Информация

6.6: Как асексуалните прокариоти постигат генетично разнообразие - Биология

6.6: Как асексуалните прокариоти постигат генетично разнообразие - Биология


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Цели на обучението

  • Сравнете процесите на трансформация, трансдукция и конюгиране
  • Обяснете как асексуалният трансфер на гени води до прокариотно генетично разнообразие
  • Обяснете структурата и последствията за бактериалното генетично разнообразие на транспозоните

Обикновено, когато разглеждаме генетичен трансфер, ние мислим за вертикален трансфер на гени, предаване на генетична информация от поколение на поколение. Вертикалният трансфер на гени е далеч основният начин за предаване на генетична информация във всички клетки. При сексуално възпроизвеждащите се организми, събитията на кръстосване и независим асортимент от отделни хромозоми по време на мейоза допринасят за генетичното разнообразие в популацията. Генетичното разнообразие се въвежда и по време на половото размножаване, когато генетичната информация от двама родители, всеки с различни комплекти от генетична информация, се комбинира, създавайки нови комбинации от родителски генотипове в диплоидното потомство. Появата на мутации също допринася за генетичното разнообразие в популацията. Генетичното разнообразие на потомството е полезно в променяща се или непоследователна среда и може да бъде една от причините за еволюционния успех на сексуалното размножаване.

Когато прокариотите и еукариотите се възпроизвеждат асексуално, те пренасят почти идентично копие на своя генетичен материал на потомството си чрез вертикален генен трансфер. Въпреки че асексуалното размножаване дава по -бързо потомство, всички ползи от разнообразието между тези потомци се губят. Как тогава организмите, чийто доминиращ начин на размножаване е асексуален, създават генетично разнообразие? При прокариотите хоризонталният трансфер на гени (HGT), въвеждането на генетичен материал от един организъм в друг организъм в рамките на едно и също поколение, е важен начин за въвеждане на генетично разнообразие. HGT позволява дори на отдалечени видове да споделят гени, влияейки върху техните фенотипове. Смята се, че HGT е по -разпространен при прокариотите, но че само малка част от прокариотния геном може да бъде прехвърлена чрез този тип трансфер по всяко време. Тъй като явлението се изследва по-задълбочено, може да се окаже, че е още по-често срещано. Много учени смятат, че HGT и мутацията са значителни източници на генетични вариации, суровина за процеса на естествен подбор, в прокариотите. Въпреки че HGT е по-често срещан сред еволюционно свързани организми, той може да се появи между всеки два вида, които живеят заедно в естествена общност.

Известно е, че HGT в прокариотите се появява чрез трите основни механизма, които са илюстрирани на Фигура ( PageIndex {1} ):

  1. Трансформация: голата ДНК се поема от околната среда
  2. Трансдукция: гените се прехвърлят между клетките във вирус
  3. Конюгиране: използване на куха тръба, наречена конюгационен пил, за прехвърляне на гени между клетките

Упражнение (PageIndex{1})

  1. Какви са три начина, по които сексуалното размножаване въвежда генетични вариации в потомството?
  2. Каква е ползата от асексуалното размножаване?
  3. Какви са трите механизма на хоризонтален трансфер на гени при прокариотите?

Трансформация

Фредерик Грифит е първият, който демонстрира процеса на трансформация. През 1928 г. той показа, че жив, непатогенен пневмокок бактериите могат да се трансформират в патогенни бактерии чрез излагане на термично убит патогенен щам. Той заключава, че някакъв агент, който той нарича „трансформиращ принцип“, е бил предаден от мъртвите патогенни бактерии към живите, непатогенни бактерии. През 1944 г. Осуалд ​​Ейвъри (1877–1955), Колин Маклауд (1909–1972) и Маклин Маккарти (1911–2005) демонстрират, че трансформиращият принцип е ДНК.

