Информация

Как Т-клетките определят кои клетки вече са проверили?

Как Т-клетките определят кои клетки вече са проверили?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Доколкото разбирам, Т-клетките непрекъснато пътуват в тялото, инспектират клетките, търсейки антигени. Ако са собствени антигени, тогава Т-клетките не атакуват, докато ако не са, те атакуват. Въпросът ми е как Т-клетката знае, когато току-що е проверила клетка? Т-клетката оставя ли нещо след себе си върху клетката, за да я маркира като проверена или самата клетка представя нещо на повърхността си, за да покаже, че току-що е проверена? Ако няма такава система, тогава какво пречи на Т-клетките да се залепят в цикъл и просто да проверяват една и съща клетка отново и отново?


Вашият въпрос обхваща две дейности на Т-клетките, които са свързани една с друга: миграция и активиране. Т-клетките, които обикновено остават в лимфоидни органи, мигрират към не-лимфоидни органи с различни механизми за всеки Т-клетъчен подтип. Когато мигрират към нелимфоидния орган, Т-клетките се движат през органа, търсейки инфектирани клетки.

Миграция

Както можете да видите на изображението по-долу, има много механизми за преместване на Т-клетки през ендотелния слой.

Основната идея и за трите механизма е, че свързването на Т-клетката към ендотелния слой е слабо. Поради слабото взаимодействие, кръвният поток кара Т-клетката да се движи през ендотелния слой, докато все още е прикрепена към ендотелния слой. Това е известно като търкаляне. Други стимули (обикновено хемокини) като CCL21, CCL25 или ICAM 1 са необходими, за да се индуцира Т-клетката да мигрира през ендотелния слой. Това е важно, защото тези хемокини се експресират там, където има възпаление. Например, има връзка между нивото на CCL25 в червата и възпалението в областта.

Т-клетките експресират α4β7 интегрин или CCR7, които свързват Т-клетката с ендотелния слой. Т-клетките на централната памет и наивните Т-клетки експресират CCR7 и CD62L и по този начин се намират за предпочитане във вторичните лимфоидни органи. Т-клетките на ефекторната памет се свързват с чревния ендотел с α4β7 интегрин, CCR9 и LFA-1.

CCL21 се експресира както от стромални клетки на паракортекса на лимфните възли, така и от ендотелиума на лимфните съдове, за да подпомогне миграцията на активирани дендритни клетки и наивни и централни Т-клетки на паметта към лимфния възел съответно. Дендритните клетки са професионални антиген-представящи клетки (APCs), които мигрират към лимфните възли, където могат да взаимодействат с Т-клетките по-ефективно.

Активиране на Т-клетките

Една важна концепция, която трябва да се отнеме от активирането на Т-клетките, е, че трябва да има директен контакт между МНС комплекса и Т-клетъчния рецептор (TCR).

Т-клетките, които са се преместили в лимфния възел, взаимодействат с дендритни клетки, които имат висока концентрация на МНС комплекс на тяхната клетъчна повърхност. Това води до последващо активиране на Т-клетката, което води до освобождаване на цитокини като IL-2, което води до пролиферация на активирани Т-клетки.

Активираните Т-клетки вече могат свободно да се движат през ендотелния слой на нелимфоидни органи, за да инфилтрират и да търсят заразени места. (Наивните Т-клетки също влизат в ендотелния слой на нелимфоидни органи, но това е независимо от хемокините и по този начин не е реакция на възпаление).

Източници:

Разлика между наивни Т-клетки и Т-клетки от паметта: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1782715/

Ролята на дендритни клетки в имунния отговор: http://lab.rockefeller.edu/steinman/dendritic_intro/immuneResponse

Памет срещу наивна миграция на Т-клетки: http://www.nature.com/icb/journal/v86/n3/full/7100132a.html

Дендритни клетки и роля на CCL21: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3078419/

Наивна Т-клетъчна нелимфоидна инфилтрация на органи: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/eji.200535539/full

CCL25 и връзка с възпалението: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896841116300014


Т-клетката не инспектира нито една клетка, докато клетката не покаже парче от "не-самостоятелния" антиген върху нея от МНС.

Помощната Т-клетка се свързва с антигена, който е на повърхността на клетката. Т-клетката сортира цитокините, които активират цитотоксичните Т-клетки, за да се разделят и образуват колония от цитотоксични клетки. Колонията от цитотоксични клетки след това атакува "не-самостоятелната" антиген-експресираща клетка.


Едноклетъчният анализ на CD4+ Т-клетъчната диференциация разкрива три основни клетъчни състояния и прогресивно ускоряване на пролиферацията

Диференциацията на лимфоцитите често е придружена от промени в клетъчния цикъл, взаимодействие, което е от централно значение за имунитета, но все още е неразбираемо. Тук ние разпитваме и количествено моделираме как пролиферацията е свързана с диференциацията в CD4+ Т клетките.

Резултати

Извършваме ex vivo едноклетъчно РНК-секвениране на CD4+ Т клетки по време на миши модел на инфекция, който предизвиква имунен отговор тип 2 и заключаваме, че диференцираните, продуциращи цитокин клетки циклират по-бързо от ранните активирани клетки прекурсори. За да разсеем количествено този феномен, ние определяме експресионните профили в последователни поколения диференцирани и недиференцирани клетки по време на Th2 поляризацията in vitro. Ние предвиждаме три отделни клетъчни състояния, които проверяваме чрез едноклетъчна количествена PCR. Въз основа на тези три състояния, ние извличаме процента на смърт, разделяне и диференциация с Марков модел на разклонено състояние, за да опишем динамиката на клетъчната популация. От това многомащабно моделиране извеждаме значително ускорение в пролиферацията от междинното активирано клетъчно състояние към зряло цитокин-секретиращо ефекторно състояние. Ние потвърждаваме това ускорение както чрез изобразяване на живо на единични Th2 клетки, така и в ex vivo Th1 модел на малария чрез едноклетъчно РНК-секвениране.

Заключение

Връзката между секрецията на цитокини и скоростта на пролиферация се запазва както в Th1, така и в Th2 клетки in vivo и in vitro, което показва, че това вероятно е общо явление в адаптивния имунитет.


ПРЕГЛЕДНА статия

  • 1 Училище по патология на сър Уилям Дън, Оксфордски университет, Оксфорд, Великобритания
  • 2 Катедра по медицина Радклиф, Отдел за човешка имунология на Съвета за медицински изследвания, Институт по молекулярна медицина Weatherall, Университет на Оксфорд, Оксфорд, Обединеното кралство

Имунната система служи като решаваща линия на защита от инфекции и рак, като същевременно допринася за тъканната хомеостаза. Комуникацията между имунните клетки се медиира от малки разтворими фактори, наречени цитокини, а също и от директни клетъчни взаимодействия. Взаимодействията между клетките са особено важни за активирането на Т клетките. Т -клетките насочват адаптивния имунен отговор и следователно трябва да правят разлика между собствени и чужди антигени. Въпреки че са минали десетилетия от откриването на Т -клетките, защо и как те са в състояние да разпознават и различават антигените все още не е напълно изяснено. Ранното изобразяване на Т клетки беше много успешно при улавяне на ранните етапи на конюгирано образуване на Т клетки с антиген-представящи клетки при разпознаване на натоварени с пептиди основни комплекси за хистосъвместимост от Т-клетъчния рецептор (TCR). Тези проучвания водят до откриването на “ супрамолекулен активиращ клъстер ”, сега известен като имунологичен синапс, последван от идентифициране на микроклъстери от TCRs, образувани при задействане на рецептора, които в крайна сметка се сливат в центъра на синапса. Новите разработки в светлинната микроскопия оттогава позволяват на вниманието да се обърне към най -ранните етапи на активиране на Т клетките и към клетки в покой с висока разделителна способност. Това включва микроскопия за локализация на една молекула, която е приложена към въпроса дали TCRs са предварително групирани върху покойни Т-клетки и микроскопия с решетъчен светъл лист, която е позволила изобразяване на цели клетки, взаимодействащи с антиген-представящи клетки. Използването на микроскопия на решетъчния светлинен лист даде важна представа за структурите, наречени микровили, които са малки мембранни издатини върху Т клетките, които изглежда вероятно имат голямо влияние върху разпознаването и активирането на Т клетките. Тук разглеждаме как изобразяването е оформило нашето мислене за активиране на Т -клетките. Обобщаваме последните открития, получени чрез прилагане на по -модерни техники на микроскопия и обсъждаме някои от ограниченията на тези методи.


1. Въведение

Адаптивният имунен отговор зависи от Т -клетъчните взаимодействия с дендритни клетки (DCs) в паракортекса или Т -клетъчната зона на лимфните възли (LNs). Скоростта, с която naïve Т клетки пробват DCs, определя колко бързо имунната система може да изгради отговор на инфекция (1). Развитието на образни методи, като двуфотонна микроскопия (2PM) и хистоцитометрия, позволиха директно наблюдение на клетъчните места в тъканите. Много проучвания, показващи относителното местоположение на Т клетките и DC, предполагат, че и двете са позиционирани в LN, за да се увеличи максимално вероятността от взаимодействия Т: DC (2, 3). Въпреки напредъка в способността да се изобразяват и наблюдават Т клетки в LNs, малко проучвания правят директни количествени сравнения на това колко тясно T клетките се свързват с множество други типове клетки в LNs.

Т-клетките влизат в паракортекса на LN от малки посткапилярни кръвоносни съдове, наречени високи ендотелни венули (HEVs). Т-клетките, DCs и фибробластните ретикуларни клетки (FRCs) заемат този регион заедно с кръвоносните съдове (BVs). Т клетките се движат между DCs, FRCs и други Т клетки, за да взаимодействат с DCs, представящи антиген. FRCs са стромални клетки, които капсулират мрежа от колагенови влакна, която позволява транспортиране на лимфна течност, носеща разтворим антиген и хемокини (4 𠄷). FRCs произвеждат хемокина CCL21, който има установена роля в насочването на naïve Т клетки в паракортекса от кръвоносните съдове (8, 9). FRC също осигуряват структурна поддръжка, необходима за ефективно активиране на Т клетки (10). Bajenoff et al. показват, че FRC мрежата е тясно свързана с naïve Т клетки, движещи се в паракортекса, което предполага, че FRCs могат да осигурят мрежа, по която Т клетките мигрират (11).

Има няколко хипотези относно ролята на отделните типове клетки в медиирането на T:DC взаимодействия. HEVs са входните точки за Т клетките, влизащи в LN. Girard et al. предполага, че DCs се събират близо до HEVs, за да увеличат максимално скоростта си на контакт с входящите Т клетки (12). Други предполагат, че DCs могат да се събират в пресечните точки на FRC мрежата, което позволява на Т клетките, които пътуват по ръбовете на мрежата, да срещат DCs с повишена скорост (13�). Пространствените взаимодействия между Т-клетките и кръвоносните съдове, FRCs и DCs са важни, ако променят начина, по който Т-клетките се движат през паракортекса и времето на срещите с антиген-представящи DCs, ключовата стъпка в активирането на Т-клетките и инициирането на адаптивната имунна система. отговор.

В допълнение към структурните и клетъчните сигнали, химическите медиатори, включително хемокините, допринасят за движението на Т клетките и T: DC контактите в LN. Например, доказано е, че сигналната молекула LPA, произведена от FRC, медиира бързото движение на Т клетките в LN (17). В допълнение, C𠄼 хемокинов рецептор тип 7 ​​(CCR7), рецепторът, разпознаващ CCL21, е важен за високоскоростната подвижност на Т-клетките в LN (18, 19). Докато CCR7 увеличава скоростта на движение на Т клетките в LN, дали CCR7 влияе на T: DC контактите не е изследвано.

Разбирането на приноса на клетъчни и структурни LN компоненти за локализация на Т клетки изисква количествена метрика, която позволява директни сравнения на пространствени асоциации на множество типове клетки. Няколко други групи съобщават за пространствени връзки между клетките и структурите, използвайки методи като визуална проверка (12, 20) и сравнение на ъглите на завъртане на движенията на Т клетките със структурите (11, 21). Въпреки това, нито едно от тях не сравнява директно асоциациите между множество типове клетки или структури с последователен количествен показател.

В това изследване използваме както коефициента на корелация на Пирсън [PCC (22, 23)], така и взаимната информация [MI (24)], за да сравним пространствената асоциация на множество типове клетки и структури. PCC измерва ковариацията на хомоложните пикселни интензитети и често се използва за определяне на колокализацията, особено на флуоресцентни протеини, в множество биологични системи, включително изследване на Т клетки (25, 26). PCC и MI могат да бъдат изчислени без да е необходимо да се идентифицират отделни граници на клетките, което може да бъде трудно за 2PM изображения.

MI е приложение на ентропията на Шанън (която измерва размера на несигурността относно стойността на случайна променлива в битове), първоначално дефинирана за разбиране на ограниченията при обработката на сигнала и комуникацията (27). MI определя количествено намаляването на несигурността за една променлива, когато човек знае стойността на друга променлива. При анализиране на пространствените асоциации ние измерваме намаляването на несигурността относно местоположението на един тип клетка, като се има предвид местоположението на друг тип клетка. MI се използва успешно в други приложения за обработка на биомедицински изображения, особено при измерване на сходството на изображения в рентгенови лъчи и MRI за автоматизирана регистрация на изображения (28�). Освен това, MI и други информационно-теоретични мерки все повече се признават като мощни инструменти за анализ на нелинейни сложни системи, включително сложни биологични системи като имунната система (32, 33). В тази статия използваме MI, за да определим количествено пространствената асоциация на Т клетките с други типове клетки (например DC или FRC). Ние използваме MI като мярка за пространствена асоциация, която е независима от специфични видове клетки или структури. В допълнение, МИ е теоретично нечувствителен към едрозърнест (34). По този начин, MI може да измери размера на пространствената зависимост на един флуоресцентен маркер от друг, като същевременно минимизира отклонението на наблюдението. MI, за разлика от мерките за разстояние, като например анализа на най-близкия съсед, е пестелив, тъй като не изисква обширна обработка на изображения за премахване на фотонния шум и определяне на клетъчните граници. Вместо това, MI може да работи директно върху изображението без въвеждане на прагове. В предварителната работа използвахме MI за количествено определяне на асоциацията на Т клетките и DC и открихме по-малко съответствие между Т клетките и DC от очакваното (35).

Въпреки това, MI не е сравнима между изображения с различни размери и количества флуоресценция. В това проучване ние използваме NMI, за да нормализираме MI, за да бъде между 0 и 1 (36�), което позволява количествени сравнения на пространствени асоциации между клетки, флуоресциращи в един цветен канал и друг клетъчен тип, флуоресциращ в различен цветен канал в експериментите. Тъй като PCC и NMI са базирани на пиксели методи, които не съответстват на размерите на клетките, ние създаваме региони в изображенията, които съответстват на клетъчните мащаби и прилагаме PCC и NMI. Анализирането на региони, както и пиксели позволява на тези методи да улавят асоциации в биологично релевантни мащаби. И регионалните PCC и NMI анализи показват, че Т -клетките се свързват много по -малко с техните крайни цели, DC, отколкото с FRC. Нашите резултати също показват, че CCR7 не увеличава асоциацията на Т клетки с DC.


Установен биомаркер за синдром на хроничната умора

Учени от Станфорд разработиха кръвен тест, който точно идентифицира хора със синдром на хронична умора, съобщава ново проучване.

Рон Дейвис е старши автор на доклад, който описва кръвен тест, който може да бъде в състояние да идентифицира синдрома на хроничната умора.
Стив Фиш

Хората, страдащи от изтощително и често намалено заболяване, известно като синдром на хроничната умора, скоро може да имат нещо, което търсят от десетилетия: научно доказателство за тяхното заболяване.

Изследователи от Медицинския факултет на Станфордския университет са създали кръвен тест, който може да отбележи болестта, за която в момента липсва стандартен, надежден диагностичен тест.

„Твърде често това заболяване се категоризира като въображаемо“, казва д -р Рон Дейвис, професор по биохимия и генетика. Когато хората със синдром на хроничната умора потърсят помощ от лекар, те могат да преминат серия от тестове, които проверяват функцията на черния дроб, бъбреците и сърцето, както и броя на кръвните и имунните клетки, каза Дейвис. „Всички тези различни тестове обикновено водят лекаря към едно или друго заболяване, но за пациентите със синдром на хронична умора резултатите се връщат към нормалното“, каза той.

Проблемът, каза той, е, че те не търсят достатъчно дълбоко. Сега, д-р Дейвис Рахим Есфандиарпур, бивш научен сътрудник в Станфорд и техни колеги са разработили кръвен тест, който успешно идентифицира участници в проучване със синдром на хроничната умора. Тестът, който все още е в пилотна фаза, се основава на това как имунните клетки на човек реагират на стреса. С кръвни проби от 40 души - 20 със синдром на хронична умора и 20 без - тестът даде точни резултати, точно маркирайки всички пациенти със синдром на хронична умора и никой от здравите индивиди.

Платформата за диагностика може дори да помогне за идентифициране на възможни лекарства за лечение на синдрома на хроничната умора. Чрез излагане на кръвни проби на участниците на кандидати за лекарства и повторно провеждане на диагностичния тест, учените биха могли потенциално да видят дали лекарството подобрява реакцията на имунните клетки. Екипът вече използва платформата за скрининг за потенциални лекарства, които се надяват да помогнат на хората със синдром на хроничната умора.

Документ, описващ резултатите от изследването, е публикуван онлайн на 29 април в Известия на Националната академия на науките. Дейвис е главният автор. Есфандиарпур, който сега е във факултета на Калифорнийския университет-Ървайн, е водещият автор.

Предоставяне на доказателства

Диагнозата на синдрома на хроничната умора, когато всъщност е диагностицирана, се основава на симптоми - изтощение, чувствителност към светлина и необяснима болка, наред с други неща - и тя идва едва след като са отстранени други възможности за заболяване. Той е известен също като миалгичен енцефаломиелит и се обозначава с акронима ME/CFS. Смята се, че 2 милиона души в Съединените щати имат синдром на хронична умора, но това е грубо предположение, каза Дейвис, и вероятно е много по -високо.

