацията. В много аспекти методите на култивиране и други техники, използвани за идентификация, са ограничени по отношение на чувствителността, специфичността или и двете. Подобренията в чувствителността, специфичността и необходимото време се основават на напредъка в молекулярната биология, който е интегриран в търговските стратегии за бързи диагнози. Използването на техники на молекулярна биология за идентифициране и проследяване на патогени се основава на характеристиките на генома на конкретния организъм, който трябва да бъде открит или характеризиран. Въпреки това, няколко аспекта все още усложняват приложението им в микробиологичната лаборатория: трудността при изолирането, бавният растеж, разходите за тестовете и слабата им чувствителност за откриване за идентифициране на някои бактериални видове, идващи от сложни проби, наред с други.

Този преглед обхваща различните фенотипни, наричани още класически, методологии, както и различни методи на молекулярна биология, които се прилагат за бактериална характеристика. По същия начин, той е насочен към повишаване на интереса към съвместното използване на тези методологии сред лаборатории, където бактериалната идентификация и типизиране са приоритети, тъй като въпреки че молекулярните методи все още не са универсално приложени, те са достъпни в изследователски и референтни лаборатории, които биха могли да предоставят експертния опит да решава с методологии от първо ниво здравните проблеми на дадена страна.

Фенотипна идентификация

За идентифициране на причинителя на инфекциозния процес трябва да се има предвид следното: 1) вземане на проби, 2) определяне на микроскопични и колониални морфотипове и 3) идентификация въз основа на бактериалния метаболизъм чрез конвенционални или автоматизирани тестове [2]. Фенотипното изследване представлява класическата гледна точка за идентификация и повечето стратегии за идентификация се основават на нея [5].

В повечето случаи фенотипната идентификация се основава не само на един метод, а по-скоро на комбинация от повече от един. Пробата трябва да идва от мястото, където микроорганизмът причинява увреждането, или трябва да бъде представителен за мястото или продукта, където се размножава. Някои проби, използвани в клиничната микробиология, са: изпражнения, урина, фарингеален ексудат, цереброспинална течност, сълзи, сперма, вагинална течност, тъкани и/или биопсии. Някои методи изискват чисто изолиране на микроорганизма от пробата, докато други не се нуждаят от това. Фенотипната бактериална идентификация се основава основно на сравнението на фенотипните характеристики на неизвестни бактерии с тези на типовата култура. Надеждността на идентификацията е пряко пропорционална на броя на сходните характеристики. В медицинската бактериология предишният опит на анализатора и връзката между микроорганизмите, мястото и вида на инфекцията са инструментални за предварителната идентификация. Следователно в традиционния или класическия процес на бактериална идентификация са установени три нива на обработка [1].

а) Първите тестове се разглеждат на първо ниво. Това са бързи и лесни за извършване тестове, като поемане на багрила и петна като Грам или Зил-Нилсен, микроскопско определяне на бактериалния морфотип, разкрит от петна, характеристики на растеж при различни инкубационни атмосфери, различни температури и в различни хранителни среди, производство на ензими оксидаза и каталаза, окисляване-ферментация, глюкозна ферментация, производство на спори и подвижност. Чрез тези тестове обикновено е възможно временно да се постави патогена в някои от основните групи с клинично значение. След това могат да се използват други методи с по-голяма дискриминационна сила, за да могат да се разграничат микроорганизмите, които представят много подобен аспект в макро и микроскопските анализи [6].

б) Второто ниво на идентификация трябва да уточнява рода на микроорганизма. Както на това, така и на предишното ниво хипотезата за вероятно идентичността на микроорганизмите се основава на характеристиките на културата и на първичните тестове, които ще позволят да се определи родът, групата на родовете или в някои случаи семейството на изолата. Трябва да се вземат предвид и клиничните данни. Това ще зависи до голяма степен от стабилен модел на фенотипни характеристики и от експертния опит на микробиолога [7].

в) Накрая, третото ниво на идентификация е на ниво вид. Някои биохимични тестове позволяват точно идентифициране на повечето от клинично значимите бактерии. Ако това не е възможно, може да се използва по -обширна батерия от тестове, като тези, открити в различни търговски системи.

На пазара се предлагат множество системи или оборудване за множество тестове, за да се направи идентификацията на бактериите бърза и надеждна. Тези техники изискват прецизен контрол на инокулатора, неговата чистота и начин на инокулиране, инкубиране и четене на тестовете, тъй като неспазването на тези критерии може да доведе до грешки. Тези системи могат да бъдат ръчни, полуавтоматизирани или автоматизирани. Резултатът се сравнява със стандартизирани тестове или с базата данни с числени профили, които търговските методи са разработили за тази цел. Ограничение е появата на мутиращи щамове и придобиването на плазмиди, които могат да дадат произход на щамове с различни характеристики [5,8].