При трансформацията прокариотът поема гола ДНК, открита в околната среда, която е получена от други клетки, които лизират при смъртта и освобождават съдържанието си, включително техния геном, в околната среда. Много бактерии са естествено компетентни, което означава, че те активно се свързват с ДНК на околната среда, транспортират я през клетъчните си обвивки в цитоплазмата си и я правят едноверижна. Обикновено двуверижната чужда ДНК в клетките се разрушава от нуклеази като защита срещу вирусна инфекция. Въпреки това, тези нуклеази обикновено са неефективни срещу едноверижна ДНК, така че тази едноверижна ДНК в клетката има възможност да се рекомбинира в бактериалния геном. Молекула на ДНК, която съдържа фрагменти от ДНК от различни организми, се нарича рекомбинантна ДНК. Ако бактерията включи новата ДНК в собствения си геном чрез рекомбинация, бактериалната клетка може да придобие нови фенотипни свойства. Например, ако непатогенна бактерия поеме ДНК за токсинен ген от патоген и след това го включи в своята хромозома, тя също може да стане патогенна. Плазмидната ДНК може също да бъде поета от компетентни бактерии и да придаде нови свойства на клетката. Като цяло трансформацията в природата е относително неефективен процес, тъй като нивата на ДНК в околната среда са ниски поради активността на нуклеази, които също се освобождават по време на клетъчен лизис. Освен това генетичната рекомбинация е неефективна при включването на нови ДНК последователности в генома.

В природата бактериалната трансформация е важен механизъм за придобиване на генетични елементи, кодиращи фактори на вирулентност и антибиотична резистентност. Доказано е, че гените, кодиращи резистентност към антимикробни съединения, са широко разпространени в природата, дори в среди, които не са повлияни от хората. Тези гени, които позволяват на микробите, живеещи в смесени общности, да се конкурират за ограничени ресурси, могат да бъдат прехвърлени в популацията чрез трансформация, както и чрез други процеси на HGT. В лабораторията можем да използваме естествения процес на бактериална трансформация за генно инженерство, за да направим голямо разнообразие от лекарствени продукти, както е обсъдено в глава 10.

Упражнение (PageIndex{2})

Защо бактериалната клетка прави ДНК на околната среда, внесена в клетката, в едноверижна форма?

Трансдукция

Вирусите, които заразяват бактериите (бактериофаги), могат също да преместят къси парчета хромозомна ДНК от една бактерия в друга в процес, наречен трансдукция (вижте глава 9 за повече подробности). При генерализирана трансдукция, всяко парче хромозомна ДНК може да бъде прехвърлено в нова клетка гостоприемник чрез случайно опаковане на хромозомна ДНК в фагова глава по време на фагово сглобяване. За разлика от тях, специализираната трансдукция е резултат от неточното изрязване на вграден (лизогенен) профаг от бактериалната хромозома, така че той носи със себе си парче от бактериалната хромозома от двете страни на мястото на интеграция на фага към нова клетка-гостоприемник. В резултат на това хостът може да придобие нови свойства. Този процес се нарича лизогенна конверсия. От медицинско значение, лизогенен фаг може да носи със себе си ген на вирулентност към новия си гостоприемник. Веднъж поставен в хромозомата на новия гостоприемник, новият гостоприемник може да придобие патогенност. Няколко патогенни бактерии, включително Corynebacterium diphtheriae (причинителят на дифтерия) и Clostridium botulinum (причинителят на ботулизма), са вирулентни поради въвеждането на гени, кодиращи токсини от лизогенни бактериофаги, потвърждавайки клиничното значение на трансдукцията в обмена на гени, участващи в инфекциозно заболяване. Археите имат свои собствени вируси, които пренасят генетичен материал от един индивид в друг.

Упражнение ( PageIndex {3} )

  1. Какво е агент на трансдукция на прокариотни клетки?
  2. При специализирана трансдукция, откъде идва трансдуциращото парче ДНК?