За Дейвис стремежът да намери научни доказателства за болестта е личен. Идва от желание да помогне на сина си, който страда от ME/CFS от около десетилетие. Всъщност това беше биологична улика, която Дейвис за първи път забеляза в сина си, която накара него и Есфандиарпур да разработят новия диагностичен инструмент.

Подходът, от който Esfandyarpour ръководи разработката, използва „наноелектронен анализ“, който е тест, който измерва промените в незначителните количества енергия като показател за здравето на имунните клетки и кръвната плазма. Технологията за диагностика съдържа хиляди електроди, които създават електрически ток, както и камери за съхранение на опростени кръвни проби, съставени от имунни клетки и плазма. Вътре в камерите имунните клетки и плазмата пречат на тока, променяйки потока му от единия край в другия. Промяната в електрическата активност е пряко свързана със здравето на пробата.

Идеята е да се подчертаят пробите от здрави и болни пациенти, използващи сол, и след това да се сравни как всяка проба влияе на потока на електрическия ток. Промените в тока показват промени в клетката: колкото по -голяма е промяната в тока, толкова по -голяма е промяната на клетъчно ниво. Голямата промяна не е добро нещо, това е знак, че клетките и плазмата се разклащат при стрес и не са в състояние да ги обработват правилно. Всички кръвни проби от пациенти с ME/CFS създадоха ясен скок в теста, докато тези от здрави контроли върнаха данни, които бяха на относително равен кил.

„Не знаем точно защо клетките и плазмата действат по този начин или дори какво правят“, каза Дейвис. „Но има научни доказателства, че това заболяване не е измислица на ума на пациента. Ясно виждаме разлика в начина, по който здравите и синдрома на хроничната умора имунните клетки обработват стреса. " Сега Есфандиарпур и Дейвис разширяват работата си, за да потвърдят констатациите в по -голяма група участници. Набирането на по -големия проект, който има за цел да потвърди допълнително успеха на диагностичния тест, се извършва непрекъснато. Тези, които се интересуват от участие, трябва да се свържат с координатора по клинични изследвания Анна Окуму.

Удвояване

В допълнение към диагностицирането на ME/CFS, изследователите също така използват платформата за скрининг за лечение, базирано на лекарства, тъй като в момента възможностите са малки. „Използвайки анализа на наноелектрониката, можем да добавим контролирани дози от много различни потенциално терапевтични лекарства към кръвните проби на пациента и да проведем диагностичния тест отново“, каза Есфандиарпур.

Ако кръвните проби, взети от тези с ME/CFS, все още реагират слабо на стреса и генерират скок на електрически ток, тогава лекарството вероятно не е работило. Ако обаче лекарството изглежда смекчава скока в електрическата активност, това може да означава, че помага на имунните клетки и плазмата по-добре да обработват стреса. Досега екипът вече е намерил кандидат-лекарство, което изглежда възстановява здравата функция на имунните клетки и плазмата, когато се тества в анализа. Наркотикът, макар и успешен в анализа, понастоящем не се използва при хора с ME/CFS, но Дейвис и Есфандиарпур се надяват, че в бъдеще могат да проверят откритията си в клинично изпитване.

Всички тествани лекарства или вече са одобрени от Агенцията по храните и лекарствата, или скоро ще бъдат широко достъпни за обществеността, което е ключово за бърз достъп и разпространение, ако някое от тези съединения се появи.

Други автори на изследването в Станфорд са изследователите Мохсен Немат-Горгани и Джули Вилхелми и асистентът Алекс Каши.

Изследването е финансирано от Фондация „Отворена медицина“. Дейвис е директор на научно -консултативния съвет на фондацията.

Катедрите по генетика и биохимия в Станфорд също подкрепиха работата.


Въведение

Стресът се дефинира като процес, при който изискванията на околната среда натоварват адаптивния капацитет на организма, което води както до психологически изисквания, така и до биологични промени, които биха могли да бъдат изложени на риск от заболяване (1). Нещата, които ни причиняват стрес, се наричат ​​стресори. Стресът засяга всички, млади и стари, богати и бедни. Животът е пълен със стрес. Стресът е всеки житейски факт, с който всички трябва да се справим. Той се предлага във всякакви форми и размери, дори мислите ни могат да ни причинят стрес и да направят човешкото тяло по -податливо на болести. Съществуват три теории или перспективи относно стреса на околната среда, психологическия (емоционален) стрес и биологичния стрес (1). Перспективата за екологичния стрес подчертава оценката на екологичните ситуации или опит, които са обективно свързани със съществени изисквания за адаптиране. Перспективата на психологическия стрес набляга на субективните оценки на хората за тяхната способност да се справят с изискванията, представени им от определени ситуации и преживявания. И накрая, перспективата за биологичния стрес подчертава функцията на определени физиологични системи в тялото, които се регулират както от психологически, така и от физически трудни условия.

Връзката между стреса и болестта е сложна. Възприемчивостта към стрес варира от човек на човек. Събитие, което причинява заболяване на човек, не може да причини заболяване на друго лице. Събитията трябва да взаимодействат с голямо разнообразие от основни фактори, за да се проявят като заболяване. Сред факторите, които са повлияли на податливостта към стрес, са генетична уязвимост, стил на справяне, тип личност и социална подкрепа. Когато се сблъскаме с проблем, ние оценяваме сериозността на проблема и определяме дали разполагаме с необходимите ресурси за справяне с проблема. Ако смятаме, че проблемът е сериозен и нямаме необходимите ресурси за справяне с проблема, ще се възприемем като подложени на стрес (2). Нашият начин да реагираме на ситуациите е този, който променя податливостта ни към болести и цялостното ни благополучие.

Не всеки стрес има отрицателен ефект. Когато тялото толерира стреса и го използва за преодоляване на летаргията или подобряване на работоспособността, стресът е положителен, здравословен и предизвикателен. Ханс Селие (3), един от пионерите на съвременното изследване на стреса, нарече това eustress. Стресът е положителен, когато ни принуждава да се адаптираме и по този начин да увеличим силата на нашите механизми за адаптация, предупреждава ни, че не се справяме добре и че промяната в начина на живот е оправдана, ако искаме да поддържаме оптимално здраве. Този стимулиращ действието стрес дава на спортиста конкурентно предимство, а на оратора ентусиазма да проектира оптимално. Стресът е отрицателен, когато надвишава способността ни да се справяме, уморява телесните системи и причинява поведенчески или физически проблеми. Този вреден стрес се нарича дистрес. Дистресът предизвиква свръхреакция, объркване, лоша концентрация и безпокойство при представяне и обикновено води до по-ниско представяне. Фигура 1 илюстрира тази концепция.

Eustress е стимулиращият действието стрес, който дава на спортистите конкурентно предимство

Има нарастваща загриженост относно нарастващите разходи и разпространението на разстройства, свързани със стреса, особено по отношение на работното място. “Работени до смърт, пускане на смърт, работа до падане ” са подчертани “work-related death ” през 21 век. Страни, известни с дългите си работни часове, знаят това достатъчно добре, Япония и Китай имат дума за смърт от преумора – кароши и гуолаоси съответно. И Япония, и Корея признават самоубийството като официално и подлежащо на компенсация състояние, свързано с работата (4). Очакваното разпространение на стрес и свързани със стреса състояния в Обединеното кралство се е увеличило от 829 случая на 100 000 работници през 1990 г. до 1700 на 100 000 през 2001/2002 г. През тази година 13,4 милиона загубени работни дни се дължат на стрес, тревожност или депресия, като приблизително 265 000 са новите случаи на стрес. Последният анализ на HSE (Health and Safety Executive) на степента на самоотчетени заболявания показва, че стресът, депресията или тревожността засягат 1,3% от работната сила (5). Изчислено е, че 80% до 90% от всички производствени злополуки са свързани с лични проблеми и неспособност на служителите да се справят със стреса (6). Европейската агенция за безопасност и здраве при работа съобщава, че около 50% от отсъствията от работа са причинени от стрес (7).

Заболеваемостта и смъртността от заболявания, свързани със стреса, са тревожни. Емоционалният стрес е основен фактор, допринасящ за шестте водещи причини за смърт в Съединените щати: рак, коронарна болест на сърцето, случайни наранявания, дихателни нарушения, цироза на черния дроб и самоубийство. Според статистиката на Meridian Stress Management Consultancy във Великобритания, почти 180 000 души във Великобритания умират всяка година от някаква форма на заболяване, свързано със стреса (7). Центърът за контрол и превенция на заболяванията на САЩ изчислява, че стресът представлява около 75% от всички лекари, които посещават (7). Това включва изключително широк диапазон от физически оплаквания, включително, но не само, главоболие, болки в гърба, сърдечни проблеми, разстроен стомах, язва на стомаха, проблеми със съня, умора и злополуки. Според новините по здравеопазване и безопасност при работа и Националния съвет за обезщетение на осигуровките, до 90% от всички посещения при лекари по първична медицинска помощ са за оплаквания, свързани със стрес.

Стресът и имунната система

Нашата имунна система е друга област, която е податлива на стрес. Голяма част от това, което знаем за връзката между мозъка, нервната система и имунния отговор, е излязла от областта на психоневроимунология (PNI). PNI е разработена през 1964 г. от д-р Робърт Адер, директор на отдела по поведенческа и психосоциална медицина в Университета в Рочестър. Психоневроимунологията е изследване на сложното взаимодействие на съзнанието (психо), мозъка и централната нервна система (невро) и защитата на тялото срещу външна инфекция и анормално клетъчно делене (имунология) (8). По-конкретно, той е посветен на разбирането на взаимодействията между имунната система, централната нервна система и ендокринната система. Въпреки че е сравнително нова медицинска дисциплина, философските корени на връзката между физическото здраве, мозъка и емоциите могат да бъдат проследени до Аристотел.

Имунните отговори се регулират от антиген, антитяло, цитокини и хормони. Лимфоцитите са най -отговорни за организиране на функциите на имунната система. Имунната система има около 1 трилион лимфоцити. Лимфоцитите, които растат и узряват в тимуса, се наричат Т клетки се наричат ​​други лимфоцити В клетки. В-клетките секретират антитела, химикали, които съответстват на специфични нашественици, наречени антигени (хуморален имунитет). Т -клетките не отделят антитела, а действат като пратеници и убийци, локализирайки и унищожавайки нахлуващите антигени (клетъчен имунитет). Някои Т-клетки, наречени помощници, спомагат за активиране на производството на други Т и В клетки. Други Т-клетки, наречени потискащи средства, спират производството на антигени, отменяйки атаката. Броят на Т и В клетките трябва да бъде балансиран, за да работят ефективно. Когато съотношението на Т към В клетките е нарушено, имунният отговор е компрометиран и не работи ефективно. Други ключови химикали, които се произвеждат от имунната система, са макрофаги, моноцити и гранулоцити. Тези химикали обгръщат, унищожават и усвояват нахлуващите микроорганизми и други антигени. Известен като цяло фагоцити, те се обединяват с повече от 20 вида протеини, които съставляват имунната система и комплементарната система на#x02019. Тази система се задейства от антитела, които се заключват в антигените, които причиняват възпалителни реакции.

Цитокини са молекули-посланици, които не са антитела от различни клетки на имунната система. Цитокините стимулират клетъчното освобождаване на специфични съединения, участващи във възпалителния отговор. Те се произвеждат от много клетъчни популации, но преобладаващите продуценти са помощни Т -клетки (Th) и макрофаги. Th1 и Th2 цитокините взаимно инхибират производството и функцията на Th1: Th1 клетките стимулират клетъчния имунитет и потискат хуморалния имунитет, докато Th2 цитокините имат противоположен ефект. Цитокините е общо наименование, друго специфично наименование включва лимфокини (цитокини, произвеждани от лимфоцити), хемокини (цитокини с хемотактична активност), интерлевкини (IL) (цитокини, произведени от един левкоцит и действащи върху други левкоцити) и интерферон (IFN) (освобождаване на цитокини от инвазирана от вирус клетка, която подтиква околната клетка да произвежда ензими, които пречат на репликацията на вируса).

Произвеждат се цитокини de novo в отговор на имунен стимул. Те обикновено действат на къси разстояния и кратки периоди от време и при много ниска концентрация. Те действат чрез свързване със специфични мембранни рецептори, които след това сигнализират на клетката чрез втори месинджър, често тирозин кинази, да променят поведението си (генна експресия). Отговорите на цитокини включват увеличаване или намаляване на експресията на мембранни протеини (включително цитокинови рецептори), пролиферация и секреция на ефекторни молекули. Най-голямата група цитокини стимулира пролиферацията и диференциацията на имунните клетки. Някои често срещани бактериални антигени активират комплемента и стимулират макрофагите да експресират костимулиращи молекули. Антигените стимулират адаптивната имунна реакция чрез активиране на лимфоцити, които от своя страна правят антитялото да активира комплемента и цитокините за увеличаване на елиминирането на антигена и набиране на допълнителни левкоцити.

Няколко проучвания показват, че хроничният стрес оказва общ имуносупресивен ефект, който потиска или задържа способността на организма да инициира бърза, ефективна имунна реакция (9,10). Това се дължи на изобилието от кортикостероиди, произведени по време на хроничен стрес, което води до дисбаланс в нивата на кортикостероидите и отслабва имунокомпетентността. Смята се, че това отслабване на имунната функция е свързано с общо напрежение върху различните части на тялото, свързано с производството и поддържането на имунната система. Например, атрофията на тимуса или свиването на тимуса води до неспособността му да произвежда Т клетки или хормоните, необходими за тяхното стимулиране. Това може да доведе до дисбаланс и неефективност на целия имунен отговор. Това е в съответствие с констатацията, че с напредването на възрастта сме склонни да страдаме от инфекция, рак, свръхчувствителност и автоимунитет.

В мета-анализ на 293 независими проучвания, докладвани в рецензирани научни списания между 1960 и 2001 г. с участието на около 18 941, се потвърждава, че стресът променя имунитета (11). Краткосрочният стрес всъщност засилва имунната система, тъй като тя се подготвя да посрещне и преодолее предизвикателство като адаптивна реакция, подготвяща се за нараняване или инфекция, но дългосрочният или хроничен стрес причинява твърде много износване и системата ще се разпадне особено ако индивидът има малък контрол върху събитията. Анализите (11) разкриват, че най-хроничните стресови фактори, които променят самоличността или социалните роли на хората, са повече извън техния контрол и изглеждат безкрайни–, са свързани с най-глобалното изразяване на имунитета, почти всички показатели за имунната функция са отпаднали. Продължителността на стреса също играе роля. Колкото по-дълъг е стресът, толкова повече имунната система се измества от потенциално адаптивни промени (като тези в реакцията борба или бягство) към потенциално вредни промени, първо в клетъчния имунитет, а след това в по-широката имунна функция. Те също така откриха, че имунната система на хора, които са по-възрастни или вече болни, е по-податлива на промени, свързани със стреса.

Връзката между стрес и болест

Критичният фактор, свързан със стреса, е неговият хроничен ефект във времето. Хроничните стресови фактори включват ежедневни проблеми, разочарование от задръствания, претоварване на работа, финансови затруднения, брачни спорове или семейни проблеми. Разбира се, има много повече неща, които могат да причинят стрес, но това са стресовите фактори, които често се срещат в ежедневието. Скритият гняв, който държим в себе си към някоя от тези ситуации, или вината и негодуванието, които изпитваме към другите и към себе си, всички произвеждат еднакви ефекти върху хипоталамуса. Вместо да разтоварваме този стрес обаче, ние го държим вътре, където ефектите му стават кумулативни.

Изследванията показват, че почти всяка система в тялото може да бъде повлияна от хроничен стрес. Когато хроничният стрес не се освобождава, той потиска имунната система на организма и в крайна сметка се проявява като заболяване. Човек може само да се чуди какво би се случило с тялото, ако остане в реакцията се бори или бягай. За щастие, при нормални обстоятелства, три минути след като заплашителна ситуация приключи и реалната или въображаема опасност е отстранена, реакцията „бий се или бягай“ отшумява и тялото се отпуска и се връща към нормалното си състояние. През това време сърдечната честота, кръвното налягане, дишането, мускулното напрежение, храносмилането, метаболизма и имунната система се нормализират. Ако стресът продължи след първоначалната реакция борба или бягство, реакцията на тялото влиза във втори етап. По време на този етап активността, ако симпатиковата нервна система намалява и секрецията на адреналин е намалена, но секрецията на кортикостероиди продължава при нормални нива. И накрая, ако стресът продължава и тялото не е в състояние да се справи, има вероятност да има разпадане на телесните ресурси.

Медицински заболявания

При астмата участват както външни, така и вътрешни фактори, именно вътрешният фактор е най -силно повлиян от острите ефекти на психологическите стресори. Семейната терапия е широко включена в лечението на астматични деца. Подобрението се дължи на минимизирането на взаимодействието с родителите, което предизвиква чести стресови ситуации. Освен това астматиците, изложени на безвредно вещество, за което смятат, че са алергични, биха предизвикали тежък пристъп (12). Изследване на Gauci et al. (13) демонстрира значителни положителни корелации между няколко от скалните мащаби, свързани с многофазна личностна инвентаризация (MMPI) в Минесота, и реактивността на кожата в отговор на алергени. Като цяло тези данни предоставят доказателства за ясна връзка между стреса, имунната дисфункция и клиничната активност на атопично и астматично заболяване. За допълнителна справка, Liu et al. (14) предостави отлични доказателства, че стресът може да засили алергичния възпалителен отговор.