За разлика от лабораториите по клинична биохимия или хематология, които са се възползвали от технологията за опростяване на обработката на проби и по този начин за получаване на резултати за кратко време, автоматизацията на микробиологичната лаборатория е по-сложна предвид голямото разнообразие от клинични проби, които трябва да бъдат анализирани и присъщите характеристики на различни микроорганизми. Напоследък масспектрофотометрията (MS) стана част от микробиологичната лаборатория, предлагаща бърза и надеждна алтернатива за идентифициране на микроорганизми, включително една от най-трудните идентифицируеми бактериални групи, микобактерии [9,10].

MS е аналитична техника, която позволява да се анализира с голяма точност състава на различни химични елементи, като позволява измерване на йони, получени от молекули, и ги разделя в зависимост от съотношението им маса/натоварване (m/z) [11]. Масспектърът на всяко съединение е наречен "ldquochemical trace" & rdquo и представлява графично представяне на получените фрагменти, с нарастващ ред на масата по отношение на относителното им изобилие. Идентификацията на бактериите въз основа на протеиновия профил, получен чрез MALDI-TOF масспектрометрия, беше предложена преди няколко десетилетия. Въпреки това, той се използва едва наскоро като бърз и надежден метод за идентификация на бактерии [9]. Комерсиализираните в момента платформи използват MS за идентифициране на микроорганизми чрез различни подходи: идентификация въз основа на специфичния протеинов профил на всеки микроорганизъм (протеомен подход) или на базата на анализ на неговите нуклеинови киселини (геномен подход). Някои от търговските системи, които използват MS, са: MALDI-TOF за микробна идентификация MicrobeLynxTM на Waters Corporation, MALDI BiotyperTM на Bruker Daltonics и MS-ID на BioM & eacuterieux [12]. Последният позволява идентифициране на микобактериите [13].

Генотипна (молекулярна) идентификация

През последните години и с появата на нови методологии, базирани на молекулярни методи, беше постигнат голям напредък в диагностиката на клинично значими бактерии. Сред тях се открояват откриването на рибозомна РНК чрез хибридизация с ДНК сонда и това на амплификация на нуклеинови киселини от клинични проби. Тези техники подобряват чувствителността и диагностичната специфичност по отношение на други техники за откриване, включително култура, а в някои случаи позволяват едновременно откриване на няколко микробни агента от една и съща проба [14].

Първата стъпка в развитието на методологии, базирани на техники на молекулярната биология, беше подкрепена от откриването на нуклеинови киселини на микроорганизми чрез сонда чрез хибридизация. Генетичната сонда е молекула нуклеинова киселина, в монокатенирано състояние и маркирана, която може да се използва за откриване на комплементарна ДНК последователност. Олигонуклеотидни сонди се получават от естествена ДНК чрез клониране на ДНК фрагмент в подходящи плазмидни вектори и след това изолиране на клонираната ДНК или чрез директен синтез чрез комбинативна химия. Сондите могат да бъдат етикетирани с вещества, които предизвикват цветни реакции при подходящи условия [15].

Техниките за хибридизация на ДНК са сравнително лесни за изпълнение и интерпретация. Вече са налични техники за амплификация, базирани на откриване на ДНК с помощта на полимеразна верижна реакция (PCR) и лигазна верижна реакция (LCR) или транскрипционно-медиирана специфична рРНК амплификация, както за извършване в домашни условия, така и за придобиване в търговската мрежа. Тези техники осигуряват по -бързи резултати с по -добра чувствителност и специфичност от конвенционалните техники.В зависимост от вида на пробата, тези техники откриват от 15 до 20% повече инфекциозни агенти от конвенционалните и 25 до 70% повече, отколкото чрез имунофлуоресценция или ензимна имуноанализа (EIA) [14,16].

Изграждането на сонди за откриване на маркери за вирулентност, като тези, насочени към гени, кодиращи токсини, позволява идентифициране на онези организми, които носят тези гени в клиничните проби, без да се налага да се култивират пробите. Примери за по -късните са сондите за Ешерихия коли ентеротоксини, за Вибриохолерен токсин, или за токсини на Clostridium difficile, който може да се приложи директно към фекални проби [17].