Клиничните последици от трансдукцията

Пол, 23-годишен помощник от Атланта, пътува до Хаити през 2011 г., за да предостави помощ след земетресението през 2010 г. След като работи там няколко седмици, той изведнъж започва да изпитва коремен дистрес, включително тежки спазми, гадене, повръщане и водниста диария. Той също така започна да изпитва интензивни мускулни крампи. В местна клиника лекарят заподозря, че симптомите на Пол са причинени от холера, тъй като след земетресението е имало избухване на холера. Тъй като холерата се предава по фекално-орален път, нарушения в санитарната инфраструктура, каквито често се случват след природни бедствия, могат да предизвикат огнища. Лекарят потвърди предполагаемата диагноза с помощта на тест за измерване на холера. След това той предписва на Пол еднократна доза доксициклин, както и соли за орална рехидратация, като го инструктира да пие значителни количества чиста вода.

Холерата се причинява от грам-отрицателна извита пръчка Вибрион холера (Фигура ( PageIndex {2} )). Неговите симптоми до голяма степен са резултат от производството на холерния токсин (СТ), който в крайна сметка активира хлориден транспортер за изпомпване на хлоридни йони от епителните клетки в лумена на червата. След това водата следва хлоридните йони, причинявайки плодовита водниста диария, характерна за холерата. Генът, кодиращ холерен токсин, е включен в бактериалната хромозома на V. холера чрез инфекция на бактерията с лизогенния нишковиден CTX фаг, който носи CT гена и го въвежда в хромозомата при интегриране на профага. По този начин патогенните щамове на V. холера резултат от хоризонтален генен трансфер чрез специализирана трансдукция.

Упражнение (PageIndex{4})

  1. Защо огнища на холера са по-чести в резултат на природно бедствие?
  2. Защо мускулните спазми са често срещан симптом на холера? Защо лечението с орални соли за рехидратация е толкова важно за лечението на холера?
  3. В области, засегнати от холера, какви са някои стратегии, които хората биха могли да използват, за да предотвратят предаването на болести?

Спиране

В конюгация, ДНК се прехвърля директно от един прокариот в друг посредством конюгиращ пилус, който привежда организмите в контакт един с друг. В E. coli, гените, кодиращи способността за конюгиране, са разположени върху бактериален плазмид, наречен F плазмид, известен също като фактор на плодовитостта, а конюгиращият пилус се нарича F pilus. F-плазмидните гени кодират както протеините, съставляващи F pilus, така и тези, които участват в репликацията на плазмида с въртящ се кръг. Клетките, съдържащи F плазмида, способни да образуват F pilus, се наричат ​​F+ клетки или клетки донори, а тези, които нямат F плазмид, се наричат ​​F клетки или клетки реципиенти.

Конюгация на F плазмид

По време на типичното спрежение в E. coli, F пилусът на F+ клетка влиза в контакт с F клетка и се прибира, привеждайки двата клетъчни плика в контакт (Фигура ( PageIndex {3} )). След това се образува цитоплазмен мост между двете клетки на мястото на конюгиращия пилус. Тъй като репликацията на подвижния кръг на F плазмида се случва във F+ клетка, едноверижно копие на F плазмида се прехвърля през цитоплазмения мост към F клетка, която след това синтезира комплементарната верига, което я прави двойно верига. Ф клетката сега става F+ клетка, способна да направи свой собствен конюгационен пилус. В крайна сметка в смесена бактериална популация, съдържаща и F+ и F. клетки, всички клетки ще станат F+ клетки. Гени на E. coli F плазмидът също кодира протеини, предотвратяващи конюгацията между F+ клетки.

Конюгиране на F' и Hfr клетки

Въпреки че типичното спрежение в E. coli води до трансфер само на F плазмидна ДНК, конюгацията може също да пренесе хромозомна ДНК. Това е така, защото F плазмидът понякога се интегрира в бактериалната хромозома чрез рекомбинация между плазмида и хромозомата, образувайки Hfr клетка (Фигура ( PageIndex {4} )). „Hfr“ се отнася до високата честота на рекомбинация, наблюдавана, когато получателят F клетките получават генетична информация от Hfr клетки чрез конюгиране. Подобно на неточното изрязване на профаг по време на специализирана трансдукция, интегрираният F плазмид може също така да бъде изрязан неточно от хромозомата, произвеждайки F 'плазмид, който носи със себе си някаква хромозомна ДНК, съседна на мястото на интеграция. При конюгиране тази ДНК се въвежда в клетката реципиент и може или да се поддържа като част от F' плазмида, или да бъде рекомбинирана в бактериалната хромозома на реципиентната клетка.