Известно е, че стомашно -чревни заболявания като пептична язва (PU) и улцерозен колит (UC) са силно повлияни от стреса. PU се среща два пъти по-често при диспечерите на въздушното движение, отколкото при цивилните пилоти, и се среща по-често сред ръководителите на полети в центрове с висок стрес (Chicago O ’Hare, La Guardia, JFK и международно летище Лос Анджелис), отколкото центровете с нисък стрес (летища в по-слабо населени градове във Вирджиния, Охайо, Тексас и Мичиган). Въпреки че стресът е рисков фактор за PU, се смята, че са свързани и повече от 20 други фактора: кръвна група, пол, тип HLA антиген, алкохолна цироза, хипертония, хронична обструктивна белодробна болест, пушене на цигари и дори консумация на кафе, газирана напитка или мляко по време на колежа (12). Някои стресови събития в живота са свързани с появата или обостряне на симптомите при други често срещани хронични разстройства на храносмилателната система, като функционални стомашно-чревни разстройства (FGD), възпалително заболяване на червата (IBD) и гастро-езофагеална рефлуксна болест (GERD). Стресът в ранния живот под формата на злоупотреба също играе важна роля в податливостта към развитие на FGD, както и IBD по -късно в живота (15).

Язвите се причиняват от прекомерна стомашна киселина и проучванията на пациенти със стомашни фистули показват, че гневът и враждебността увеличават стомашната киселинност, докато депресията и оттеглянето я намаляват. Друга теория, свързваща ефектите на стреса върху развитието на язви, свързани с лигавицата, която облицова стомаха. Теорията гласи, че по време на хроничен стрес секрецията на норадреналин причинява свиване на капилярите в стомашната лигавица.Това от своя страна води до спиране на производството на лигавици и лигавичната защитна бариера за стомашната стена се губи. Без защитната бариера солната киселина разгражда тъканта и дори може да достигне до кръвоносните съдове, което води до кървяща язва (16). Наскоро обаче беше открито, че много случаи на язви са причинени от бактерия, наречена Helicobacter pylori (H. pylori) (17). Въпреки че точният механизъм, чрез който причинява язви, не е известен, се смята, че H. pylori възпалява стомашно -чревната лигавица, стимулира производството на киселина или и двете.

Коронарната болест на сърцето (CHD) отдавна се счита за класическо психосоматично заболяване, тъй като нейното начало или протичане е повлияно от различни психосоциални променливи. Психосоциалните аспекти на ИБС са били проучени широко и има сериозни доказателства, че психологическият стрес е значителен рисков фактор за ИБС и смъртност от ИБС (18,19,20,21). Tennant (19) открива положителна връзка между стреса в живота и сърдечния инфаркт и внезапната смърт по време на проучване на Rosengren et al. (20) съобщават, че смъртността от ИБС се е увеличила два пъти при мъжете, преживели три или повече предшестващи житейски събития. Проучването INTERHEART (21) разкрива, че хората с миокарден инфаркт съобщават за по -голямо разпространение на четири стресови фактора: стрес на работното място и у дома, финансов стрес и големи житейски събития през последната година.

Въпреки че доказателствата, подкрепящи връзката между поведение от тип А (агресивно, конкурентно, ориентирано към работата и спешно поведение) и ИБС, са противоречиви (22), някои проучвания установяват, че индивидите от тип А генерират по-стресиращи житейски събития и са по-склонни от други да интерпретират срещаните житейско събитие по емоционално неблагоприятен начин (23, 24). Ако тип А е рисков фактор, той може да не действа чрез продължителна физиологична дисфункция (водеща до атерогенеза), а чрез остри житейски събития, провокиращи тежко натоварване на сърцето. Един от компонентите на поведението от тип А е враждебността, която може да бъде свързана с риска от ИБС. Някои проучвания (25, 26) отбелязват, че клиничните ИБС се предвиждат от враждебност и това изглежда независимо от други рискови фактори. В някои ангиографски проучвания е установено, че враждебността е свързана с атеросклерозата (27,28). Други проучвания установяват, че потискането на гнева е свързано с ИБС (29) и атеросклероза (27,28). При прегледа на тези констатации Tennant (30) заключи, че се появява възможността враждебността (или нейното потискане) да има известна роля при ИБС, въпреки че механизмът е неясен.

Трите основни рискови фактора, които обикновено се приемат, че са свързани с ИБС, са хиперхолестеролемия, хипертония и тютюнопушене. В опит да се определят причините за повишените нива на серумния холестерол, Friedman et al. (31) проведе едно от ранните изследвания на връзката между стреса и серумния холестерол. Те открили, че стресът е една от причините за повишените нива на серумния холестерол. Други изследователи, които са изследвали студентите по медицина, изправени пред стреса от изпита (32), и военния пилот в началото на периода на обучение и изпит (33), потвърдиха констатациите. Тъй като кръвното налягане и серумният холестерол се повишават по време на стрес, връзката между стреса и хипертонията отдавна се подозира, че емоционалният стрес обикновено се счита за основен фактор в етиологията на хипертонията (34). Едно от първите доказателства за тази връзка идва от мащабното проучване на 1600 болнични пациенти от Дънбар (35). Той открива, че определени черти на личността са характерни за пациентите с хипертония, например лесно се разстройват от критика или несъвършенство, притежават задържан гняв и липса на самочувствие. Признавайки тази връзка, образователните програми за пациенти с хипертония включват управление на стреса.

Изглежда, че някои хора са наследствено податливи на ревматоиден артрит (RA). Приблизително половината от страдащите от това състояние имат кръвен протеин, наречен ревматоидни фактори (RF), което е рядкост при хора, които не страдат от артрит. Тъй като RA включва тялото, което се самообръща (автоимунен отговор), се предполага, че саморазрушителната личност може да се прояви чрез това заболяване (16). Въпреки че доказателствата в подкрепа на тази хипотеза не са убедителни, няколко изследователи са открили личностни различия между страдащите от РА и други. Засегнатите с тази болест са установени като перфекционисти и са саможертвени, мазохистични и самосъзнателни. Установено е, че пациентките са нервни, мрачни и депресирани, с анамнеза за отхвърляне от майките и строги бащи. Предполага се, че хората с RF, които изпитват хроничен стрес, стават податливи на РА (16). Неизправностите на имунологичната им система и генетичното предразположение към РА водят до развитие на състоянието.

Мигренозните главоболия са резултат от свиване и разширяване на каротидните артерии от едната страна на главата. Фазата на свиване, наречена продром, често се свързва с чувствителност към светлина или шум, раздразнителност и зачервяване или бледност на кожата. Когато настъпи разширяване на артериите, някои химикали стимулират съседните нервни окончания, причинявайки болка. Диетата може да предизвика мигренозно главоболие при някои хора. Въпреки това, преобладаващата мисъл за причината за мигрената се отнася до емоционалния стрес и напрежение. Чувството за безпокойство, нервност, гняв или потиснат гняв са свързани с мигрена. Атаката може да бъде прекратена, когато индивидът даде воля на основната личност (8). Типичният страдащ от мигрена е перфекционист, амбициозен, твърд, подреден, прекалено конкурентен и неспособен да делегира отговорност.

Съществуват и доказателства, че емоционално стресираното преживяване е свързано с ендокринно разстройство като захарен диабет (36). Физическите или психологическите стресори могат да променят нуждите от инсулин. Стресорите често могат да причинят епизоди на загуба на контрол, особено при деца с диабет. Диабет тип II най-често се повлиява от стрес, тъй като има тенденция да се появява при възрастни с наднормено тегло и е по-лека форма на диабет (12). Освен това децата, които са имали стресови събития в живота, произтичащи от действителни или заплашени загуби в семейството и настъпили на възраст между 5 и 9 години, са имали значително по -висок риск от диабет тип I.

Острият стрес може да потисне вирус-специфичните антитела и Т-клетъчните отговори на ваксината срещу хепатит В (37). Хората, които показват лош отговор на ваксините, имат по -висок процент на заболявания, включително инфекция с грипен вирус. Има няколко други проучвания, които показват връзка между психологически стрес и чувствителност към няколко вируса на настинка (38,39). Това не е изненадващо, тъй като стресът потиска латентните вируси на имунната система, след което по-лесно се възраждат, тъй като тялото не може да се защитава повече. Опитите да се установи връзка между стреса и прогресията на заболяването при пациенти със синдром на придобита имунна недостатъчност (СПИН) са имали противоречиви резултати (40). Анализът на многоцентровото кохортно проучване за СПИН не успя да установи връзка между депресията и намаляването на CD4+ Т лимфоцитите, прогресията на заболяването или смъртта (41), но други са открили значителна връзка между имунологичните параметри, отразяващи прогресията на ХИВ и психосоциалните фактори, особено отричането и дистрес (42) и прикриване на хомосексуална идентичност (43).

Психично заболяване

Голяма част от изследвания през последните четири десетилетия предоставиха доказателства, че скорошните житейски събития допринасят за появата на психиатрични заболявания (44). Връзката между стресови събития в живота и психиатрични заболявания е по -силна от връзката с физическо или медицинско заболяване. Винсент и Росенсток (45) установяват, че преди хоспитализацията пациентите с психиатрични разстройства са претърпели по-стресово събитие, отколкото тези с физически разстройства. Междувременно Андрю и Тенант (46) не успяха да открият връзката между стреса и физическото заболяване. Въпреки че точната връзка между стреса и психиатричното заболяване не е ясна, крайният път е биохимичен. Както при медицинското заболяване, подходящият модел е една от многофакторни причинно-следствени връзки. Повечето изследвания на житейски събития показват ограничение от 6 месеца, за да се обмисли, че стресът има значителен ефект върху заболяването. След това ефектът от стреса намалява с времето.

Последните житейски събития имат важна етиологична роля при неврозите, формират ролята в появата на невротична депресия (смесена депресивна болест) и предизвикваща роля при шизофренични епизоди (47). С други думи, връзката на стреса с психиатричното заболяване е най -силна при неврозите, следвана от депресията и шизофренията е най -малко. Връзката между неврози и шизофрения със стреса е по-ясна. Слабата връзка между стресовите житейски събития и появата на психотично заболяване, особено шизофрения, е демонстрирана в няколко проучвания (48,49,50), за разлика от силната връзка между стреса и неврозите (51,52, 53,54). Въпреки това степента на връзката между депресивното заболяване и неврозите във връзка със стреса е доста противоречива. Нито Paykel (55), нито Brown et al. (56) установиха, че връзката между стреса в живота и болестта е по -голяма за невротичната депресия, отколкото униполярна (ендогенна) депресия.

Bebbington et al. (57) установиха, че има излишък от житейски събития, предшестващи появата на всички видове психози, особено през първите 3 месеца. В изследването на скорошното начало на шизофрения, шизофрениформно разстройство и хипомания, Chung et al. (49) установиха, че застрашаващи житейски събития са значително свързани с появата на шизофрениформена психоза, но не и с шизофрения. Те също така откриха, че заплашителни събития могат да предизвикат хипоманични епизоди. Друго проучване (50) установи, че хората с шизофрения не преживяват по -стресиращи събития в живота от нормалните контроли, но съобщават за по -голям субективен стрес. Проучване, което изследва връзката между скорошни житейски събития и епизоди на заболяване при шизофрения, установи, че първоначалните или ранните епизоди на шизофрения са по -склонни да бъдат свързани с последните събития в живота, отколкото по -късните епизоди (48).

От друга страна, биполярните разстройства са получили по-малко изследвания от еднополярните. При биполярно разстройство ефектът от житейските събития обикновено е по -слаб от униполярния, но големите житейски събития могат да бъдат важни при първото начало (58). Причинителните фактори при биполярни разстройства са многофакторни и сложни, а генетичният фактор изглежда влияе върху експозицията на житейски събития. Тези с по-голямо генетично натоварване, е имало по-малко стресови събития в живота преди първия епизод и са имали по-ранно начало на заболяването. Редица проучвания показват, че появата на депресия често е предшествана от стресови събития в живота (59,60). Стресови събития от живота, както и скорошни незначителни затруднения също са идентифицирани като предиктори на епизод на депресия в монозиготно женско близначно проучване. Кеслер (61), който стигна до същото заключение, добави, че има доказателства, че съпътстващият хроничен стрес засилва ефекта на големите житейски събития върху депресията.

Купър и Силф (51) документират ролята на житейските събития в причините за невротичните заболявания. Те открили, че невротичната група съобщава за 50% по -стресови събития от контролната група. McKeon et al. (52) установяват, че пациентите с обсесивно-компулсивни неврози, които имат необичайни личностни черти (обсесивни, тревожни и самосъзнателни), са имали значително по-малко житейски събития от тези без такива черти. Zheng and Young (53) при сравняване на стреса на живо при невротични пациенти и нормален контрол установи, че невротичните пациенти имат значително по -високо ниво на стрес и са претърпели повече промени в житейските събития от контролната група. Rajendran et al. (54), които сравняват невротичните ръководители със здрави ръководители като контролна група, откриват значителни разлики между нормалните и невротичните групи по отношение на честотата на житейските събития, както и на стреса, който са изпитали поради тези житейски събития.

Стрес и рак

Особено внимание е отделено на връзката между рака на гърдата и стреса. Някои проучвания показват повишена честота на ранна смърт, включително смърт от рак сред хора, които са преживели скорошна загуба на съпруг или любим човек. Няколко проучвания на жени с рак на гърдата показват значително висок процент на заболяване сред тези жени, които са преживели травматични събития в живота и са загубили в рамките на няколко години преди диагнозата им. Въпреки това, повечето ракови заболявания се развиват в продължение на много години и се диагностицират едва след като са нараснали в тялото за дълго време. По този начин този факт оспорва връзката между смъртта на близък човек и отключването на рака. Няма научни доказателства за пряка причинно-следствена връзка между тези промени в имунната система и развитието на рак. Не е доказано, че предизвиканите от стрес промени в имунната система директно причиняват рак. Необходими са обаче повече изследвания, за да се установи дали има връзка между психологическия стрес и трансформацията на нормалните клетки в ракови клетки. Една област, която в момента се проучва, е дали психологическите интервенции могат да намалят стреса при пациенти с рак, да подобрят имунната функция и евентуално дори да удължат преживяемостта.

Проучвания при животни, предимно плъхове, разкриват връзката между стреса и прогресията на раковите тумори. Хроничният и остър стрес, включително операция и социални смущения, изглежда стимулират растежа на тумора. Лесно е да се правят такива изследвания при животни, но при хората е по -трудно. Освен това, взаимодействията на много системи, които влияят на рака, от имунната до ендокринната система, заедно с факторите на околната среда, които не могат да бъдат контролирани, правят сортирането на ролята на стреса изключително трудно. Освен това изследователите не могат да излагат хората на туморни клетки, както правят с животните. Неотдавнашно проучване (62) установи, че има връзка между стреса, развитието на тумора и вид бели кръвни клетки, наречени естествени клетки убийци (NK). От всички клетки на имунната система, NK клетките са показали най -силните връзки с борбата с определени форми на заболяването, като по -специално предотвратяват метастази и унищожават малки метастази. Въпреки че резултатът от това проучване не е окончателен, той показва, че стресът действа чрез потискане на активността на NK-клетките. Друго предварително проучване показа доказателства за отслабена имунна система при пациенти с рак на гърдата, които изпитват високо ниво на стрес в сравнение с тези, които изпитват по-малко стрес.

Ново проучване показва, че стресът и социалната подкрепа са важни влияния върху риска на мъжа от развитие на рак на простатата. Изследователи (63) от Щатския университет на Ню Йорк в медицинското училище на Стоуни Брук установиха, че мъжете с високо ниво на стрес и липса на удовлетворяващи взаимоотношения с приятели и семейство имат по-високи нива на простатно-специфичен антиген (PSA) в кръвта си, а маркер за повишен риск от развитие на рак на простатата. Въз основа на резултатите рискът от анормален PSA е бил три пъти по -висок при мъжете с високи нива на стрес. По същия начин мъжете, които са чувствали, че имат ниски нива на подкрепа от приятели и семейство, са два пъти по -склонни да имат анормален PSA. Констатациите повдигат възможността психологическото състояние на мъжа да има пряко въздействие върху болестта на простатата.


По-добре заедно

През 2001 г., малко след като пристигна в Ню Йорк, Форменти присъства на беседа на Сандра Демария, патолог също във Weill Cornell. Демария изучава фрагменти от тумори на гърдата, отстранени от пациенти, които са били подложени на химиотерапия, и е открил, че при някои пациенти химиотерапията е причинила имунните клетки да заливат туморите. Това накара Форменти да се запита дали може да се случи същото нещо след лъчева терапия.

В допълнение към борбата с болестотворните патогени, част от работата на имунната система е да следи клетките, които могат да станат ракови. Например, цитотоксичните Т-клетки убиват всички клетки, които показват признаци на мутации, свързани с рак. Раковите клетки стават обезпокоителни, когато намерят начини да скрият тези признаци или да освободят протеини, които притъпяват сетивата на Т -клетките. "Ракът наистина е провал на имунната система да отхвърли [образуващите рак] клетки", казва Форменти.

Форменти и Демария, колега от Италия, бързо обединиха усилия, за да определят дали имунната система предизвиква абскопалната реакция. За да тества идеята си, техният екип инжектира клетки от рак на гърдата в мишки на две отделни места, което кара отделните тумори да растат от двете страни на телата на животните. След това облъчиха само един от туморите на всяка мишка. Само радиацията попречи на първичния тумор да расте, но не направи много друго. И все пак, когато изследователите също инжектираха протеин, наречен GM-CSF, в мишките, размерът на втория тумор също беше контролиран.

GM-CSF увеличава броя на дендритни клетки, които действат като командващи офицери на Т клетки, като предоставя инструкции къде да атакуват. Но атаката не може да се случи, ако един от туморите не е облъчен. „По някакъв начин радиацията разпалва тумора и го прави интересен за имунната система“, казва Форменти.

Форменти и Демария са знаели, че ако техните констатации се задържат в проучвания при хора, тогава би било възможно да се овладее абскопалният ефект за лечение на рак, който е метастазирал в цялото тяло.

„Аскопалният отговор не е често срещан, но ние го виждаме и е доста забележително, когато се случи.“

Въпреки че лъчевата терапия е чудесна за свиване на първичните тумори, след като ракът се е разпространил, лечението обикновено е запазено за тумори, които причиняват болка на пациентите. „Радиацията се счита за локална терапия“, казва Майкъл Лим, неврохирург от университета „Джон Хопкинс“ в Балтимор, който изучава начините за комбиниране на лъчетерапията с имунотерапията за лечение на мозъчни тумори. Но, добавя той, „ако можете да използвате радиацията, за да разпалите системен отговор, това се превръща в съвсем различна парадигма“.