За откриване на микроорганизми се използват различни целеви гени, например тези, причиняващи инфекции на полово предаване (STI), които са били използвани при PCR анализи, сред които са гени omp1 и omp2 на основните мембранни протеини (MOMP) за изследване на основните етиологични агенти, криптичния плазмид pCT и гените 16S рРНК и 23S рРНК, за анализи, адресирани при идентифициране C. trachomatis [14,18,19]. Фокусиране върху гени 16S рРНК и 23S рРНК повишава чувствителността на анализа, тъй като обикновено има множество копия в микроорганизмите. Някои автори обаче предполагат, че кръстосаните реакции с други бактерии могат да създадат проблем, докато други са показали, че използването на запазени региони на ген 16S рРНК в реакциите на амплификация позволява видово-специфична диференциация [19, 20]. Използването на гени и целеви региони за откриване на микобактерии е добре проучена област, особено поради трудностите, породени за изолирането на тези микроорганизми от биологични проби и освен това поради настоящите трудности при боравенето с тези много вирулентни микроорганизми. Няколко последователности, гени и интергенни области са използвани за идентифициране на този бактериален род, сред тях, rRNA 16-23S регион, гени 16S рРНК, gyrB и rpoB, вмъкващият елемент IS6110 и елиминиращите области на диференциация RD1 и RD4 [21]. Изследването на тези гени или генетични последователности чрез PCR в крайна сметка ще позволи сравнителен анализ на последователността на получения продукт с последователностите на референтни изолати. Разработени са няколко търговски сонди за диагностициране на инфекциозни заболявания, но капацитетът за откриване на малък брой организми или няколко копия на гена в клиничната проба все още е ограничаващ фактор за тази техника. Въпреки това, комбинацията от PCR с хибридизация на сонди може да се превърне в метод на избор, особено за микроорганизми, чиято култура в лабораторията е бавна и трудна [15].

PCR е инвитро метод на ДНК синтеза, с който определен сегмент от ДНК се амплифицира чрез разделяне с двойка фланкиращи праймери. Копирането се постига експоненциално чрез повтарящи се цикли на различни инкубационни периоди и температури в присъствието на термостабилен ензим на ДНК полимераза. По този начин милиони копия на желаната ДНК последователност могат да бъдат получени за няколко часа. Това е високо специфична, бърза, чувствителна и гъвкава молекулярна биологична техника за откриване на най-малките количества от специфична ДНК, насърчавайки лесното й идентифициране и избягване на използването на радиоизотопи [22]. Въпреки предимствата, които PCR техниката предлага в сравнение с културата за откриване на някои микроорганизми, наличните в търговската мрежа техники са оскъдни и са ограничени до изследователски лаборатории или до референтни лаборатории, специализирани в молекулярна диагностика, наред с други причини, поради тяхната висока цена. Алтернатива, за да стане възможно използването на молекулярни диагнози, тъй като рутинните техники биха могли да бъдат получаването на реагенти по отделен начин и стандартизирането на протоколите за екстракция и амплификация на нуклеинови киселини, разработени във всяка диагностична лаборатория, това би довело до значително намаляване на технологичната зависимост и до повишаване на чувствителността и специфичността на използваните диагностични техники [23].

Множественото усилване за едновременното откриване на някои микроорганизми повишава в някои случаи чувствителността и специфичността на тези, адресирани към един микроорганизъм. Този PCR вариант се нарича множествен PCR (mPCR), при който повече от една целева последователност може да бъде амплифицирана едновременно чрез включване на повече от двойка праймери в реакцията [24]. Тази техника се прилага успешно в много диагностични области, като изследване на инфекциозни заболявания, генотипизиране на видове, диагностика на наследствени заболявания, идентифициране на мутации, палеонтология, антропология и съдебни науки, наред с други, тук техниката е показала потенциала да спести значително време, без да се компрометира полезността и ефективността на теста [24]. От друга страна, платаформите за идентифициране на патогени стават достъпни като пиросегениране и спектроскопия [25].