Hfr клетките също могат да третират бактериалната хромозома като огромен F плазмид и да се опитат да прехвърлят копие от нея на реципиент F клетка. Тъй като бактериалната хромозома е толкова голяма, прехвърлянето на цялата хромозома отнема много време (Фигура (PageIndex{5})). Въпреки това, контактът между бактериалните клетки по време на конюгиране е преходен, така че е необичайно цялата хромозома да бъде прехвърлена. Хромозомната ДНК на гостоприемника в близост до мястото на интегриране на F плазмида е по -вероятно да бъде прехвърлена и рекомбинирана в хромозомата на реципиентната клетка, отколкото гените гостоприемници по -далеч.

Последици и приложения на конюгацията

Плазмидите са важен тип екстрахромозомен (незадължителен) ДНК елемент в бактериите и в клетките, които ги съдържат, се считат за част от бактериалния геном. От клинична гледна точка, плазмидите често кодират гени, участващи във вирулентността. Например, гени, кодиращи протеини, които правят бактериална клетка резистентна към определен антибиотик, са кодирани върху R плазмиди. R плазмидите, в допълнение към техните гени за антимикробна резистентност, съдържат гени, които контролират конюгацията и трансфера на плазмида. R плазмидите са в състояние да се прехвърлят между клетки от същия вид и между клетки от различни видове. Единични R плазмиди обикновено съдържат множество гени, придаващи резистентност към множество антибиотици.

Гени, необходими за производството на различни токсини и молекули, важни за колонизацията по време на инфекция, също могат да бъдат открити кодирани върху плазмиди. Например, продуциращи веротоксин щамове на E. coli (VTEC) изглежда е придобил гените, кодиращи токсина Shiga от неговия грам-отрицателен роднина Шигела дизентерия чрез придобиването на голям плазмид, кодиращ този токсин. VTEC причинява тежка диария, която може да доведе до хемолитично-уремичен синдром (HUS), което може да доведе до бъбречна недостатъчност и смърт.

В неклинични условия бактериалните гени, които кодират метаболитни ензими, необходими за разграждането на специализирани атипични съединения като полициклични ароматни въглеводороди (ПАВ), също често се кодират върху плазмиди. Освен това, някои плазмиди имат способността да преминават от бактериални клетки към други типове клетки, като тези на растения и животни, чрез механизми, различни от конюгирането. Такива механизми и тяхното използване в генното инженерство са разгледани в глава 10.

Упражнение ( PageIndex {5} )

  1. Какъв тип репликация се случва по време на конюгацията?
  2. Какво се случва, за да се получи Hfr E. coli клетка?
  3. Какви черти са кодирани върху плазмидите?

Транспониране

Генетичните елементи, наречени транспозони (транспонируеми елементи) или „скачащи гени“, са молекули на ДНК, които включват специални обърнати повтарящи се последователности в техните краища и ген, кодиращ ензима транспозаза (Фигура (PageIndex{5})). Транспозоните позволяват на цялата последователност да се изрязва независимо от едно място в ДНК молекула и да се интегрира в ДНК другаде чрез процес, наречен транспониране. Транспозоните първоначално са били открити в царевица (царевица) от американския генетик Барбара Макклинток (1902–1992) през 40 -те години. Оттогава транспозони са открити във всички видове организми, както в прокариоти, така и в еукариоти. По този начин, за разлика от трите предишни дискутирани механизма, транспонирането не е специфично за прокариотите. Повечето транспозони са нерепликативни, което означава, че се движат по начин на „изрязване и поставяне“. Някои обаче могат да се възпроизвеждат, запазвайки местоположението си в ДНК, докато правят копие, което да бъде вмъкнато на друго място („копиране и поставяне“). Тъй като транспозоните могат да се движат в рамките на ДНК молекула, от една молекула ДНК в друга или дори от една клетка в друга, те имат способността да въвеждат генетично разнообразие. Движението в рамките на една и съща ДНК молекула може да промени фенотипа чрез инактивиране или активиране на ген.