Когато Демария и Форменти за първи път публикуваха резултатите си през 2004 г., концепцията за използване на радиация за активиране на имунитета беше трудно продаваема. По това време изследванията за това как радиацията засяга имунната система се фокусираха върху използването на високи дози облъчване на цялото тяло, за да се унищожи имунната система на животински модели. Не беше интуитивно да се мисли, че едно и също лечение, използвано локално, може да активира имунитета в цялото тяло.

Тази перспектива обаче скоро ще се промени. През 2003 и 2004 г. Джеймс Ходж, имунолог от Националния раков институт и неговите колеги публикуваха две проучвания при мишки, показващи, че след радиация туморните клетки показват по-високи нива на протеини, които привличат и активират убиващи рак Т-клетки. Очевидно е, че радиацията не само убива раковите клетки, но може да направи и тези, които не умират, по-привлекателни за имунна атака, казва Ходж.

Тази идея получи още един тласък през 2007 г., когато изследователски екип от Института по онкология Gustave Roussy близо до Париж съобщи, че увреждането от радиацията кара раковите клетки на мишки и хора да отделят протеин, който активира дендритните клетки, наречени HMGB1. Освен това те откриха, че жените с рак на гърдата, които също носят мутация, предотвратяваща техните дендритни клетки да усещат HMGB1, е по-вероятно да имат метастази през двете години след лъчетерапията. Освен че прави туморите по-привлекателни за имунната система, казва Ходж, щетите, причинени от радиацията, също освобождават части от ракови клетки, наречени антигени, които след това подготвят имунните клетки срещу рака, подобно на ваксина.

По някакъв начин, казва Баркър, онколозите винаги са усещали, че радиацията работи ръка за ръка с имунната система. Например, когато пациентите му го питат къде отиват туморите им, след като са били облъчени, той им казва, че имунните клетки почистват остатъците от мъртвите клетки. „Имунната система действа като боклукчията“, казва той.

Имунолозите разполагат с доказателства, че боклукчиите правят нещо повече от почистване на отломките: те също са част от екипа за разрушаване и ако могат да координират работата на различни обекти, биха могли да генерират абскопски реакции. Само с радиация това се случва много рядко. „Радиацията прави част от този трик“, казва Форменти. "Но наистина трябва да помогнете малко на радиацията."

Formenti и Demaria вече са показали на мишки, че подобна помощ може да дойде под формата на имунотерапия с GM-CSF и през 2003 г. те се заемат да тестват теорията си върху пациенти. Те са лекували 26 пациенти с метастатичен рак, които са били на радиационно лечение с GM-CSF. След това изследователите използваха CT сканиране, за да проследят размерите на необлъчените тумори във времето. Миналия юни те съобщиха, че лечението е предизвикало абскопални реакции при 20% от пациентите. Пациентите с абскопални реакции са склонни да оцеляват по -дълго, въпреки че никой от пациентите не е напълно излекуван.

Докато екипът на Weill Cornell провеждаше своето проучване на GM-CSF, ново поколение имунотерапевтични лекарства пристигна на сцената. Някои, като имиквимод, активират дендритни клетки по по-целенасочен начин, отколкото GM-CSF. Друга група, инхибиторите на контролните точки, освобождават спирачките на имунната система и по-специално на Т-клетките, освобождавайки Т-клетките да атакуват тумори.

През 2005 г. Formenti и нейният екип откриха, че конкретен инхибитор на контролна точка работи по-добре с лъчетерапия, отколкото самостоятелно, и по-късно съобщават, че същата комбинация предизвиква абскопални реакции при миши модел на рак на гърдата.

Получавайте имейли за предстоящи програми на NOVA и свързано с тях съдържание, както и представени отчети за текущи събития през научен обектив.


Метод, основан на изображения, за откриване и количествено определяне на Т-клетъчно-медиирана цитотоксичност на 2D и 3D целеви клетъчни модели

Автори: Брад Ларсън, Agilent Technologies, Inc. Wini Luty, Courtney Noah, BioreclamationIVT Olivier Donzé, AdipoGen Life Sciences Glauco R. Souza, Център за здравеопазване на Тексаския университет в Хюстън и Nano3D Biosciences, Inc.

Резюме

Цитотоксичността, медиирана от Т -клетки, играе важна роля в набор от нови методи, разработени с цел да засилят имунната система на пациента и rsquos за борба с рака. С цел да се оценят и оптимизират адаптивните Т-клетъчни имунотерапии, чувствителни инвитро методите трябва да бъдат включени в процеса на тестване. В описаната тук процедура са направени фенотипни и количествени оценки на 2D и 3D некротична индукция на прицелни клетки, като се използва автоматизирано изобразяване на живи клетки. Установено е, че директното активиране на Т клетките произвежда значително по-голям цитотоксичен ефект от общото активиране, което предполага, че Т клетките могат да бъдат "научени" да насочват и унищожават специфични целеви клетки.

Въведение

CD3+ CD8+ цитотоксични Т лимфоцити (CTL) са ефекторните клетки, отговорни за Т-клетъчно-медиираната цитотоксичност, която може да действа чрез клетъчно-клетъчен контакт или чрез освобождаване на гранзими и перфорин, или чрез Fas лиганд-медиирана токсичност. 1 Като част от адаптивната имунна система, тези клетки организират целенасочени атаки, за да освободят тялото от различни компрометирани клетки, като ракови клетки, без да навредят на здравите клетки. Противодействие на тази естествена защита е широко известният факт, че туморите разработват множество методи за избягване на имунното откриване и създават ниво на толерантност срещу имунните клетки, предназначени да търсят и унищожават клетки, съдържащи чужди антигени. 2 В продължение на много години разработването на лечения избягва използването на имунната система на пациента за убиване на раковите клетки, тъй като лечението, основано на имунотерапия, среща многобройни клинични неуспехи. Разработването на методи предлага нова надежда за пациенти с рак. Приемащите техники на имунотерапия активират Т -клетките на пациента ex vivo срещу туморни антигени преди инфузия на активираните Т клетки обратно в пациента за насочване и унищожаване на туморни клетки избирателно. 3

Най популярен инвитро Методът за наблюдение на CTL ефекта върху прицелните клетки е анализът на клетъчно -медикаментозната цитотоксичност (CMC), при който Т клетките и прицелните клетки се добавят към микроплака, както и като култура. Традиционно токсичността се измерва с помощта на освобождаване на хром (51 Cr) от предварително заредени целеви клетки. Поради проблеми с изхвърлянето на радиоактивност и ниска чувствителност поради спонтанно освобождаване на изотопа от целевите клетки 4, бяха разработени по-нови методи, използващи оптични методи на базата на микроплаки, генериращи луминесценция или флуоресценция. Тези техники бяха оптимизирани за откриване на сигнала от целеви клетки, поставени в еднакъв двуизмерен (2D) монослой в ямки на микроплака. С нарастващата адаптация на клетките се агрегират в триизмерна (3D) конфигурация, за да се създаде повече in vivo-подобен модел, клетките вече не са равномерно разпределени по дъното на кладенец. Чрез включване на микроскопско изобразяване и клетъчен анализ може да се постигне чувствително откриване на индуцирана цитотоксичност от 2D и 3D плакирани целеви клетки, както и визуализация на взаимодействието между CTL и целевите клетки.

Тук ние демонстрираме автоматизиран изследователски метод за наблюдение и измерване на цитотоксичността, медиирана от CTL клетки, кинетично, използвайки цифрова широколентова микроскопия. Кокултурираните мишени MDA-MB-231 рак на гърдата и фибробластни клетки бяха поставени в 2D и 3D формат и дозирани с реагент за жива клетъчна апоптоза/некроза. Т клетките, активирани с помощта на общи или насочени методи и оцветени с далечно червено проследяващо багрило, след това бяха добавени в съотношения 20, 10, 5 или 0: 1 към клетките -мишени. След това плочите се добавят към автоматизиран инкубатор и се транспортират до цифровия широкоъгълен микроскоп, използвайки роботизирана ръка, на всеки четири часа, където светлополевите и флуоресцентните изображения са заснети за общо седем дни. Визуалното наблюдение на кинетичните изображения позволи наблюдение на CTL: взаимодействието на целевите клетки за 2D и 3D култивирани клетки, докато анализът на клетъчното изображение позволи изчисляване на индуцираната от CTL цитотоксичност през целия инкубационен период.

Материали и методи

Клетки и носители
Епителни клетки на аденокарцином на гърдата на MDA-MB-231 (номер на част HTB-26) са получени от ATCC (Manassas, VA). Клетки от човешки неонатални дермални фибробласти, стабилно експресиращи RFP (номер на част cAP-0008RFP), са закупени от Angio-Proteomie (Бостън, Масачузетс). Пречистени от човека CD3+ Т клетки, изолирани чрез отрицателна селекция от мононуклеарни клетки от периферна кръв (номер на част HM-PBMC-TCELLCD3-M), бяха дарени от BioreclamationIVT (Westbury, NY). Advanced DMEM (номер на част 12491-015), среда RPMI 1640 (номер на част 11875-093), фетален говежди серум (номер на част 10437-036) и пеницилин-стрептомицинлутамин (100X) (номер на част 10378-016) бяха закупени от ThermoFisher Scientific (Уолтъм, Масачузетс).

Анализ и експериментални компоненти
IL-2 Superkine (Fc) (номер на част AG-40B-0111-C010), анти-CD3 (човешки), mAb (UCHT1) (номер на част ANC-144-020) и анти-CD28 (човешки), mAb (ANC28 .1/5D10) (номер на част ANC-177-020) са дарени от AdipoGen Life Sciences (Сан Диего, Калифорния). SCREENSTAR 190 µm cycloolefin film с дъно с 384-ямкови микроплаки (GBO част номер 789836), CELLSTAR µClear 384-ямкови клетъчно-отблъскващи повърхностни микроплаки (GBO част номер 781976) и 384-Well BiO4, част номер 6 vi8 (ви88) NanoShuttle-PL, 6-ямково левитиращо магнитно задвижване, 384-ямкови сфероидни и задържащи магнитни устройства (2), 96-ямкова дълбоко смесителна плоча, 6-ямкови и 384-ясни прозрачни клетъчни отблъскващи повърхностни микропластини), прототип 384-ямков пръстен) Drive и допълнителна клетъчно репелентна повърхност 6-Well (номер на GBO част 657860) бяха дарени от Nano3D Biosciences, Inc., и Greiner Bio-One, Inc., (Monroe, NC). Комплектът за кинетична апоптоза (микроскопия) (номер на част ab129817) е дарен от Abcam (Кеймбридж, Масачузетс). CellTracker Deep Red Dye (номер на част C34565) е закупен от ThermoFisher Scientific (Waltham, MA).

Cytation 5 е модулен многомодов четец на микроплаки, комбиниран с автоматизиран цифров микроскоп. Налични са четене на микроплаки на базата на филтър и монохроматор, а микроскопският модул осигурява до 60x увеличение при флуоресценция, ярко поле, цветно ярко поле и фазов контраст. Инструментът може да извършва флуоресцентно изобразяване в до четири канала в една стъпка. Със специален акцент върху анализите на живи клетки, Cytation 5 включва разклащане, контрол на температурата до 65 & degC, CO22 контрол на газ и двойни инжектори за кинетични анализи и се управлява от интегриран софтуер за четене на микроплаки Agilent BioTek Gen5 и софтуер за изображения, който също автоматизира улавянето, обработката и анализа на изображения. Инструментът беше използван за кинетично наблюдение на CTL: взаимодействие на целеви клетки, както и индуциране на цитотоксичност в 2D и 3D плакирани целеви клетки.

Автоматичен инкубатор Agilent BioTek BioSpa 8
Автоматизираният инкубатор BioSpa 8 свързва четци или изображения на Agilent BioTek заедно с шайби и дозатори на Agilent BioTek за пълна автоматизация на работния процес до осем микроплаки. Температура, CO22 и нивата на влажност се контролират и наблюдават чрез софтуера Agilent BioTek BioSpa, за да се поддържа идеална среда за клетъчни култури по време на всички експериментални етапи. Тестовите плочи се инкубират в BioSpa за поддържане на подходящи атмосферни условия за период от седем дни и автоматично се прехвърлят в Cytation 5 на всеки четири часа за ярко поле и флуоресцентно изобразяване.

Тази работа използва три работни процеса, които са изобразени графично на фигура 1.

Фигура 1. T Клетъчно активиране и клетъчно медиирана цитотоксичност работен процес.

Първият работен поток от лявата страна на Фигура 1 включва активиране на Т клетки, където CD3+ Т клетки са изложени на целевите клетки MDA-MB-231, които са биопринтирани в сфероиди с помощта на магнитни полета (вижте & quot3D подготовка на прицелни клетки & quot за повече подробности.) активираните Т клетки след това се оцветяват с багрило за дълбоко червено CellTracker и се използват или в биопечатан 3D анализ на цитотоксичност на базата на сфероиди или друг, като се използват покрити клетки. Багрилото CellTracker позволява визуализация на Т-клетките, атакуващи целевите клетки, докато багрилото с пропидиев йодид позволява количествено определяне на смъртта на целевите клетки, свързана с разкъсване на плазмената мембрана.

3D подготовка на целеви клетки

Колби Т-75 с MDA-MB-231 или клетъчни култури от фибробласти се култивират до 80% сливане, след което, както е показано на Фигура 2, третирани с 600 & muL NanoShuttle-PL за една нощ при 37 ° С/5% CO2. След инкубацията, клетките бяха трипсинизирани за 3 до 5 минути при 37 ° С/5% CO2.

Фигура 2. Процедура за биопечат, използвана за създаване на 3D сфероиди за активиране на Т клетки.


Клетките се отстраняват от колбите и се добавят към 6-ямкова клетъчно отблъскваща плака при концентрация 1.2 и пъти 106 клетки/ямка. 6-ямково магнитно устройство е поставено върху плочата на кладенеца, за да се левитират клетките, където агрегацията и образуването на извънклетъчен матрикс (ECM) се извършват по време на осемчасова инкубация при 37 ° С/5% CO2. След инкубацията, клетките и ECM бяха разбити, ресуспендирани и комбинирани заедно в равни концентрации в пълна напреднала DMEM среда.

За активиране на Т клетките, 3D сфероиди бяха биопринтирани в 24-ямкова клетъчно репелентна микроплака, използвайки 384-ямково сфероидно магнитно задвижване (вижте "Насочено и общо активиране на Т клетки".

Модифицирана процедура, свързана с Фигура 2, беше използвана за приготвяне на 3D сфероиди за анализа за цитотоксичност. Процедурата беше същата, докато не беше проведено сфероидното биопринтиране. Вместо биопечатване в 24-ямкова плака, както за активиране на Т-клетките, анализът използва 384-ямкови плаки, така че един сфероид е биопринтиран във всяка ямка. Към всяка ямка на 384-ямковата клетъчно репелентна микроплака се добавят общо 2000 клетки (1000 MDA-MB-231 и 1000 фибробласта). Микроплаката се инкубира при 37 °C/5% CO2 за 48 часа, за да се позволи на клетките да се агрегират в кокултурирани тумороиди във всяка ямка.


2D подготовка на целеви клетки

Колби Т-75 с MDA-MB-231 или клетъчни култури от фибробласти се култивират до 80% сливане. След това клетките бяха трипсинизирани за 3-5 минути при 37 & ordmC/5% CO2 и се изважда от колбите. След центрофугиране, клетките се ресуспендират и се комбинират заедно при равни концентрации в пълна усъвършенствана DMEM среда. Общо 2000 клетки (1000 MDA-MB-231 и 1000 фибробласта) бяха добавени към ямки на 384-ямкова TC третирана микроплака, предназначена за 2D клетъчна култура (Фигура 2). Микроплаката се инкубира при 37 °C/5% CO2 една нощ, за да позволи на клетките да се прикрепят към ямките.

Насочено и общо активиране на Т-клетките

Общо 10 000 целеви клетки и среди бяха добавени към ямки на 24-ямкови клетъчни репелентни плаки за всяко експериментално състояние, както следва (Фигура 2). Насочено активиране: (A) 100% MDA-MB-231 (B) 75% MDA-MB-231 и 25% фибробласти (C) 50% MDA-MB-231 и 50% фибробласти общо активиране: (D) няма клетки. Общият обем е 1 mL за ямки във всяко тестово състояние. След това 24-ямковата плака се поставя върху 384-ямково устройство със сфероидни магнити и се инкубира при 37 & ordmC/5% CO2 за четири дни, където клетките се агрегират в множество 3D сфероиди във всяка ямка (Фигура 3). Обърнете внимание, че магнитното задвижване е проектирано за плътности от 384 ямки, така че разширеният размер на 24-ямков панел с плочки осигурява девет (9) отделни сфероида/ямка.