В амплификационно-пиросеквениращите платформи бактериалната идентификация се постига чрез PCR на три вариабилни области на 16S рРНК (V1-V3 или V1, V2 и V6). Получават се по -ниски ампликони от 500 bp, съставът на техните нуклеотиди може да бъде определен чрез излъчване на светлина чрез отделяне на пирофосфати (странични продукти за удължаване чрез полимеризация на ДНК веригата). Тази платформа е все по -иновативна въз основа на типа клинична проба и на определянето на различни генични фрагменти, съответстващи на различните фактори на вирулентност и устойчивостта към антимикробни средства, което подобри гъвкавостта на тази платформа [2,25]

Друга иновативна платформа за бактериална идентификация е съчетаването на амплификация (чрез PCR) и мас спектрофотометрия (PCR/ESI-TOF). Последното позволява универсално откриване на един или повече патогени, срещани в голямо разнообразие от проби (екологични, клинични, хранителни, o в култури). Състои се в екстракция на нуклеинови киселини и PCR амплификация с праймерни двойки с широк диапазон. Получават се един или няколко PCR продукта, които съответстват на геномни идентификационни региони на различните микробни домени по отношение на сложността на проблемната проба. Продуктите се обезсоляват и след това йонизират и аерозолизират към масспектрометъра, генерирайки сигнали, които се обработват, за да се определи тяхната маса и състав. Резултатите се интерпретират със стратегията TIGER (Триангулационна идентификация за генетична оценка на рисковете) и достъп до информацията в геномна база данни, която определя вида. Предимствата на тази платформа са, че не изисква култура, ефикасна е в полимикробни проби и, в случай на нехарактеризирани нови патогени, позволява приписването им към бактериални родове или семейства. В допълнение, той също така позволява да се открият някои гени за вирулентност и устойчивост и типизиране на идентифицирания микроорганизъм [2,12].

Тип на микроорганизми

След идентифициране на бактерии микроорганизмите трябва да бъдат въведени за епидемиологични изследвания, следователно системите за молекулярно типизиране представляват един от приносите на молекулярните техники към микробиологията, широко използвани през последните години. Тези системи включват голямо разнообразие от техники, насочени към сравняване на структурата на геномите на силно взаимосвързани организми.

Методите за типизиране (фенотипни и генотипни) позволяват диференциране на един бактериален щам от друг. Преди да използвате техника за типизиране, е важно да се гарантира, че методът може да се разграничи между несвързани изолации, че е в състояние да открие един и същ щам в различни проби и че отразява генните връзки между изолациите с епидемиологична връзка [26].

От практическа гледна точка системата за въвеждане трябва да бъде възпроизводима, да има висок капацитет на дискриминация и да бъде лесна за използване и интерпретация на резултатите [26]. Независимо от това, изборът на молекулярен метод зависи и от други фактори, като микроорганизма, който ще се изследва, клиничната проба, целта, която ще се изследва (единичен ген или целият геном), областта на приложение, инфраструктурата, налична в клинична лаборатория и скоростта, необходима за постигане на резултат. След като микроорганизмът бъде идентифициран, е важно да се знае дали той е отговорен за пробив, следователно трябва да се извършат съответните епидемиологични изследвания. За осъществяване на този процес са използвани различни молекулярни техники, тези инструменти са насочени към определяне на клоналната връзка, която съществува между няколко изолати на даден вид. Тази информация е полезна при спорадични инфекции и още повече по време на избухване на болести и епидемии, тъй като позволява да се определи броят на циркулиращите клонинги, да се открият патогените и rsquo пътя на предаване, да се идентифицира източникът на инфекция, да се разпознаят особено вирулентните щамове и по този начин да се доведе до най -подходящото лечение [27,28].

Технологиите за типизиране, базирани на целия геном на микроорганизма, дават по -добри резултати при установяване на клоналната връзка. Въпреки това, за този анализ е необходимо смилане на генома с рестрикционни ензими, за да се получат ДНК фрагменти с различни размери, които осигуряват модели или профили, след като бъдат разделени чрез електрофореза. От друга страна, има неудобството, че различните фрагменти, получени от процедурата за ограничаване, са фрагменти с големи размери, които трябва да бъдат анализирани чрез гел електрофореза с импулсни полета (PFGE) [26]. PFGE е техника, широко използвана за типизиране на клинично значими бактерии. Неговото значение се основава на това, че този вид електрофореза е способна да отделя фрагменти с дължина по -висока от 50 kb до 10 Mb, което не е възможно с конвенционалната електрофореза, която може да отдели само фрагменти от 100 bp до 50 kb. Този капацитет на PFGE се дължи на неговата многопосочна характеристика, която непрекъснато променя посоката на електрическото поле, като по този начин позволява преориентация на посоката на молекулите на ДНК, така че те да могат да мигрират през агарозния гел, в допълнение към това събитие , приложените електрически импулси са с различна продължителност, насърчавайки преориентацията на молекулите и разделянето на фрагментите с различни размери [29]. С течение на времето са разработени различни видове PFGE оборудване (Таблица 2), главно за подобряване на разделителната способност на геловете и за намаляване на разходите за реагенти и електричество. Най -използваният апарат е хомогенните електрически полета с контур (CHEF, BioRad), тъй като той може да отделя молекули от 7000 kb, тази характеристика се осигурява от 24 -те си електрода, които са разпределени шестоъгълно и генерират хомогенни електрически полета, позволяващи пробите да се пускат равномерно [29,30]. Някои предимства на PFGE са: той притежава висока дискриминационна сила, отлична възпроизводимост, лекота на измерване на генома и позволява работа с голям брой проби. Недостатъците включват, че повечето от протоколите изискват повече от 4 дни, за да получат и анализират типовете импулси, в сравнение с други методи, които могат да бъдат по-евтини, но неподходящи за изследване на клонално свързани щамове (Таблици 2 и 3) [27,29]. Прилагането на PFGE за изследване на микобактериална инфекция е ограничено от необходимостта да се разчита на високи концентрации на микобактериална ДНК, които са трудни за получаване, тъй като ефективното счупване на клетъчната стена и дезагрегацията на липидите, покриващи микобактерията, са допълнително сложни процедури, растеж на микобактерии има тенденция да се агрегира в клъстери, което също възпрепятства анализа [31].