Транспозоните също могат да носят със себе си допълнителни гени, премествайки тези гени от едно място на друго с тях. Например, бактериалните транспозони могат да преместят гени за резистентност към антибиотици, премествайки ги от хромозоми към плазмиди. Доказано е, че този механизъм е отговорен за съвместната локализация на множество гени за антибиотична резистентност върху един R плазмид в Шигела щамове, причиняващи бактериална дизентерия. След това такъв R плазмид може лесно да бъде прехвърлен между бактериална популация чрез процеса на конюгиране.

Упражнение ( PageIndex {6} )

Какви са два начина, по които транспозонът може да повлияе на фенотипа на клетката, в която се премества?

Таблица ( PageIndex {1} ) обобщава процесите, обсъдени в този раздел.

Таблица ( PageIndex {1} ): Обобщение на механизмите на генетичното разнообразие при прокариотите
СрокОпределение
СпиранеТрансфер на ДНК чрез директен контакт с помощта на конюгационен пилус
ТрансдукцияМеханизъм на хоризонтален трансфер на гени при бактерии, при който гените се пренасят чрез вирусна инфекция
ТрансформацияМеханизъм на хоризонтален трансфер на гени, при който голата околна ДНК се поема от бактериална клетка
ТранспониранеПроцес, при който ДНК се отделя независимо от едно място в ДНК молекула и се интегрира другаде

Клиничен фокус: Резолюция

В рамките на 24 часа резултатите от диагностичния анализ на пробата от изпражненията на Алекс показват, че тя е положителна за топлинно лабилния ентеротоксин (LT), термостабилен ентеротоксин (ST) и колонизационен фактор (CF), потвърждавайки подозрението на болничния лекар за ETEC. По време на проследяване със семейния лекар на Алекс, този лекар отбеляза, че симптомите на Алекс не отшумяват бързо и той изпитва дискомфорт, който му пречи да се върне в часовете. Семейният лекар предписва на Алекс курс с ципрофлоксацин, за да облекчи симптомите му. За щастие, ципрофлоксацин разреши симптомите на Алекс в рамките на няколко дни.

Алекс вероятно е получил инфекцията си от поглъщане на заразена храна или вода. Новите индустриализирани страни като Мексико все още развиват санитарни практики, които предотвратяват замърсяването на водата с фекални материали. Пътуващите в такива страни трябва да избягват поглъщането на недостатъчно обработени храни, особено месо, морски дарове, зеленчуци и непастьоризирани млечни продукти. Те също така трябва да избягват използването на вода, която не е пречистена; това включва питейна вода, кубчета лед и дори вода, използвана за миене на зъби. Използването на бутилирана вода за тези цели е добра алтернатива. Добрата хигиена (измиване на ръцете) също може да помогне за предотвратяване на ETEC инфекция.Алекс не беше внимателен с консумацията на храна или вода, което доведе до заболяването му.

Симптомите на Алекс бяха много сходни с тези на холера, причинени от грам-отрицателната бактерия Вибрион холера, който също произвежда токсин, подобен на ST и LT. В някакъв момент от еволюционната история на ETEC, непатогенен щам на E. coli подобни на тези, които обикновено се намират в червата, може да са придобили гените, кодиращи ST и LT токсините от V. холера. Фактът, че гените, кодиращи тези токсини, са кодирани върху екстрахромозомни плазмиди в ETEC, подкрепя идеята, че тези гени са придобити от E. coli и вероятно се поддържат в бактериални популации чрез хоризонтален генен трансфер.