Фигура 3. 24-ямкова ямка на плака, показваща съвместна култура на Т клетки и биопринтирани намагнетизирани 3D целеви сфероиди преди започване на насочено активиране. Т клетки, добавени в съотношение 10: 1 към целевите клетки, предварително агрегирани в 3D сфероиди (

След сфероидна агрегация, Т клетките бяха приготвени при концентрация от 100 000 клетки/mL в RPMI среда, съдържаща 100 ng/mL IL-2 суперкин (Fc) (суперкин) заедно с 250 ng/mL всеки от анти-CD3 и анти-CD28 антитела . След това отработената среда се аспирира, докато плочата остава върху магнитното задвижване за закрепване на сфероидите и се заменя с прясна среда, съдържаща Т клетки, антитела и суперкин, както е описано по-горе. След това плаката се поставя обратно в BioSpa за инкубиране в продължение на шест дни. BioSpa е предварително програмиран, за да заснеме 12 и 10 пъти монтаж на изображение от всяка тестова ямка на всеки шест часа. Ръчен обмен на среда, IL-2 Superkine и антитела се извършва след 72 часа. Насочената процедура за активиране в продължение на шест дни служи не само за активиране на Т -клетките, но също така ги учи да разпознават целевите клетъчни антигени, позволяващи целенасочена цитотоксичност. Общото активиране следва същата процедура, но не използва целеви клетки, поради което не трябва да има насочена цитотоксичност. 5

Оцветяване и добавяне на Т -клетки

След приключване на процеса на активиране, 24-ямковата плака, съдържаща Т клетките и намагнетизираните целеви клетки, се поставя обратно на магнитното устройство с 384 ямки. След това Т клетките се отстраняват от всяка ямка и се прехвърлят в отделна 15 mL конична епруветка за оцветяване с CellTracker Deep Red багрило, позволяващо диференциране от целевите клетки по време на експеримента за цитотоксичност. Оцветителят, при концентрация 1 & microM, се добавя към епруветките и се инкубира при 37 & degC/5% CO2 за 45 минути. След това епруветките се центрофугират в продължение на 15 минути при 200 RCF. Средата, съдържаща излишното багрило, след това беше отстранена и заменена с нова RPMI среда. Оцветените Т клетки от всяко условие на активиране след това се разреждат в RPMI среда, съдържаща 10 & microL/mL от пропидиево -йодидната некрозна сонда от комплекта за кинетична апоптоза. След това клетките се добавят към плочки с 2D или 3D клетъчна култура с 384 гнезда, които вече съдържат общо 2 000 целеви клетки, в концентрации, равни на 40 000 клетки/ямка, 20 000 клетки/ямка или 10 000 клетки/ямка (Фигура 1). Тези концентрации създават съотношения от 20:1, 10:1 или 5:1 Т клетки към целевите клетки във всяка ямка. Включени са и нетретирани отрицателни контролни ямки, за да се изследват нивата на цитотоксичност на базалните целеви клетки във времето. Таблица 1 илюстрира окончателното оформление на плочите.

маса 1. Оформление на плочата за 2D и 3D клетъчно-медиирана цитотоксичност.


Автоматизирана процедура за клетъчно-медиирана цитотоксичност

Фигура 4. Agilent BioTek BioSpa система за изобразяване на живи клетки, включително Agilent BioTek BioSpa 8 и Agilent BioTek Cytation 5.


2D и 3D плочи за анализ, съдържащи Т клетки и целеви клетки, бяха добавени към BioSpa 8, като част от системата за изображения на живи клетки BioSpa (Фигура 4), с атмосферни условия, предварително зададени на 37 °C/5% CO2. В тигана се добавя и вода, за да се създаде овлажнена среда, която се следи. Софтуерът Agilent BioTek BioSpa беше настроен така, че плочите автоматично да се прехвърлят в Cytation 5 за ярко поле и флуоресцентно изобразяване на тестовите ямки на всеки четири часа за общо седем дни. Таблица 2 обяснява изображенията, извършени с всеки канал. За клетки с 2D плаки беше направено едно изображение с 4x увеличение с всеки канал, за да се улови представителна популация от клетки на ямка. Вграден е лазерен автофокус, за да се осигури правилно фокусиране върху целевия клетъчен слой, както и най-ефективната процедура за фокусиране. За 3D плакирани клетки, тъй като клетките в сфероидите на 3D прицелните клетки съществуват на множество z-равнини, z-стека, състоящ се от пет резена, се улавя с всеки канал. Отново беше включен лазерен автофокус. По две изображения са направени под и над определената фокусна равнина.

Таблица 2. Клетка, изобразена за канал за изобразяване.


2D и 3D обработка на изображения

След заснемането, 2D и 3D изображенията бяха обработени преди анализа. 2D изображенията са претърпели предварителна обработка, за да премахнат фоновия сигнал от всеки канал, като използват настройките в Таблица 3.

Таблица 3. Параметри за предварителна обработка на 2D изображение.


За 3D изображения първо беше извършена z-проекция на изображенията, заснети в z-stack, за да се създаде окончателно изображение, съдържащо само най-фокусираната информация (Таблица 4).

Таблица 4. Критерии за 3D Z-проекция


След това беше извършена предварителна обработка на прожектираното изображение, за да се премахне отново фоновия сигнал от всеки канал (Таблица 5).

Таблица 5. Параметри за предварителна обработка на 3D изображение.


Клетъчен анализ на 2D и 3D обработени изображения

Клетъчен анализ беше извършен върху обработените изображения, за да се определи общия сигнал, излъчван от некротични целеви клетки, като се използват критериите в Таблица 6.

Таблица 6. Критерии за идентификация на некротични клетки.


На 3D изображенията беше извършена допълнителна стъпка за анализ на изображението, за да се определи степента, до която сфероидите на целевите клетки се разпаднаха след третиране с Т клетки (Таблица 7).

Таблица 7. Критерии за разпадане на сфероидите.

Резултати и дискусия

Откриване на съвместно култивирани клетъчни взаимодействия, базирано на изображения

Т-клетките, активирани чрез директни и общи процедури за активиране, се добавят към целевите клетки в концентрации, равни на 20:1, 10:1, 5:1 и 0:1, за да започне клетъчно-медиираната цитотоксичност. За да се наблюдава взаимодействието на съвместно култивираните клетки, плаките се изобразяват непосредствено след добавянето на Т клетки и на всеки четири часа след това през целия седемдневен инкубационен период.

С увеличаването на времето за инкубиране на анализа, очевидно е, че активираните Т клетки (червена флуоресценция) търсят и се групират около антиген-представящите целеви клетки чрез свързване на антиген-рецептор както в 2D, така и в 3D формати (Фигура 5А). Тази агрегация на Т клетки е в ярък контраст с по -равномерното разпределение на червената флуоресценция в момент 0.

Фигура 5. Brightfield/CY5 изобразяване на клетъчно взаимодействие. 4x изображения на светло поле и CY5, показващи групиране на Т клетки и свързване към (A) 2D или (B) 3D целеви клетки. Време = 24 часа.

Когато изображенията от PI канала се наслагват с тези от канала на яркото поле, може да се наблюдава, че жълт флуоресцентен сигнал от пропидиево -йодидната некротична клетъчна сонда произхожда от същите целеви клетки със свързани Т клетки (Фигура 6). Това потвърждава цитотоксичния ефект надолу по веригата на свързването на Т-клетките към целевите клетки.

Фигура 6. Brightfield/PI изобразяване на клетъчно взаимодействие. 4x изображения от ярко поле и PI, показващи некротични (A) 2D или (B) 3D целеви клетки в отговор на свързването на Т клетки. Време = 24 часа.


Кинетично изобразяване на индуцирана от Т клетки клетъчна индукция на цитотоксичност

За да се определи кинетиката на индукция на цитотоксичност в рамките на целевите клетки, изображенията трябва да се извършват на редовни интервали през целия инкубационен период. Тъй като пълният цитотоксичен ефект може да не бъде постигнат до дни след добавянето на Т клетки, също така е важно клетките да бъдат оставени да взаимодействат в продължение на няколко дни. Контролът на околната среда на Cytation 5 и BioSpa 8, както и автоматичното прехвърляне на тестови плаки от инкубатор към устройство за изображения, позволяват завършването на кинетичния анализ, без да се компрометира здравето на клетките. В проведените тук експерименти яркополевите и флуоресцентните изображения бяха заснети на всеки четири часа за общо седем дни. Фигури 7 и 8 демонстрират итеративен цитотоксичен ефект, който Т клетките, директно активирани в присъствието на 100% MDA-MB-231 клетки и добавени в съотношение 20: 1, имат съответно върху 2D и 3D култивирани целеви клетки.

Фигура 7. CY5/PI изобразяване на 2D индукция на цитотоксични целеви клетки. 4 пъти наслагвани CY5 и PI изображения, показващи оцветени Т клетки и сигнал от пропидиев йодид некротична клетъчна сонда след (А) 0 (В) 48 (С) 96 и (Г) 168 часови инкубационни периоди на кокултура.

Фигура 8. Brightfield/CY5/PI изобразяване на 3D индукция на цитотоксични целеви клетки. 4x покрити изображения от ярко поле, CY5 и PI, показващи оцветени Т клетки и сигнал от пропидиев йодид некротична клетъчна сонда след (A) 0 (B) 48 (C) 96 и (D) 168 -часов инкубационен период на кокултура.


Количествено определяне на цитотоксичността на целевите клетки

След улавяне на изображението, количеството на индуцираната от Т клетки клетъчна цитотоксичност се определя количествено.

Фигура 9. Клетъчен анализ на цитотоксичността на целевите клетки. 4x изображения, показващи флуоресценция от пропидиев йодид некротична клетъчна сонда след 96-часова инкубация. Обектните маски (в синьо), поставени около (A) 2D и (B) 3D култивирани целеви клетки, отговарящи на критериите за клетъчен анализ.

Използвайки оптимизираните критерии за анализ на изображението, описани в Таблица 6, маски на обекти бяха поставени около клетки, отговарящи на критериите за минимален праг на сигнал от PI некротичната клетъчна сонда (Фигура 9). Тъй като Т клетките имат по -малък размер в сравнение с целевите клетки във 2D или 3D формат, минималната стойност на границата на обекта е зададена така, че единични некротични Т клетки не са включени в анализа. Това може да се види на фигури 9A и 9B.

Феномен, наблюдаван също в кинетичните изображения на 3D CMC анализа, е, че тумороидът започва да се разпада в отговор на нарастващата цитотоксичност, освобождавайки групи от клетки в околната среда. Макар и по-малки от непокътнато тумороидно тяло, тези агрегати остават по-големи от отделните Т клетки и също така излъчват сигнал от сондата за некротични клетки на PI, поради което са включени в окончателния анализ (Фигура 9В).

От извършения анализ броят на некротичните клетки на изображение се изчислява за 2D култивирани целеви клетки. Когато се култивират в 3D, клетките в тумороида и по-малки агрегати съществуват на множество z-равнини. Следователно, за да се определи количествено индуцираната цитотоксичност с най -голямо ниво на точност, общият PI сигнал в рамките на всички обектни маски на изображение се определя количествено. Стойностите (брой клетки или общ PI сигнал), изчислени във всяка времева точка, след това се разделят автоматично на стойността, изчислена в момент 0 в софтуера Gen5. По този начин малките отклонения между репликите бяха нормализирани. След анализ, резултатите бяха начертани, за да се оцени дали са наблюдавани разлики в индуцираната цитотоксичност на целевите клетки между условията на изпитване. Графиките на Фигура 10 показват изчислените данни за Т клетки, добавени към ямките за тестване в съотношение 20: 1, активирани в присъствието на 100%, 75%, 50% или 0% клетки MDA-MB-231, в сравнение с неактивирания Т клетки.

От фигура 10 е очевидно, че индуцираната от Т клетки клетъчна цитотоксичност се увеличава по отношение на степента на насочена клетъчна активация както в 2D, така и в 3D клетъчни модели. Т-клетките, активирани в присъствието на 100% MDA-MB-231 клетки, предизвикват най-високо ниво на цитотоксичност, докато тези, активирани само в присъствието на антитела и суперкин, предизвикват най-ниското увеличение на броя на некротичните клетки на изображение над базалните некротични клетки. Моделите обаче се различават по своите кинетични реакции. В 2D модела (Фигура 10А), Т клетъчно-медиираната цитотоксичност достига пик на около 24 часа след добавянето на активираните Т клетки, както се вижда от съотношението на некротичните клетки от ямките, съдържащи Т клетки, към броя на некротичните клетки от отрицателните контролни ямки. Всяка по -нататъшна некроза след около 3 дни се дължи на ограниченията на 2D модела, както е отбелязано от увеличената некроза с течение на времето, очевидна в отрицателната контрола. Обратно, в 3D модела (Фигура 10В), некротичните съотношения на общия сигнал от PI сондата продължават да се увеличават или плато в хода на кинетичния пробег поради факта, че здравето на клетките се запазва много по -добре в нетретирания 3D клетъчен модел.

След това беше извършен анализ на некротична клетъчна индукция върху ямки, съдържащи Т клетки, директно активирани в присъствието на 100% MDA-MB-231 клетки и след това добавени към 2D и 3D плакирани целеви клетки за CMC анализа в съотношения 20: 1, 10: 1, 5: 1. Включена е и отрицателна контрола, когато целевите клетки не са третирани.

Фигура 10. Протокол за активиране Индукционен анализ на цитотоксичност. Сравнение на индукцията на цитотоксични целеви клетки от Т клетки, активирани в присъствието на анти-CD3 и анти-CD28 антитела, суперкин и 100% MDA-MB-231 клетки, 75% MDA-MB-231/25% фибробластни клетки, 50% MDA-MB-231/50% фибробластни клетки или никакви клетки. Данните за неактивираните Т клетки също са включени и нанесени с помощта на лявата ос y. Брой на некротични клетки или общ PI сигнал във времето от нетретирани отрицателни контролни целеви клетки, нанесени върху дясната ос y. Показани са резултати за Т клетки, инкубирани с (А) 2D култивирани целеви клетки или (В) 3D култивирани целеви клетки в продължение на седем дни.

От фигура 11 е видно, че с течение на времето се получават кинетични отговори на Т-клетъчно-медиирана цитотоксичност за различни съотношения на Т-клетка към клетка-мишена както за 2D, така и за 3D модели. Тези констатации са в съответствие с предишните резултати от сравнението на протокола за активиране (Фигура 10), както и с резултатите, докладвани с in vivo тестване.

Фигура 11. Ефект на концентрацията на Т клетки. Сравнение на индукцията на цитотоксични целеви клетки от Т клетки, добавени към ямки при концентрации от 40 000 клетки/ямка (съотношение 20:1), 20 000 клетки/ямка (съотношение 10:1), 10 000 клетки/ямка (съотношение 5:1) и 0 клетки/ямка (отрицателна контрола). Показани са резултати за Т клетки, инкубирани с (А) 2D или (В) 3D култивирани целеви клетки в продължение на седем дни.

И накрая, ефектите от насоченото активиране могат също да бъдат измерени с помощта на канала на светлото поле, когато целевите клетки се култивират в 3D. Това се дължи на факта, че в отговор на цитотоксичния Т -клетъчен ефект, тумороидите се разпадат с течение на времето или експлодират, освобождавайки клетки и ECM в ямката. Използвайки възможностите за измерване на сливането на Gen5 и оптимизираните показатели в Таблица 7, степента на тумороидно разпадане може да бъде количествено определена. Само пиксели във всяко изображение със светлинен сигнал под критериите за горен праг се включват в изчисляването на процента на сливане. Когато се гледат в Gen5, отклонените пиксели се виждат като бели (Фигура 12).

Фигура 12. Определяне на сливането на изображението с помощта на сигнал от ярко поле. 4x изображения с ярко поле след анализ на изображението и % определяне на сливането. Пикселите, които не са включени в изчислението на сливането, изглеждат бели. Изображения, показани след клетъчно взаимодействие и свързване с 10: 1 Т клетка към прицелно клетъчно съотношение за (А) 72 (В) 116 (С) 136 и (Г) 168 часови инкубационни периоди.

След това стойностите на процента на сливане могат да бъдат нанесени с течение на времето, за да се визуализира кинетиката на тумороидното разпадане в отговор на увеличаване на съотношението на Т клетките към целевите клетки.

Кривите на фигура 13 илюстрират как начертаването на сливането във времето обяснява кинетиката на крайния ефект. Както може да се очаква, по-високите концентрации на активирани Т клетки разрушават тумороида по-бързо от по-ниските концентрации. Нелекуваните тумороиди също показват малка промяна в сливането поради факта, че се наблюдава малка или никаква клетъчна токсичност (Фигура 10В), позволяваща на тумороида да остане непокътнат през седемдневния инкубационен период.

Фигура 13. Кинетичен процент количествено определяне на сливането на изображението. График на процентното сливане на изображението на кинетично светло поле поради 3D тумороидно разпадане.

Заключение

Установено е, че директното активиране на Т клетките, когато те са били изложени на прицелни клетки за продължителни периоди in vitro, води до значително увеличение на цитотоксичността в сравнение с общото активиране без прицелни клетки. Освен това намаляващ ефект е очевиден, ако прицелните клетки са кокултурирани с фибробласти в процеса на активиране: колкото по -голямо е съотношението на фибробластите, толкова по -малка е цитотоксичността. Това предполага, че Т клетките могат да бъдат включени в процеса на активиране, за да търсят и унищожават целевите клетки.

Моделът на 3D клетки е далеч по -добър от 2D клетъчния модел, тъй като здравето на клетките се поддържа през дългите кинетични цикли. Цитотоксичността може да бъде определена количествено с помощта на пропидиев йодид, който измерва разкъсването на плазмената мембрана, или с ярко поле (без етикети), което измерва увеличаването на сливането чрез дезагрегация на сфероиди.

Системата Agilent BioTek BioSpa, състояща се от автоматизиран CO2 инкубатор, разместващ микроплаки към четеца за клетъчни изображения на Agilent BioTek, позволява автоматично автоматизиране на 7-дневния анализ за кинетична цитотоксичност.


Резултати

Генериране на Nlrc5-стоп флокс трансгенна мишка като инструмент за условна експресия на молекули МНС клас I

По-рано беше показано, че експресията на МНС II върху DP тимоцити насърчава развитието на МНС II-ограничени тимоцит-селектирани CD4 Т клетки (T-CD4) с NKT-подобен фенотип 21, 22, 24, 29. Следователно, ние предположихме, че експресията на MHC I върху DP тимоцити може да има подобен ефект чрез избор на MHC I-ограничени NKT-подобни Т клетки (Фиг.   1a). Обикновено мишите тимоцити на етапа на развитие на DP не експресират класически молекули MHC I или MHC II 19. В търсене на подходящ подход за стимулиране на стабилна експресия на MHC I в DP, ние избрахме транскрипционния фактор Nlrc5 (известен също като CITA) като топ кандидат с такава потенциална функция. Nlrc5 е от решаващо значение за транскрипцията не само на MHC I гени, но и на компоненти, необходими за обработката на MHC I и зареждане с пептиди, като 㬢m, Tap1 и Lmp2 25, 28 . В допълнение, Nlrc5 експресията е силно потисната на етапа на DP тимоцитите (фиг.   1b данни от ImmGen 30). За да проверим дали Nlrc5 може да предизвика по-висока експресия на MHC I in vitro, ние клонирахме кодиращата последователност (CDS) на миши Nlrc5 ген в лентивирусен експресионен вектор. В действителност, трансдуцирани HEK 293 клетъчни проби показаха, че Nlrc5 е достатъчен да предизвика по-висока експресия на MHC I в сравнение с контролните проби (Фиг.  1c).