Метод Лекота на техниката Интерпретация на резултатите Продължителност на теста (дни) Възпроизводимост между лабораториите Възпроизводимост в рамките на анализа Цена на тест
PFGE Умерен Лесно 3 добре добре Умерен
PCR-RFLP Лесно Лесно 1 добре добре Ниска
повторна PCR Лесно Лесно 1 добре Умерен Ниска
AP-PCR Лесно Лесно 1 Умерен Ниска Ниска
AFLP Умерен Умерен 2 добре добре Умерен
MLST Трудно Умерен 2 добре добре Високо

Таблица 2: Най-важните характеристики на някои методи за типизиране, базирани на PCR-амплификация на нуклеинови киселини в сравнение с гел електрофореза с импулсно поле (PFGE).

Метод на писане Описание Не. Маркери Времева скала Източник на вариация Сила на дискриминация Възпроизводимост Приложение База данни
MLST PCR амплификация на домакинство гени за създаване на алелни профили 7 GE ДНК последователност Умерено до високо Високо Acinetobacter baumannii pubmlst.org
LE Clostidium difficile www.mlst.net
Коагулаза отрицателни стафилококи
Ентерококи
Pseudomonas aeruginosa
Стафилококус ауреус
повторна PCR PCR амплификация на повтарящи се последователности в генома Не LE Модели на ленти Умерено до високо Среден Стафилококус ауреус Не
Mycobacterium tuberculosis
Acinetobacter baumannii
PFGE Сравнение на фрагменти от макрорестрикция Не LE Облицовъчни модели Умерено до високо Високо Acinetobacter baumannii Не
Стафилококус ауреус
Коагулазоотрицателни стафилококи
AFLP Ензимно рестрикционно смилане на геномна ДНК, свързване на рестрикционни фрагменти и селективно амплифициране Не LE Модели на ленти Умерено до високо Ниска Acinetobacter baumannii Не
Klebsiella pneumoniae
Стафилококус ауреус
Mycobacterium tuberculosis
MLVA PCR амплификация на локуси VTR, визуализиращ полиморфизма за създаване на алелен профил Октомври-80 GE ДНК последователност Умерено до високо Високо Clostidium difficile minisatellites.upsud.fr
Ентерококи www.mlva.net
Mycobacterium tuberculosis www.pasteur.fr/mlst
Стафилококус ауреус
RFLP Геномно разграждане на ДНК или на ампликон с рестрикционни ензими, произвеждащи къси рестрикционни фрагменти Не LE Облицовъчен модел Ниска Високо Стафилококус ауреус https: //app.chuv .ch/prasite/index.htm
Pseudomonas aeruginosa
Mycobacterium tuberculosis

Таблица 3: Сравнителен анализ на някои техники на молекулярната биология и бактерии от болнично значение, където се прилагат.