а Схематично представяне на положителна селекция на вродени Т клетки върху DP тимоцити. б ниво на експресия на иРНК при мишки Nlrc5 в различни Т-клетъчни подгрупи от B6 WT мишки. Данните са получени от ImmGen. ° С Анализ на поточна цитометрия на клетки HEK 293, трансдуцирани с експресионен вектор на лентивирус, кодиращ мишката Nlrc5 кодираща последователност (CDS) или с празен вирус като контрола. Като допълнителни контроли са показани нетрансдуцирани клетки и изотипно контролно оцветяване. Клетките се анализират 48 h след трансдукцията. д Структура на дивия тип (WT) Rosa26 и целевия алел на трансгенната мишка (Nlrc5-стоп флокс). д Оценка с поточна цитометрия на експресията на MHC I и MHC II върху Т клетки от WT, CD4-Cre × Nlrc5-stop flox (T-MHC I) и Plck-CIITA (T-MHC II) трансгенни мишки. Данните са представителни за пет независими експеримента, н ≥𠂕 мишки за експериментална група. Изходните данни се предоставят като файл с изходни данни.

За да тествате ролята на Nlrc5 in vivo, ние генерирахме индуцируема трансгенна мишка, при която експресията на Nlrc5 може да бъде регулирана по специфичен за тъканите начин, в клетки, които експресират Cre рекомбиназа. Накратко, конструкция с ограничена от loxP стоп касета пред мишката Nlrc5 CDS е поставен в Роза26 локус (фиг.   1d). Този дизайн позволява Nlrc5 експресия, след като Cre рекомбиназа присъства в клетката. Тази линия на мишката беше пресечена до CD4-Cre мишката, инициираща Cre експресията на DP етапа. Ние наблюдавахме, че MHC I (H-2Db и H-2Kb) е силно експресиран върху DP тимоцити при тези мишки, в сравнение с контролите, които обикновено не го експресират (Фиг.   1e и Допълнителна Фиг.   1a) . Единично положителни (SP) тимоцити и спленоцити, които нормално експресират високи нива на MHC I, показват само малко по-високи нива при тези мишки. Трябва да се отбележи, че експресията на MHC II не е повлияна от Nlrc5 трансген (фиг.  1e).

Некласическите алели на MHC Ib, които представят пептиди, Qa-1, Qa-2 и H2-M3, показват същия модел на експресия на тимоцитите като класическите алели на MHC Ia H2-Kb и H2-Db (т.е. ниско на DP тимоцити) (допълнителна фиг.   1d). Nlrc5 свръхекспресията доведе и до тяхното регулиране нагоре (допълнителна фигура  1b). Обратно, генната експресия на непептидни молекули CD1d и MR1 е с високо съдържание на DP тимоцити (допълнителна фиг.   1e) и не се променя от свръхекспресията на Nlrc5 (Допълнителна фиг.   1в). Това предполага, че представянето на пептида чрез MHC Ia/Ib молекули, по-специално, липсва в кортикалните DP тимоцити поради отсъствието на Nlrc5 експресия, докато липидното и метаболитното представяне се запазват.

Като допълнителен контрол, ние получихме plck-CIITA трансгенни мишки 21, които свръхекспресират MHC II върху Т клетки, започвайки от етапа на DP тимоцитите (Фиг.   1e). В следващите раздели и двата щама бяха анализирани паралелно. За простота се позоваваме на CD4-Cre/Nlrc5-stop флокс като “T-MHC I” мишка и pLck-CIITA като “T-MHC II” мишка.

Експресията на MHC I върху DP тимоцити води до увеличаване на PIL Т клетките

Архитектурата на тимуса и общото разпределение на подмножеството в тимуса не показват забележителни промени между дивите тип (WT) и T-MHC I еднояйце (Фиг.   2a 𠄼 и Допълнителна фиг.   2). Нямаше значителни разлики в честотата на DN, DP, CD4 SP Т клетки, γδ Т клетки или γδ NKT клетки (дефинирани като PLZF +  γδ Т клетки). T-MHC II мишки показват повишена честота на CD8 SP поради индуцирането на “ феномен на паметта ” CD8 Т клетки, както е описано по-горе 31. За разлика от тях, T-MHC I мишките показаха, ако не друго, леко намаляване на броя и честотата на CD8 SP Т-клетките и малко увеличение на броя на клетките MAIT (фиг.  2a𠄼 и стробиране в допълнителна фигура& #x000a0 3a𠄼 ). iNKT клетките бяха приблизително два пъти намалени по брой и честота както при T-MHC I, така и при T-MHC II мишки. Намаляването на броя и честотата на клетките на iNKT е още по -забележимо в далака и същата тенденция на намаляване е налице и в черния дроб (допълнителна фиг.   4a, b). Няма значителни разлики в MAIT клетката и γ δ NKT клетъчен номер в далака (допълнителна фиг.   4d, e). Изненадващо, Т.рег клетъчната честота не е засегната при T-MHC II мишки, но е увеличена в тимуса и далака на T-MHC I мишки. В далака тази разлика също е статистически значима в броя на клетките (допълнителна фиг.   4b долния панел). Като цяло, трансгенната мишка T-MHC I не показва значителни промени в развитието на лимфоцитите, с изключение на умерено увеличение на Трег и намаляване на честотата и броя на iNKT клетките.

а Представителни графики на поточна цитометрия на общите тимоцити от WT, T-MHC I и T-MHC II мишки. б Количествено определяне на данните според стратегията за строеж, показана в а. Клетъчните честоти са нанесени на лявата ос, а числата по дясната ос. ° С Общ брой клетки на MAIT клетки и γ δNKT клетки в тимуса на WT и T-MHC I мишки. д Представителни графики на стратегията на поточна цитометрия за идентифициране на PIL клетки в тимуса на WT. д Представителни графики на поточна цитометрия за оцветяване за PIL клетки, сравняващи WT с T-MHC I и T-MHC II мишки от тимуса и далака. е Честота (нанесена на лявата ос) и брой (нанесена на дясната ос) на PIL клетки от WT, T-MHC I и T-MHC II мишки, определени от стратегията за поточна цитометрия, изобразена в д. б, ° С, е Всяка точка представлява едно животно: н  = � животни на група (WT и T-MHC I групи) и н  = 𠂘 животни (група T-MHC II) в б, н  = 𠂔 животни на група в ° С и н  = 𠂙 животни на група в е. Данните са представителни за пет инча а, б и осем инча де независими експерименти.Един експеримент е извършен през ° С. Извършен е недвоен двустранен тест на Mann –Whney б, ° С, е) стр ≥𠂐.01 не са изобразени, **стр <𠂐.01, ***стр  < 𠂐.001, и ****стр  < 𠂐.0001. Данните са стрвъзразява като средни стойности ± SD. Изходните данни се предоставят като файл с изходни данни.

След това се опитахме да определим дали клетките с NKT-подобен фенотип са разширени в T-MHC I трансгенна мишка, подобно на това, наблюдавано при T-MHC II мишки (Фиг.  1a). PLZF е основният транскрипционен фактор, който придава вродени характеристики на iNKT клетъчната линия 14 . Следователно, ние създадохме стратегия за гетиране, която позволява идентифициране на пептид-специфични PIL Т клетки, чрез затваряне на TCR β + PLZF + клетки и изключване на други подмножества, за които е известно, че експресират PLZF, като iNKT клетки, γ δ Т клетки, и клетки MAIT (фиг.  2d). С тази стратегия ние идентифицирахме малка част от PIL Т клетки, присъстващи в WT отсечки, увеличавайки се четирикратно при мишки T-MHC I (Фиг.   2e, f). Независимо от това, тази промяна е по-малко стабилна от 10 �-кратното увеличение на PIL T клетките в T-MHC II.

Разширяването на PIL Т-клетките е зависимо от SAP и не се медиира от Nlrc5 по присъщ на клетката начин

Въпреки че не наблюдаваме повишена регулация на повърхностния CD1d в отговор на експресията на Nlrc5 в DP тимоцити, формално е възможно PIL Т клетките да са CD1d зависими. Следователно, кръстосвахме мишки T-MHC I до Cd1d −/− мишки. Дефицитът на CD1d отменя развитието на iNKT клетки, както се очакваше, но ако не друго, увеличава броя на PIL Т-клетките в T-MHC I мишки (фиг.  3a, b). По този начин повечето PIL T клетки вероятно са ограничени от MHC Ia/Ib, тъй като техният брой зависи от експресията на MHC I в DP тимоцити, но не зависи от CD1d.

а Представителни графики на поточната цитометрия на общите тимоцити от Cd1d −/− и Cd1d −/− T-MHC I мишки. б Сравнение на честотата и броя на клетките на тимуса iNKT и PIL между WT и Cd1d −/−, и T-MHC I и Cd1d −/− T-MHC I мишки. ° С Представителни графики за поточна цитометрия от набор от неравностойни химерни мишки от костен мозък (BM) 8 седмици след трансплантацията. WT CD45.1 + мишки бяха облъчени смъртоносно и трансплантирани със смес от WT CD45.1/2 + и T-MHC I CD45.2 + костен мозък в съотношение 1  : �. Тази експериментална група е изобразена като WT  + T-MHC I група. В контролната група мишките са трансплантирани със смес от WT CD45.1/2 + и WT CD45.2 + костен мозък в съотношение 1  : �. Тази експериментална група е изобразена като WT  + WT група. Показани са представителни графики на поточна цитометрия, показващи стратегията на стробиране от групата WT + WT (в левите два панела). В дясно четири панела (в зелено) са показани представителни графики, показващи честоти на PIL клетки (затворени на WT CD45.1/2+) от групата WT  + WT (вляво) и WT  +&# x02009T-MHC I група (вдясно). Оценката на честотата на PIL клетки е показана в д. д Представителни графики на поточна цитометрия на общите тимоцити от Sh2d1a/− (дефицит на SAP) и Sh2d1a −/− T-MHC I мишки. iNKT, PIL и Tрег клетъчната честота са показани в е. б, д, е Всяка точка представлява едно животно: н  = � животни на група (WT и T-MHC I групи), н  = 𠂗 животни (CD1d −/− група), н =𠂓 животни (CD1d −/− T-MHC I група), н =𠂘 животни (WT + WT група), н =𠂙 животни (WT + T-MHC I група), н =𠂕 животни (Sh2d1a −/− група) и н  = 𠂖 животни (Sh2d1a −/− T-MHC I група). Данните са представителни за четири инча а, б, д, е и два в ° С, д независими експерименти. Извършен е недвоен двустранен тест на Mann –Whney б, д и недвоен студент с две опашки ’s T- тестът е извършен в е ns, не е значително (стр  ≥ 𠂐.05), *стр <𠂐.05, **стр <𠂐.01, ***стр  < 𠂐.001, и ****стр <𠂐.0001. Данните са представени като средни стойности   ±  SD. Изходните данни се предоставят като файл с изходни данни.

След това изследвахме дали MHC I е необходим на съседни DP тимоцити за развитие на PIL Т-клетки, или това се дължи на неизвестен клетъчно присъщ ефект на свръхекспресията на Nlrc5. За тази цел ние установихме набор от неравномерни химерни мишки с BM, където реципиентите на WT бяха облъчени смъртоносно и трансплантирани със смес от WT и T-MHC I BM в съотношение 1  : � от различни вродени мишки. С тази настройка 90% от съседните тимоцити биха експресирали MHC I и по този начин са способни да индуцират PIL Т-клетъчна селекция в WT прогенитори. Контролна група получава смес от WT и WT BM от различни вродени мишки. Наистина, 8 седмици след трансплантацията, значително увеличение на PIL Т клетки е налице сред клетките, получени от WT BM, когато съседните тимоцити експресират MHC I, в сравнение с контролната група (Фиг.   3c, d). Значително увеличение на честотата на PIL Т-клетки е налице и в далака. Следователно, този резултат не благоприятства възможността принудителната експресия на Nlrc5 да насърчава развитието на PILs по присъщ на клетките начин и потвърждава хипотезата, че PIL Т клетките се разширяват поради повишаване на MHC I върху съседните DP тимоцити. По -специално, честотата на Т.рег клетките не се увеличават сред клетките, получени от WT BM, а се наблюдават само сред клетките, получени от T-MHC I (допълнителна фиг.   5a, b). Това показва, че наблюдаваното разширяване на Tрег клетките в мишката T-MHC I се медиират от експресията на Nlrc5 по присъщ на клетките начин.

Основно изискване за развитието на iNKT клетки е задействане на сигнални пътища на SLAM-SAP по време на селекция на агонисти 13. Следователно, ние се опитахме да определим дали дефицитът на SAP има същото въздействие върху PIL T клетката, както върху развитието на iNKT клетки. Очаквано липсата на SAP напълно отмени развитието на iNKT клетките. Той също така отменя генерирането на PIL Т клетки както в тимуса (фиг.  3e, f), така и в далака (допълнителна фигура   5c, d). Това показва, че PIL Т клетките и iNKT клетките използват подобни сигнални пътища по време на своя подбор и развитие.

PIL Т клетките се намират в същите ефекторни подгрупи като iNKT клетки

Тимусните iNKT клетки съществуват в три добре дефинирани ефекторни подгрупи (iNKT1, 2 и 17), аналогично на периферно активирани помощни Т клетки 32. Използвайки оцветяване с транскрипционен фактор, открихме, че PIL T клетките също се разделят на три подобни подгрупи, които наричаме PIL1 (PLZF lo Tbet + RORγt - ), PIL2 (PLZF hi RORγt - ) и PIL17 (PLZF int ROR& #x003b3t + ) клетки (фиг.  4a). Експресията на NK1.1 върху PIL1, CD4 върху PIL2 и CD138 върху PIL17 клетки също е подобна на тази на iNKT клетъчни подгрупи (допълнителна фиг.   6a). Следователно, това предполага, че всяка PIL фракция може да проявява подобни функционални свойства на съответната подмножество клетки iNKT. Няколко независими проучвания показват, че трите NKT подгрупи имат доста различни програми за генна експресия 33 – 35 . Всъщност, експресията на голям панел от функционално значими молекули, включително CD122, CXCR3, CD69, PD1, CCR6 и CD25, беше подобна сред подгрупите PIL и iNKT (допълнителна фигура  6b), както и производството на цитокините интерферон -γ (IFN γ), интерлевкин (IL) -4 и IL-17A след in vitro стимулация (допълнителна фиг.   6c) 32, 33. Взети заедно, тези данни предполагат, че аналогични транскрипционни и функционални програми работят в PIL и iNKT клетки.

а Подобно на iNKT клетки, PIL Т клетките се разделят на три подмножества, дефинирани от модела на експресия на транскрипционни фактори PLZF и ROR γt. Показани са представителни графики на поточна цитометрия, сравняващи PIL Т-клетъчни подгрупи от WT, T-MHC I и T-MHC II мишки. б Сравнения на честотите на подмножество на Т-клетъчни PIL (горния ред) и числата (долния ред). ° С Представителни графики на поточна цитометрия за оцветяване за CD4 и CD8 α върху PIL клетки от WT, T-MHC I и T-MHC II мишки. д Оценка на поточна цитометрия на верижния репертоар на TCR V β на тимусни PIL T клетки от WT, T-MHC I и T-MHC II мишки в сравнение с конвенционалните Т клетки. д Примерни графики, показващи оцветяване за TCRβ върху iNKT клетъчни подгрупи в сравнение с PIL Т-клетъчни подгрупи от WT, T-MHC I и T-MHC II мишки. Всички анализирани животни са поколение F1 с BALB/c мишки (допълнително характеризирано на фиг.   6). е Модел на експресия на CD44 и NK1.1 върху (отляво надясно) iNKT, WT PIL, T-MHC I PIL и T-MHC II PIL Т клетки. б Всяка точка представлява едно животно: н  = 𠂘 животни на група (WT и T-MHC II групи) и н  = 𠂙 животни (T-MHC I група). Данните са представителни за седем инча а° С и три в де независими експерименти. Извършен е недвоен двустранен тест на Mann –Whney б ns, не е значително (стр ≥𠂐.05), *стр  < 𠂐.05, **стр <𠂐.01, ***стр <𠂐.001 и ****стр  < 𠂐.0001. Данните са представени като средни стойности ± SD. Изходните данни се предоставят като файл с изходни данни.

По-специално, и двете MHC I- и MHC II-ограничени PIL Т клетки са диференцирани в три подгрупи (Фиг.   4a, b). Въпреки това, MHC II-ограничени PIL Т клетки в T-MHC II животни показват силно изкривяване към PIL2 ефекторния фенотип, за сметка на PIL17. Това е в съответствие с добре описаното свръхпроизводство на IL-4 от PLZF + T-CD4s в pLck-CIITA мишки 31. Трите подгрупи обаче присъстват в сходни пропорции при WT и T-MHC I мишки (Фиг.   4a, b).

Както бе споменато по -горе, PIL T клетките могат да бъдат фенотипно и функционално подобни на iNKT клетките. И все пак, за разлика от iNKT клетките, те са избрани върху класически молекули на МНС. Следователно, ние проверихме тяхната експресия на TCR ко-рецептор и използването на веригата TCR V β. Както беше съобщено по-рано, беше установено, че PIL Т клетките, развиващи се в T-MHC II мишки, са до голяма степен CD4 SP с малка част от DN клетки (фиг.  4c). Изненадващо, PIL T клетките в T-MHC I мишки не експресират изключително CD8, но се разделят на CD4 SP, CD8 SP и DN, подобни на тези при WT мишки, което предполага, че PIL T клетките в WT мишки могат да бъдат по-тясно свързани с МНС I-ограничени клетки (фиг.   4в). Въпреки че не наблюдавахме сериозно отклонение в използването на TCR Vβ веригата от PIL T клетките, имаше забележимо увеличение на честотата на V㬣 + и V㬥.1/V㬥.2 + клетки в PIL T -клетъчен пул от WT и T-MHC I мишки. В допълнение, малко увеличение на честотата на V 㬦 + клетки е налице в PIL Т клетките от T-MHC II мишки (Фиг.   4d).

По -рано беше показано, че подгрупите от тимусни iNKT клетки показват различни нива на TCR на повърхността си, черта, която е по -забележима на фона на BALB/c 33, 36. Нивата на TCR са най -високи при NKT2 клетки, най -ниски при NKT1 клетки и междинни при NKT17 клетки. Освен това се съобщава, че тези разлики в нивата на експресия на TCR и по този начин предполагаемата сила на сигнализиране са основни за ангажирането и диференциацията на iNKT клетъчна подгрупа 37 – 39 . Въпреки това, повърхностният TCR не се различава значително между PIL Т-клетъчните подгрупи (Фиг.   4e), което предполага, че фактори, различни от нивото на експресия на TCR, могат да диктуват ангажираността и диференциацията на подмножеството в тези клетки.

Историческите проучвания в областта на iNKT клетъчната биология използват CD44 и NK1.1 като маркери за оценка на зрялост на iNKT клетки и етап на развитие 40 . С помощта на тези маркери е установено, че по -висок дял от PIL Т клетки е с ниска CD44 в сравнение с iNKT клетки, което показва по -малко зрял стадий (Фиг.   4f).

Фенотип на паметта CD8 Т-клетъчното развитие изисква ангажиране на CD4 ко-рецептор в PIL Т клетки

Както бе съобщено по-рано, честотата на CD8 SP Т клетките беше увеличена в тимуса на T-MHC II мишки (Фиг.   2b) 21, 22, 31. Показано е, че това е причинено от IL-4, продуциран от PIL Т клетки (наречени Т-CD4 клетки в този доклад), който медиира развитието на фенотип на паметта CD8 T (TДепутат) клетки чрез индуциране на еомезодермин (Eomes) 41 . По този начин голяма част от CD8 SP Т клетки в мишки T-MHC II експресират Eomes (Фиг.   5a) и имат фенотип на паметта 31. За наша изненада, няма увеличение на Eomes + CD8 TДепутат в мишки T-MHC I (Фиг.   5b). Тъй като взаимодействието на TCR с MHC II може да предизвика CD4 ко-рецепторно сигнализиране, ние разсъждавахме, че индуцирането на производството на IL-4 от PIL Т клетки и следователно увеличаването на CD8 TДепутат клетките могат да бъдат резултат от сигнализиране на ко-рецептор на CD4. За да тестваме тази хипотеза, кръстосвахме T-MHC I мишки с CD8.4 трансгенни мишки. При тези мишки цитоплазмената опашка на ендогенната Cd8a генът е заместен с цитоплазмената опашка на CD4 42. Трансгенът CD8.4 не е причинил увеличаване на общия брой на PIL T клетките в T-MHC I мишки (Фиг.   5c), но измести дела на PIL T клетките в полза на PLZF hi PIL2 клетки ( Фиг.   5d), които произвеждат IL-4. В съответствие с това броят на CD8 TДепутат е значително повишен при CD8.4 T-MHC I мишки (Фиг.  5e). Подобна тенденция се наблюдава и в далака (допълнителна фиг.   7). По този начин, конкретният ко-рецептор, участващ в засичането на МНС лиганди върху DP тимоцитите, влияе върху диференциацията на ефекторната подгрупа на PIL Т клетки и има вторични ефекти на CD8 TДепутат развитие.

а Представителни графики на поточна цитометрия на вътреклетъчно оцветяване за Eomes върху CD8 SP тимоцити от WT, T-MHC I и T-MHC II мишки. б Номер (нанесен на дясната ос) и честота (нанесен на лявата ос) на CD8 TДепутат клетки сред CD8 SP клетки в тимуса от WT, T-MHC I и T-MHC II мишки, дефинирани от стратегията за строене, показана в а. ° С Представителни графики на проточна цитометрия на тимоцити, сравняващи честотата на PIL Т-клетките от T-MHC I мишки с CD8.4 Tg/+  T-MHC I мишки. Показани са обобщени оценки за броя и честотата на PIL Т-клетките (два дясни панела). д Представителни графики за поточна цитометрия и обобщена оценка за честотата на PIL2 Т-клетъчна подгрупа сред тимоцити от T-MHC I и CD8.4 Tg/+  T-MHC I мишки. И двете групи се сравняват с WT мишки. д Примерни графики на поточна цитометрия на CD8 TДепутат клетъчна честота сред CD8 SP клетки в тимуса от T-MHC I мишки с CD8.4 Tg/+ T-MHC I мишки (ляво два панела) и обобщена оценка на CD8 TДепутат номер на клетка (десен панел). Всяка точка представлява едно животно: н =𠂙 животни на група (WT и T-MHC II групи) в а, б, н  = 𠂙 животни (група T-MHC I) в ° С, д, н  = 𠂗 животни (група T-MHC I) в б, д, и н  = 𠂔 животни (CD8.4 Tg/+ T-MHC I група) в ° Сд. Данните са представителни за 7 инча а, б и 2 инча ° Сд независими експерименти. Несдвоен двуопашен тест на Ман–Уитни беше извършен в бд ns, незначително (стр  ≥ 𠂐.05), *стр  < 𠂐.05, **стр  < 𠂐.01, и ****стр  < 𠂐.0001. Данните са представени като средни стойности   ±  SD. Изходните данни се предоставят като файл с изходни данни.

PIL Т клетките се конкурират с iNKT клетките за клетъчна ниша в тимуса

Подобно на това, което беше съобщено по-рано с T-MHC II мишка 43, наблюдавахме дву- до трикратно намаляване на броя на липидно-специфичните iNKT клетки при мишки с увеличен брой PIL Т клетки поради експресията на MHC I или MHC II върху DP тимоцити (фиг.   2b). Трябва да се отбележи, че общият общ брой клетки на PILs  + iNKT клетки не се различава значително между WT и T-MHC I мишки (данните не са показани). Тъй като и пептидните, и липидно-специфичните Т клетки изискват SAP сигнализиране от повърхностните SLAM семейни ко-рецептори, за да се развият съответно в PIL Т клетки или iNKT клетки, това предполага, че двата типа клетки могат да се конкурират помежду си за клетъчна ниша в рамките на тимуса. За по-нататъшно тестване на това понятие, ние изследвахме B6xBALB/c F1 мишки, които имат малко по-голяма (двойно) iNKT клетъчна ниша 32, 44. Ако подобна ниша регулира PIL T клетките, тогава може да очакваме повече PIL T клетки в F1 мишки. Всъщност, както частта, така и броят на PIL T клетките в мишки T-MHC I и T-MHC II са по-високи при животни на фона на F1 в сравнение с фона на В6 (фиг.   6a, b и допълнителна фиг. &# x000a0 8a, b) заключение за съществуване на по-голяма ниша за развитие на PIL Т-клетки на фона на F1. Наблюдавахме обратна връзка между броя на iNKT клетките и PIL Т клетките както при B6, така и при F1 мишки (фиг.   6c и допълнителна фиг.   8c). Взети заедно, с разширяването на PIL T клетки при мишки, които нямат iNKT клетки (Фиг.   3b), тези данни силно предполагат, че PIL T клетките и iNKT клетките се конкурират за една и съща клетъчна ниша. Освен това, докладваното изкривяване на iNKT клетки към PFZF hi NKT2 подмножество при F1 мишки 32 се наблюдава и в PIL Т клетки (Фиг.   6d и Допълнителна Фиг.   8d). Това предполага, че едни и същи фактори контролират наклонението на iNKT и PIL Т-клетъчната ефекторна подгрупа в различни щамове, които са по-вероятно да бъдат цитокини от околната среда, присъщи на клетките фактори или съвместно стимулиращи молекули, а не специфични авто-антигени.

а B6 WT, T-MHC I и T-MHC II мишки бяха кръстосани с BALB/c мишки и F1 поколение кучета (маркирани като F1, F1 T-MHC I и F1 T-MHC II) бяха анализирани чрез поточна цитометрия за честота на iNKT и PIL Т клетки в тимуса. б Обобщена оценка на честотата на iNKT и PIL Т-клетките (ляв панел) и брой (десен панел) от мишки WT, T-MHC I и T-MHC II на фон B6 и F1. ° С Обратна корелация между броя на iNKT клетките и броя на PIL T клетките в тимуса от WT (черни точки), T-MHC I (червени триъгълници) и T-MHC II мишки (сини обратни триъгълници) на В6 (ляв панел) и фон F1 (десен панел). д Показани са представителни графики на поточна цитометрия, сравняващи подмножествата на iNKT и PIL Т-клетки от WT, T-MHC I и T-MHC II мишки на фон В6 (горен ред) и F1 (долен ред). Всяка точка представлява едно животно: н  = � животни на група (WT и T-MHC I групи), н =𠂘 животни (T-MHC II група), н  = 𠂙 животни (F1 WT група), н =𠂖 животни (F1 T-MHC I група), и н =𠂗 животни (F1 T-MHC II група) в ад. Данните са представителни за седем независими експеримента. Несдвоен двуопашен тест на Ман–Уитни беше извършен в б ns, незначително (стр  ≥ 𠂐.05), ***стр <𠂐.001 и ****стр  < 𠂐.0001. Р 2 -стойности и стр-стойности в ° С бяха изчислени чрез поставяне на нелинейна регресия и извършване на тест за доброта на приспособяването и тест за допълнителна сума от квадрати F. Данните са представени като средни стойности   ±  SD. Изходните данни се предоставят като файл с изходни данни.


Стимулиране на мононуклеарни клетки на човешката периферна кръв

Човешки мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMCs) рутинно се изолират от кръвни проби и след това се използват в няколко области на изследване, включително автоимунни заболявания, инфекциозни заболявания, разработване на ваксини и рак. Анализът ELISpot следи ex vivo клетъчните имунни отговори на антигенни стимули. Тук използваме многомодов четец за изобразяване на клетки Agilent BioTek Cytation 7, съвместно с четец на микроплаки Agilent BioTek Gen5 и софтуер за изображения, за да определим количествено промените в цитокиновата секреция в РВМС, използвайки колориметричния формат за анализ ELISpot.

Въведение

Човешката периферна кръв мононуклеарни клетки (PBMCs) са диференциално стимулирани да секретират редица цитокини в резултат на рецепторно медиирана каскада на базата на клетъчния тип и стимулите. Отговорът на тази разнообразна група клетки към различни стимули предлага прозрения за тяхната роля в заболяването и развитието на методите на лечение.

PBMCs са периферни кръвни клетки, които имат кръгло ядро. 1 Тези клетки се състоят от лимфоцити (Т-, В- и NK-клетки), както и от моноцити. Други клетки на периферната кръв или нямат ядра (еритроцити и тромбоцити), или имат многоделни ядра (неутрофили, базофили и еозинофили). При хората лимфоцитите съставляват по -голямата част от популацията на РВМС, следвана от моноцити и само малък процент дендритни клетки. 2

Цитокините са протеини с ниско молекулно тегло или пептиди, секретирани от много типове клетки (особено клетки на имунната система), които регулират продължителността и интензивността на имунния отговор. Цитокиновият интерлевкин 2 (IL-2) е плейотропна клетъчна регулаторна молекула, която се произвежда от лимфоидни клетки в отговор на няколко стимула. Той играе роля в предотвратяването на автоимунни заболявания, като насърчава диференциацията на незрели Т клетки в регулаторни Т клетки. 3 В допълнение, IL-2 причинява диференциация на Т-клетки в ефекторни Т-клетки и Т-клетки от паметта, когато първоначалната Т-клетка е стимулирана от антиген. 4 Интерферон гама (IFN- и гама) е цитокин, критичен за вродения и адаптационен имунитет срещу инфекции. IFN-&gamma се произвежда предимно от естествени клетки убийци (NK) и естествени убийци (NKT) като част от вродения имунен отговор и от ефекторни Т клетки на цитотоксични Т лимфоцити (CTL), след като се развие антиген-специфичен имунитет. 5 Значението на IFN- & гама в имунната система произтича отчасти от способността му да инхибира директно вирусната репликация и от неговите имуностимулиращи и имуномодулиращи ефекти. Аберантната експресия на IFN-&gamma е свързана с редица автовъзпалителни и автоимунни заболявания.

Т-клетъчното активиране обикновено се инициира чрез взаимодействието на рецептора на клетъчната повърхност с неговата специфична молекула лиганд заедно с костимулираща молекула. 6 Това свързващо събитие предизвиква бързата хидролиза на инозитол фосфолипиди до диацилглицерол и инозитол фосфати чрез фосфолипаза С (PLC).

Диацилглицеролът е алостеричен активатор на протеин киназа С (ПКК). PKC активирането и инозитол фосфатите, които предизвикват освобождаване и мобилизиране на Ca 2+, водят до каскада от допълнителни клетъчни отговори, медииращи активирането на Т клетки (Фигура 1). Два от тези клетъчни отговори са производството и секрецията на IL-2 и INF-&gamma. Триптолидът е дитерпенов триепоксид, който е мощен имуносупресор и противовъзпалително (Фигура 2). Доказано е, че триптолидът инхибира експресията на IL-2 в активирани Т клетки на нивото на пуринова кутия/ядрен фактор и NF- & kappaB медиирано активиране на транскрипция. 7

Фигура 1. Схема на сигнална каскада за стимулиране на IL-2 и INF- & гама секрецията.

Фигура 2. Структура на триптолид.


Докато е известно, че някои PBMC произвеждат IL-2 и INF-&gamma, при нормални условия на растеж се произвежда малко. Само след стимулиране ще се експресират значителни количества от цитокините. 8 Фитохемаглутининът (PHA) е лектин, който се свързва със захарите върху гликозилирани повърхностни протеини, включително Т -клетъчния рецептор (TCR), и неспецифично ги свързва. Резултатът е ниско ниво на стимулация на сигналната каскада, необходима за IL-2 или INF- & гама секреция. 9 По същия начин, Phorbol myristate acetate (PMA) е малко органично съединение, което има структура, аналогична на диацилглицерол, която дифундира през клетъчната мембрана в цитоплазмата, където директно активира протеин киназа C (PKC). Когато се използва в комбинация с йономицин, калциев йонофор, който предизвиква освобождаване на калций, това води до умерено ниво на освобождаване на цитокини. Въпреки това, когато PMA и костимулатор, като PHA, стимулират PBMC клетки едновременно, производството на цитокини се засилва силно. 10

Процедурата за анализ на ELISpot е много подобна на тази на конвенционалния ELISA. Плаките първо се покриват със съответното улавящо антитяло. Култивирани секретиращи клетки се добавят към ямките заедно с всеки заинтересован експериментален митоген или антиген. Клетките се поддържат за период от време, след което се отстраняват. Секретираният аналит остава свързан с улавящите антитела в непосредствена близост до мястото на плочата, където се намира клетката, която произвежда аналита. След отстраняване на клетките и всякакви несвързани материали, се добавя антитяло за откриване (обикновено биотинилирано), последвано от ензимен конюгат с инкубация, за да се позволи свързване и промиване за отстраняване на несвързаните материали след всяка стъпка. Тъй като субстратът се превръща от конюгирания ензим в цветни съединения, се образуват петна по дъното на мембраната на плочата на местата на улавяне на оригиналния аналит. След това получените петна се анализират/преброяват с помощта на анализ на изображения. (Фигура 3).

Фигура 3. Процедура за оцветяване с ELISpot.

Експериментално

Колориметричен комплект за човешки IL-2 ELISpot е получен от U-CyTech biosciences (Утрехт, Холандия), а двуцветен човешки IFN-&gamma/IL-2 ELISpot комплект е от Cellular Technology Limited (Кливланд, Охайо). Phorbol 12-myristate (PMA) и триптолид (частен номер T3652) бяха закупени от Millipore-Sigma. Йономицин (номер на част 407952) е от EMD-Millipore. Човешки РВМС са получени от Astarte Biologicals (Bothell, WA). Бяла PVDP мембрана с 96 гнезда (номер на част MSIP4W10) са от Millipore-Sigma.

Клетъчна култура: Пречистените човешки РВМС се получават и се поддържат замразени до необходимост. След бързо размразяване клетките веднага се разреждат 1:10 в RPMI-1640 плюс 10% FBS, допълнен с 2 тМ глутамин, пеницилин и стрептомицин. Клетките се центрофугират при 300 g за 10 минути и супернатантата се отстранява. Клетките се ресуспендират в 10 ml пресни RPMI среди, преброяват се и се разреждат според нуждите, за да се осигури плътност 5 пъти по 104 клетки/ямка.

Покритие на плочата: За тези експерименти бяха използвани или човешки IL-2 ELISpot комплект от U-CyTech Biosciences, или 2-цветен човешки INF- & гама/IL-2 комплект от CTL. PVDF мембранните плочи първо се покриват с подходяща концентрация на улавящо антитяло (анти-IL-2 или анти-FTN- & гама) и се оставят да се абсорбират за една нощ при 4 ° С. Несвързаното антитяло се аспирира и плаката се промива ръчно 3 пъти с PBS. След това ямките се пълнят с блокиращ разтвор (200 µL) и се оставят да се инкубират за най-малко 1 час при стайна температура. Блокиращият буфер се аспирира без промиване непосредствено преди добавянето на клетки.

Клетъчно засяване: Освен ако не е посочено друго, клетките се поставят в 96-ямкови мембранни плаки, предварително покрити с антитяло при плътност 5 пъти 104 /ямка. РВМС бяха стимулирани да секретират IL-2 със смес от РМА (50 ng/mL), йономицин (1 µg/mL). Типичните експерименти използват обем от 100 & microL за клетки, последвано от добавяне на 100 & microL от стимулираща смес при 2x концентрация.