Полимеразна верижна реакция-RFLP

Състои се от PCR за амплификация на ген или части от него, комбиниран с последващо смилане на PCR продуктите, използвайки един или няколко рестрикционни ензима. Електрофоретичният анализ на рестрикционните продукти разкрива полиморфизма на гена или на генните фрагменти (RFLP) и доказва генетичните промени сред изолатите. Тази технология е в състояние бързо да разкрие полиморфизми на последователностите, технологично проста и силно възпроизводима. Освен това, той се сравнява добре с други техники като: електрофореза с денатуриращ градиентен гел (DGGE), електрофореза с температурно градиентен гел (TGGE) или полиморфизъм с единична нишка (SSCP) и полиморфизъм с дължина на отрязаните фрагменти (CFLP), които също разкриват полиморфизми на последователности сред щамове, без да се налага да се определя цялата последователност [32]. За микобактерии, PCR-RLFP е широко използван, особено за изследване на инсерционния елемент IS6110, където ензимът Pvull се използва за генериране на рестрикционни фрагменти от геномна ДНК [33]. Други последователности или гени, използвани за идентифициране и генотип Mycobacterium tuberculosis, както и други нетуберкулозни микобактерии са 16S rDNA и гени rpoB, recA, и hsp65, които са дали променливи резултати [34]. От тези последователности най-последователен е генът, който кодира 65-kDa протеина на топлинен шок (hsp65), анализиран чрез PCR-базиран анализ и неговото задно ограничение с ензими BstEII и HaeIII, анализ, известен като PRA (полимеразна верижна реакция Рестрикционен ензимен анализ&mdash PRA) [35]. От нетърговските молекулярни методи методът PRA е един от най-използваните за идентифициране на нетуберкулозни микобактерии с бърз растеж, поради неговата бързина, ниска цена и най-вече, защото базата данни: https: // app. чув. ch/prasite/index.htm, е наличен и съдържа рестрикционните профили на най-малко 113 вида [36].

Реп-полимеразна верижна реакция

Версалович и др. [37] описва метод за изследване на бактериалния геном чрез изследване на специфичните модели на даден щам, получен чрез PCR амплификация на повтарящи се ДНК елементи, присъстващи в бактериалните геноми. Те използваха два основни набора от повтарящи се елементи за типизиране, REP с 38-bp последователности, които се състоят от шест дегенерирани позиции и променлив контур от 5 bp между всяка страна на запазена палиндромна част. REP последователностите са описани както за чревни бактерии, така и за грам-положителни [28,38], а в последно време и за микобактерии, включително нетуберкулозни микобактерии, при последните с добри резултати [39]. ERIC последователностите са втори набор от ДНК последователности, които са били използвани успешно за типизирането на щамове, те са 126-pb елементи, които съдържат силно запазено централно обърнато повторение и са разположени в екстрагенни области на бактериалния геном. ERIC анализът също се използва за генотипиране на микобактерии [40]. REP или ERIC амплификацията може да се извърши само с един праймер или с един или няколко комплекта праймери. ERIC моделите обикновено са по-малко сложни от моделите REP, но и двете осигуряват добра дискриминация на нивото на щамовете. Комбинираното използване на двата метода (REP-PCR и ERIC-PCR) в щамовете, които ще бъдат типизирани, увеличава тяхната дискриминационна способност [28]. Въпреки че последователностите REP и ERIC са най-често използваните мишени за типизиране на ДНК, се използват и BOX последователности, като последните са използвани за диференциране на щамове на пневмокок. BOX елементите са разположени в междугенни региони и те също могат да образуват структури на стволови бримки поради тяхната равномерна симетрия. Те са мозайка от повтарящи се елементи, съставени от няколко комбинации от три последователности, известни като boxA, boxB и boxC. Последователностите с три субединици имат молекулни дължини съответно 59, 45 и 50 нуклеотида. BOX елементите нямат връзка с последователности с REP и ERIC последователности [28].

Усилен полиморфизъм на дължината на фрагмента

Полиморфизмът на дължината на амплифицирания фрагмент (AFLP) е геномна техника за пръстови отпечатъци, базирана на селективното амплифициране на подгрупа от ДНК фрагменти, генерирани чрез смилане на рестрикционни ензими. Първоначално, приложен за характеризиране на растителните геноми, понастоящем AFPL се използва за бактериално типизиране. Описани са два варианта на AFLP: първият, с два различни рестрикционни ензима и два праймера за амплификация, и вторият, само с един праймер и един рестрикционен ензим. Бактериалната ДНК се екстрахира, пречиства и след това се подлага на смилане с два различни ензима, като EcoRI и MseI. След това рестрикционните фрагменти са свързани към адаптери, които съдържат всяко рестрикционно място и последователност, която е хомоложна на свързващото място на PCR праймера. PCR праймерите, използвани за амплификацията, съдържат ДНК последователности, които са хомоложни на адаптера и съдържат една или две селективни бази в своите 3&rsquo края [30,41]. Методът AFLP е адаптиран за изследване на М. туберкулоза, въпреки това, той почти не се използва поради слабата му разделителна способност на генотипиране при M. tuberculosis [42].

Многолокусно въвеждане на последователност

Multilocus Sequence Typing (MLST) е генетичен метод с висока разделителна способност, който се основава на секвениране на фрагменти от 7 гена от 450 до 500 bp (с висока степен на вариабилност). Анализът открива вариации в различните локуси и позволява идентифицирането на идентични микроорганизми (клонинги) или на силно свързани (клонални линии или генотипове). Следователно те са маркери, които са останали стабилни по време на еволюцията и се използват за сравняване на щамове в големи времеви мащаби или от различни географски региони [43]. Секвенирането позволява откриване на варианти само на една промяна в базата данни на анализирания ген. Следователно е изчислено, че ако се открият 30 различни алела на локус и се изследват седем гена, тогава могат да се разграничат до 307 различни генотипа [44]. Всеки алел е номериран, като се има предвид предишното му представяне в базата данни и всеки тип последователност (ST) се дефинира с баркод от седем цифри, които са уникални за седемте локуса [45].

Сполиготипиране и MIRU-VNTR

Три метода са най-често използваните за генотипиране на микобактерии: сполиготипиране, MIRU-VNTR анализ и анализ на рестрикционни фрагменти, получени с ензима Pvull за откриване на инсерционния елемент IS6110 чрез хибридизация. Сполиготипирането е вторият широко използван метод за бързо генотипиране на микобактерии, първоначално описан за типизирането на M. bovis изолати [46]. Тази технология комбинира PCR амплификация на региона за директно повторение (DR) на всеки изолат и хибридизацията на разделителните региони, като последните са уникални последователности, които разделят DRs, има 47 DRs за М. туберкулоза и 41 DRs за M. bovis тези спейсери изобразяват голям полиморфизъм, което позволява използването им като индикатори за вариабилност. Методът е наречен &ldquospoligotyping&rdquo, получен от &ldquospacer олиготипиране&rdquo [47]. Моделът на хибридизация, показан от всеки изолат, се интерпретира върху матрица, която може да се работи с двоичната система или чрез & ldquooctal код & rdquo, за да се улесни боравенето с моделите [48]. Анализ на геномни локуси на М. туберкулоза съдържащ тандемни повторяеми последователности с променлив брой (VNTR) е бърз метод за генотипиране, подобен на сполиготипирането, и се основава на анализа на многократни последователности, открити в микобактериалния геном (MIRUMycobacterial Interspersed Repetitive Units), които са различни в регионите на DR. Минималният набор от MIRUS-VNTR за постигане на диференциация е от 12 локуса, което дава код, който установява уместността на различните генотипове чрез информатичен анализ [49]. Броят на локусите на MIRUS е увеличен до 24, което дава по-висока разделителна способност на този протокол и разширява неговото приложение към изследвания от еволюционен тип [50].

Изводи

Изолирането, идентификацията и анализът на изолати от една проба са някои от основните функции и цели на микробиологичната лаборатория. Важно е обаче да се припомни, че най-добрият бактериологичен резултат се получава, когато пробата, получена от лабораторията, е набавена при най-добри условия. В допълнение, основна задача на лабораторията е да разграничи патогенния микроорганизъм сам по себе си или потенциалната патогенност на колонизацията и замърсителя и да опише, ако е приложимо, възможните механизми на резистентност, за да може да предложи най-ефективното лечение.

Понастоящем диагностичната лаборатория по медицинска бактериология разчита на различни методологии, които представляват основен крайъгълен камък в диагностичния процес на инфекции с бактериален произход. В рамките на ежедневието си клиничната лаборатория прилага фенотипни техники, за да постигне целите си. Тези техники обаче имат някои ограничения по отношение на чувствителност, специфичност и време. Тези ограничения са по-очевидни за някои видове бактерии с труден или бавен растеж, на така наречените невъзможни за култивиране бактерии или за обработка на проби от много лекувани пациенти. През последното десетилетие бяха разработени различни техники в областта на молекулярната биология и аналитичната химия с голям потенциал за намаляване на някои от тези ограничения и които позволиха търсенето и идентифицирането на причинителя, както и оценката на клоналност, за епидемиологични изследвания и цели. Тъй като тези техники са все още трудоемки и с по -висока цена от някои фенотипни, те обикновено не се предлагат в лаборатории на държавни болници. Въпреки че тяхното прилагане не е универсално, те се предлагат в изследователски и референтни лаборатории.