Триптолидно инхибиране: РВМС се посяват при 5 х 10 4/ямка в 50 µL обем пълна RPMI среда. След като се оставят клетките да се възстановят за 1 час при 37 ° С, във влажен 5% CO2 среда, третирането с триптолид беше добавено в пълна RPMI среда при 4х от крайната концентрация към всяка ямка в 50 µL. След това се добавя смес от стимули IL-2 (2x) в 100 µL за краен обем от 200 µL.

Едноцветен ELISpot анализ: Анализите бяха извършени съгласно инструкциите на комплекта U-Cytech BioSciences. След засяване, клетките се инкубират в продължение на 24 часа при 37 °C във овлажнен 5% CO2 среда и след това се анализира с помощта на ELISpot комплект. Накратко, клетките бяха отстранени чрез промиване 5 пъти с 250 & microL PBS-Tween 0,05% с помощта на многомодов дозатор Agilent BioTek MultiFlo FX. Към ямката се добавя биотинилирано детектиращо антитяло (100 & microL) и се оставя да се инкубира в продължение на 60 минути при 37 ° С или една нощ при 5 ° С, след което несвързаното откриващо антитяло се отстранява чрез промиване. След това се добавя конюгат стрептавидин-HRP (100 & microL) и се инкубира при 37 ° С в продължение на 60 минути. Отново несвързаният конюгат се отстранява чрез промиване. След това беше добавен двукомпонентен AEC субстрат, който отлага багрило върху дъното на мембраната на кладенчето. Реакциите се спират след 30 минути при стайна температура чрез промиване с дейонизирана вода (250 µL) 3 пъти с помощта на MultiFlo FX и се оставя да изсъхне на тъмно. След това бяха изобразени цели кладенци.

Двуцветна разработка на ELISpot: Анализите се извършват съгласно C.T. L. Immunospot 2-цветен комплект ELISpot инструкции. След засяване, клетките се инкубират в продължение на 24 часа при 37 °C във овлажнен 5% CO2 След това плочите за околната среда се анализират с помощта на комплект ELISpot. Накратко, клетките се отстраняват чрез промиване 5 пъти с 250 µL PBS-Tween 0,05% с помощта на мултимодов дозатор MultiFlo FX. Към ямката се добавя разтвор на откриващо антитяло (80 & microL/ямка) и се оставя да се инкубира при стайна температура (RT) за 120 минути, след което несвързаното детектиращо антитяло се отстранява чрез промиване. Добавя се третичен разтвор (80 & microL/ямка) и се оставя да се инкубира в продължение на 60 минути при RT. Нереагиралите реактиви бяха отстранени чрез промиване 2 пъти с PBS-Tween, последвано от 2 промивки с dH2O и след това се оставя да изсъхне на въздух на тъмно. След това се прибавя разтвор на синия проявител (80 µL/ямка) и се инкубира за 15 минути при стайна температура. Реакцията се спира чрез промиване 3 пъти с dH2След това се добавя О. Червен разтвор на проявител (80 µL/ямка) и се инкубира при стайна температура в продължение на 7 минути. Плаката се промива 3 пъти с dH2О. Плаката се суши на въздух на тъмно в продължение на поне 2 часа преди изобразяването.

Измиване на чинии

Плаките се промиват съгласно инструкциите на комплекта за анализ, като се използва дозатор за измиване MultiFlo (BioTek Instruments. Буферът за промиване се състои от PBS (NaCl 137 тМ, KCl 2.7 тМ, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 7.4 mM) допълнен с 0.05% Tween 20. Освен ако не е изрично посочено, плаките се промиват пет пъти с 250 µL буфер на ямка.

Изображение на плочи: Подготвените микроплаки бяха изобразени с помощта на многомодов четец за изображения на клетки Cytation, конфигуриран с вертикална цветна камера. Устройството за изображения използва бял LED източник на светлина във връзка с цветна цифрова камера. Серия от изображения бяха направени с 2x обектив, за да се изобрази цялата ямка в един кадър. След като фокалната равнина и експозицията на камерата бяха определени ръчно, изображенията бяха заснети автоматично, като се използва рутина с фиксирана фокусна височина, използвайки отразена светлина в Gen5.

Маса 1. Параметри за улавяне и предварителна обработка на изображения.

Таблица 2. Параметри за анализ на изображението.

Резултати и дискусия

Първоначалните експерименти демонстрират специфичността на ELISpot реакцията. PBMCs, които са били стимулирани с комбинация от PMA/йономицин, произвеждат множество петна, докато нестимулираните клетки произвеждат малко, ако има такива. Самото лечение без PBMC не води до никакви петна.

Фигура 4. Специфичност на IL-2 ELISpot реакцията. Изображения на ямки от ELISpot, съдържащи PBMCs, третирани със или без PMA (1 ng/mL), йономицин (1 & microg/mL). Отрицателен контрол, който няма клетки, но получи стимулант.


Правилното оразмеряване на идентифицираните обекти е необходимо за точно определяне. Целта на ELISpot анализа е да идентифицира и количествено определи броя на клетките, отговарящи на специфични стимули. Плаката, покрита с антитяло, улавя своята специфична цел, а не действителната секреторна клетка. Докато по -голямата част от секретирания аналит ще бъде уловен в областта, непосредствено заобикаляща позицията на клетката, част от аналита ще се разпръсне в средата и ще бъде уловен на друго място. Високата концентрация на аналита в близост до клетката ще доведе до петно ​​толкова голямо или по -голямо от физическия размер на клетката, докато диспергираният аналит ще доведе до много малки интензивни отлагания. Фигура 5 показва броя на петната, присъстващи в типична ELISpot ямка. Само петна, надвишаващи 25 & microm по размер, се обозначават като истински петна.

Фигура 5. Разпръскване на размер на обекта срещу червена плътност. Всички петна, постигащи зелен праг от 7000 по -голям, отколкото са нанесени спрямо техния обозначителен номер. Прагът на размера от 25 & microm е обозначен със синя вертикална линия.

Броят на записаните петна, произведени от стимулирани клетки, е пропорционален на броя на секретиращите клетки. Когато титруването на PBMCs са изложени на фиксирана концентрация на стимулант, броят на преброените петна е пропорционален на броя на клетките. Както е показано на Фигура 6, увеличаването на броя на клетките в ямка води до увеличаване на броените петна. Броят на клетките над 50 000 на ямка доведе до сливане на петна. Следващите експерименти използват 5000 клетки на ямка.

Фигура 6. Клетъчно титруване. РВМС се посяват в различни концентрации в ELISpot плоча и се стимулират с 50 ng/mL PMA, 1 µg/mL йономицин в продължение на 24 часа. След това плаката ELISpot се анализира за секреция на IL-2. Точките от данни представляват средната стойност от 8 определения.


Стимулирането на секрецията на IL-2 чрез смес от PMA и йономицин зависи от дозата. Както се вижда на Фигура 7, увеличаването на концентрацията на PMA произвежда повече петна.

Фигура 7. Титруване на PMA стимулира. РВМС (5000 клетки/ямка) бяха стимулирани с различни разреждания на РМА и 1µg/mL йономицин за 24 часа в ELISpot плака, покрита с IL-2 антитяло. След стимулация се оценява секрецията на IL-2 и се броят петна. Точките от данни представляват средната стойност от 7 определения.

Предварителното третиране на РВМС с триптолид за 1 час преди стимулация намалява секрецията на IL-2 по дозозависим начин. Както е показано на Фигура 8, увеличаването на концентрациите на триптолид води до по-малко петна, показателни за клетка, секретираща IL-2. В тези експерименти е използвана стимулираща доза, която е 80% от максималната. IC50 при тези условия се определя на 40 nM, което е подобно на докладите в литературата 8 .

Фигура 8. Инхибиране на секрецията на IL-2 чрез триптолид. PBMCs (5000 клетки/ямка) бяха предварително инкубирани за 60 минути с различни концентрации на триптолид, бяха стимулирани с 6 ng/mL PMA, 1 µg/mL йономицин, за да секретират IL-2. След 24 часа ELISpot плочката се анализира за секреция на IL-2. Данните представляват средната стойност на 7 точки от данни.

Налични са мултиплексни ELISpot анализи за количествено определяне на редица различни аналити едновременно. Въпреки че има няколко базирани на флуоресценция анализа, които предоставят информация за до 4 аналита в една ямка, колориметричните ELISpot анализи са ограничени до два аналита на ямка. Първоначалните експерименти с използване на двуцветен ELISpot, специфичен за човешки IL-2 и IFN-&gamma, демонстрираха специфичността на анализа за специфично идентифициране на IL-2 или IFN-&gamma секретиращи клетки. В този анализ клетките, секретиращи IL-2, могат да бъдат визуализирани чрез образуване на сини петна, докато тези, секретиращи IFN- & гама, образуват червени петна. Както се наблюдава в контролния експеримент (Фигура 9), ямките, покрити с анти-IL-2 антитела, образуват само сини петна, докато ямките, покрити само с анти-IFN- и гама антитела, образуват само червени петна. Ямките, получаващи и двете антитела за покритие, образуват както червени, така и сини петна, докато клетките без PBMC или PMA стимулация не успяват да образуват никакви петна.

Фигура 9. Специфика на откриването на ELISpot с два анализа. Изображения на кладенци с ELISpot, които имат PBMC, които са третирани със или без PMA (10 ng/mL). Мембраните на кладенчетата бяха покрити както с IL-2, така и с IFN- и гама-специфични антитела и цвят, разработен за IL-2 или IFN- & гама или и за двете. Отрицателен контрол, който няма клетки, но е получил стимулант.

Дискриминация между червени и сини петна може да се постигне, като се използват разликите в червената и синята плътност на петна. Графиките на хистограмата на Фигура 10 показват разлики в изчисленото съотношение на плътност червено/синьо между само червените и сините контролни кладенци. Средната стойност на съотношението червено/синьо плюс два пъти неговото стандартно отклонение може да се използва като горна граница за петна само с червени. По същия начин средната стойност минус две стандартни отклонения на контролите на сините петна определя долната граница на съотношението червено/синьо за сините петна. Петна със стойности на съотношение между тези два прага се считат за сини и червени.

Фигура 10. Анализ на честотна хистограма на стойностите на съотношението на интензитета на червено-синьо ELISpot. Честотата на стойностите на съотношението червено-синьо от 8 само червени и само сини контролни ямки. Посочени са средното и средното плюс или минус 2 пъти стандартното отклонение на популацията.

Тези прагови стойности могат да се използват за количествено определяне на единични цветни реакции, когато се развиват само IL-2 или IFN- и гама реакции. Както е показано на Фигура 11, и IL-2, и IFN- & гама цитокините се секретират, когато РВМС се стимулират с РМА. Стимулацията се осъществява по начин, зависим от концентрацията с EC50 стойностите са много сходни (ЕО50= 0,05 ng/mL). Интересно е, че два пъти повече PBMCs, измерени чрез броя на точките, вероятно ще секретират IFN-&gamma в сравнение с IL-2.

Фигура 11. Сравнение на IL-2 и IFN- & гама секрецията от РВМС след стимулация с РМА. PBMCs бяха стимулирани с PMA в PVDF мембранна ELISpot плака, покрита както с IL-2, така и с IFN-&gamma улавящи антитела. След 24 часа плочите бяха обработени и цветовете бяха разработени в паралелни ямки. Петната (червено и синьо) бяха количествено определени и нанесени като функция от концентрацията на PMA. Данните представляват средното и стандартното отклонение на дублиращите кладенци.

Мултиплексният, двуцветен анализ в една и съща ямка може да се извърши, когато и двата цвята са разработени по едни и същи критерии. Честотна хистограма на данните от няколко отделни ямки, където и двата цвята са разработени в кладенците, е изобразена на Фигура 12. Когато изображенията се изследват с око, повечето петна в кладенците имат петна, които са видимо или червени или сини, с по -малък процент, който изглежда смес. Тези наблюдения се потвърждават от честотната хистограма, изобразена на фигура 12, която показва, че идентифицираните петна имат спектър от стойности на съотношение червено/синьо.Има два очевидни пика, базирани на съотношението червено/синьо, които съответстват на червените и сините петна, наблюдавани, когато е развит само един цвят. Между съответните им гранични стойности има значителен брой петна, които имат междинно съотношение червено/синьо.

Фигура 12. Честотна хистограма на стойностите на съотношението червено-синьо на ELISpot. Съотношението червено-синьо на ELISpot петна от 8 ямки на двуцветна ELISpot плоча за анализ се начертава като функция на честотата. Анализът на субпопулациите, основан на отсечени стойности за червени, сини или червени и сини петна, се обозначава с цвят.

Те видимо съответстват на петна, които изглеждат лилави (т.е. смес от червено и синьо). Относителният брой петна, идентифицирани като червени или сини, е подобен на числата, идентифицирани, когато е разработен един цвят. Когато човек анализира данните с график на разсейване, който сравнява съотношението червено/синьо с размера на петното, се наблюдават два хлабави клъстера от петна, които съответстват на червени или сини петна, заедно с редица междинни съотношения (Фигура 13). Докато и трите подпопулации на петна имат еднакъв диапазон по размер, червените петна са по -многобройни и по -малки по размер от петна, идентифицирани като сини.

Фигура 13. Диаграма на разсейване на стойностите на ELISpot червено-синьото съотношение. Redblue съотношението на ELISpot петна от 8 ямки на двуцветна ELISpot тестова плака се нанася като функция на размера. Посочени са анализи на субпопулации въз основа на граничните стойности за червени, сини или червени и сини петна.

Този мултиплекс анализ може да се използва върху отделни кладенци с различни експериментални условия. Фигура 14 демонстрира реакцията на PBMCs към стимулиране на РМА, където както сините (IL-2), така и червените (IFN- & гама) цветове се развиват в една и съща ямка. Както при отделното развитие на цвета, PMA стимулира секрецията на цитокини върху PBMCs по начин, зависим от концентрацията. Също така, повече PBMCs секретират IFN- & гама, отколкото IL-2, с еквивалентна EC50 стойности. Ако сравним общия брой клетки, които секретират IFN- и гама (само червени петна плюс червени и сини петна) или общия брой клетки, които секретират IL-2 (само сини петна плюс червени и сини петна), номерата са в съответствие с ямките където е разработен само един цвят.

Фигура 14. Сравнение на IL-2 и IFN- & гама секрецията в стимулирани РВМС. PBMCs бяха стимулирани с различни концентрации на PMA, използвайки PVDF мембранна 96-ямкова плака, която беше предварително покрита както с анти-IL-2, така и с анти-IFN- и гама антитела. След обработка с ELISpot, ямките на плаките бяха изобразени и изображенията бяха анализирани с помощта на Gen5. Анализът на субпопулацията дефинира петна, които са или червени, сини или смесица от червено и синьо. Броят на всяка субпопулация на петна е начертан спрямо концентрацията на PMA. Данните представляват средната стойност и стандартното отклонение на 4 определения.

Дискусия

Тези данни демонстрират полезността на многомодовия четец за изобразяване на клетки Agilent BioTek Cytation 7, съвместно с четеца на микроплаки Agilent BioTek Gen5 и софтуера за изобразяване на изображения за анализ и анализ на колориметрични тестове за PVDF ELISpot. Доказано е, че комбинацията от РМА/йономицин значително стимулира секрецията на IL-2 в РВМС. Без стимулация, IL-2 практически липсва. Способността на триптолида, известен инхибитор на транскрипцията, да предотвратява секрецията на IL-2 предполага, че е необходим нов протеинов синтез след стимулация. 11

ELISpot е чувствителен анализ за наблюдение на ex vivo клетъчния имунен отговор на ниво единична клетка чрез откриване на секретирани протеини, освободени от клетките. Тази техника е получена от сандвич-ензимния имуносорбентен анализ (ELISA), за да се приспособи използването на цели клетки за идентифициране на честотата на секретиращите клетки. Като такива, има редица критични параметри, които трябва да бъдат оптимизирани, за да бъдат експериментите успешни. В зависимост от степента на клетъчна секреция, развитите петна могат да бъдат доста големи. Очакваният брой положителни клетки е от по-голямо значение от общия брой клетки, използвани първоначално. Наличието на твърде много секретиращи клетки води до сливане на отделните петна, което затруднява численото определяне. Например, изследване на сравнително рядко секретиращо събитие би изисквало по -голям брой клетки да бъдат засети в сравнение с по -често срещано събитие. Времето на отговора спрямо стимулацията и/или инхибирането е важно. Събитията, медиирани от рецептора, често отнемат повече време, за да предизвикат отговор, отколкото стимулиращата молекула, която може да взаимодейства директно в клетката. Важно е да се използва подходящ интервал между стимулацията и измерването. Тестването на инхибитори все още изисква наличието на стимулиращ агент. При тези експерименти е важно да се използва по-ниска от максималната концентрация на стимулиращия агент, за да не се маскира всякакви инхибиторни ефекти.

Cytation 7 е идеална платформа за интерпретация на колориметрични PVDF мембранни ELISpot анализи. Устройството за изображения поддържа цифрово цветно изображение отгоре надолу с 2x, 4x и 8x обективи за микроскоп, които са фабрично инсталирани. Обективът 2x може да заснеме цялата ямка в едно изображение, което я прави идеална за определяне на 96-ямков ELISpot. Ако желаете, по -висока разделителна способност може да бъде получена чрез използване на обектив с по -голямо увеличение и монтаж на кладенеца. С помощта на тази камера както отразената, така и пропускащата светлина може да се използва за оптимално изображение. Докато това изследване използваше само изправена камера отгоре надолу с мембранни плочи PVDF, изображението също така поддържа изобразяване на ярко поле, използвайки обърната камера за ELISpot тестове със сребърно петно. В допълнение, обърнатият микроскоп поддържа флуоресцентна микроскопия с LED и филтърни кубчета. Софтуерът за четене на микроплаки и имиджър от Gen5, освен че контролира функцията на четеца, може да се използва за автоматично извършване на шев на отделни плочки с монтажно изображение, извършване на изваждане на фона и маскиране на региони извън кладенеца преди анализ.