За да бъде клинично полезно, идентифицирането на микроорганизъм трябва да бъде възможно най -бързо. Икономическите аспекти и практиката предлагат използването на минимален брой диагностични тестове. По необходимост идентификацията в клиничната лаборатория винаги ще представлява компромис от точността и прецизността, от една страна, и скоростта и икономичността от друга страна, следователно съвместните усилия между публичните клинични лаборатории и изследователските и референтните лаборатории несъмнено са правилният курс действие за по-добри диагнози.

Признания

Тази работа беше част от изследователските проекти "Идентифициране на етиологични агенти на интраболнична инфекция на Centro Médico Nacional (CMN) 20 de Noviembre", финансирани от Секретариата за наука, технологии и иновации преди ICYT-DF съгласно споразумението ICyTDF/325/2011 и " и приложни изследвания по бактериология" SIP 20150966 на Националния политехнически институт. MGAA, JLH, GCE, VB, GR, XG получава стипендии за SNI, EDI и COFAA. NMAA беше BEIFI стипендия.


Алтернативи на PCR - Биология

Поискахте машинен превод на избрано съдържание от нашите бази данни. Тази функционалност е предоставена единствено за ваше удобство и по никакъв начин не е предназначена да замени човешкия превод. Нито BioOne, нито собствениците и издателите на съдържанието правят и те изрично отхвърлят всякакви изрични или подразбиращи се заявления или гаранции от всякакъв вид, включително, без ограничение, заявления и гаранции относно функционалността на функцията за превод или точността или пълнотата на преводите.

Преводите не се запазват в нашата система. Използването на тази функция и преводите е предмет на всички ограничения за използване, съдържащи се в Общите условия на уебсайта BioOne.

Алтернативен метод на изоензимния профил за идентифициране на клетъчна линия и междувидови кръстосани замърсявания: цитохром б PCR-RLFP анализ

Кларета Г. Лоси, 1 Стефания Ферари, 1 Енрико Соси, 1 Рикардо Вила, 1 Маура Ферари 1

1 Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia Romagna, Бреша, Италия e-mail: [email protected]

Включва PDF и HTML, когато са налични

Тази статия е достъпна само за абонати.
Не се предлага за индивидуална продажба.

Един от основните рискове в лабораториите за клетъчна култура е неправилното идентифициране и кръстосаното замърсяване на клетъчните линии. Използвани са няколко метода за удостоверяване на клетъчни линии, включително профилиране на изоензими, тестът, предложен от Европейската Фармакопея, който се провежда в Центъра за култура на тъкани в Бреша. Този метод обаче показва няколко недостатъка, като висока променливост и ниска възпроизводимост, и отнема много време и изисква да се извършат високи концентрации на клетки. Поради това е разработен алтернативен метод за потвърждаване на вида на произход на 27 различни култури от животински клетки. Анализът на полимеразна верижна реакция (PCR) - полиморфизъм на ограничителния фрагмент (RFLP) е оптимизиран въз основа на използването на двойка праймери, които отгряват част от цитохрома б ген във всички видове. Амплификационният продукт се смила с панел от шест рестрикционни ензима и получената картина се разделя на 3% агарозен гел с висока разделителна способност. За 23 вида този протокол създаде уникален рестрикционен модел и произходът на тези животински клетки беше потвърден от този анализ. Освен това резултатите показват, че цитохромът б PCR-RFLP успя да амплифицира целеви последователности, използвайки много ниски количества дезоксирибонуклеинова киселина (ДНК). Неговата чувствителност при откриване на междувидове, кръстосано замърсяване е сравнима с тази на изоензимния анализ (замърсяващата ДНК трябва да представлява най-малко 10% от общата ДНК). За 4 от 27-те вида (овца, куче, морско свинче и маймуна резус) наблюдаваният модел, дори ако е силно възпроизводим, показва допълнителни ленти за тези видове, също беше извършена специфична PCR.

Кларета Г. Лоси, Стефания Ферари, Енрико Соси, Рикардо Вила и Маура Ферари "Алтернативен метод за изоензимен профил за идентификация на клетъчна линия и междувидови кръстосани замърсявания: цитохром б PCR-RLFP анализ," In Vitro клетъчна и биология на развитието - Animal 44(8), 321-329, (2 юли 2008 г.). https://doi.org/10.1007/s11626-008-9125-x

Получено: 10 март 2008 г. Прието: 16 май 2008 г. Публикувано: 2 юли 2008 г.

Тази статия е достъпна само за абонати.
Не се предлага за индивидуална продажба.


Гледай видеото: ПЦР в реальном времени real-time PCR от Coyote. Мобильная лаборатория полного цикла (Февруари 2023).