Основни концепции и обобщение

  • Хоризонтален трансфер на гени е важен начин за безполово възпроизвеждащи се организми като прокариотите да придобият нови черти.
  • Има три механизма на хоризонтален трансфер на гени, които обикновено се използват от бактериите: трансформация, трансдукция, и спрежение.
  • Трансформацията позволява на компетентните клетки да поемат гола ДНК, освободена от други клетки при тяхната смърт, в тяхната цитоплазма, където тя може да се рекомбинира с генома на гостоприемника.
  • В генерализирана трансдукция, всяка част от хромозомната ДНК може да бъде прехвърлена чрез случайно опаковане на разградената хромозома гостоприемник във фагова глава. В специализирана трансдукция, само хромозомна ДНК, съседна на мястото на интегриране на лизогенен фаг, може да бъде прехвърлена в резултат на неточно изрязване на профага.
  • Спрягането се осъществява чрез F плазмид, който кодира a конюгационен пил което носи F-съдържащ плазмид F+ клетка в контакт с an F- клетка.
  • Рядкото интегриране на F плазмида в бактериалната хромозома, генериращо an Hfr клетка, позволява прехвърляне на хромозомна ДНК от донора към реципиента. Освен това, неточното изрязване на F плазмида от хромозомата може да генерира F 'плазмид, който може да бъде прехвърлен към реципиент чрез конюгация.
  • Прехвърляне на спрежение на R плазмиди е важен механизъм за разпространение на антибиотична резистентност в бактериални общности.
  • Транспозони са молекули на ДНК с обърнати повторения в краищата си, които също кодират ензимната транспозаза, което позволява тяхното движение от едно място в ДНК до друго. Въпреки че се откриват както при прокариоти, така и при еукариоти, транспозоните са клинично значими при бактериални патогени за движението на вирулентни фактори, включително гени за резистентност към антибиотици.

Размножаването при Прокариотите

Възпроизвеждането е асексуален и обикновено се осъществява чрез бинарно делене. Вместо това прокариотите не се подлагат на митоза, хромозомата се репликира и двете получени копия се отделят една от друга, поради растежа на клетката. Прокариотът, сега увеличен, е притиснат навътре в екватора си и двете произтичащи клетки, които са клонинги, отделно. Бинарното делене не предоставя възможност за генетична рекомбинация или генетично разнообразие, но прокариотите могат да споделят гени чрез три други механизма.

При трансформацията прокариотът приема ДНК, отделена от други прокариоти, в своята среда. Ако непатогенна бактерия поеме ДНК за токсинен ген от патоген и включи новата ДНК в собствената си хромозома, тя също може да стане патогенна. При трансдукцията бактериофагите, вирусите, които заразяват бактериите, могат да преместват къси парчета хромозомна ДНК от една бактерия в друга. Трансдукцията води до a рекомбинантен организъм. Археите също имат вируси, които могат да преместват генетичен материал от един индивид на друг. В конюгация, ДНК се прехвърля от един прокариот в друг посредством a pilus, който привежда организмите в контакт един с друг и осигурява канал за пренос на ДНК. Прехвърлената ДНК може да бъде под формата на плазмид или като съставна молекула, съдържаща както плазмидна, така и хромозомна ДНК.

Възпроизвеждането може да бъде много бързо: няколко минути за някои видове. Това кратко време на генериране, съчетано с механизми на генетична рекомбинация и високи нива на мутация, води до бързото развитие на прокариотите, което им позволява да реагират на промените в околната среда (като въвеждането на антибиотик) много бързо.


12.1 Микробите и инструментите на генното инженерство

Кайла, 24-годишен електроинженер и ентусиаст по бягане, току-що се премести от Аризона в Ню Хемпшир, за да поеме нова работа. В почивните си дни тя обича да изследва новата си среда, като ходи на дълги разстояния в боровите гори. През юли тя прекара една седмица в поход през планината. В началото на август Кайла получи ниска температура, главоболие и леки мускулни болки и се почувства малко уморена. Без да се замисля много за това, тя взе малко ибупрофен, за да се справи със симптомите си и се закле да си почине повече.

Преминете към следващото поле за клиничен фокус.

Науката за използването на живи системи в полза на човечеството се нарича биотехнология. Технически погледнато, опитомяването на растения и животни чрез земеделски и развъдни практики е вид биотехнология. Въпреки това, в съвременен смисъл, ние свързваме биотехнологията с директната промяна на генетиката на организма, за да постигнем желаните черти чрез процеса на генно инженерство. Генното инженерство включва използването на рекомбинантна ДНК технология, процес, чрез който се манипулира ДНК последователност инвитро, по този начин се създава рекомбинантна ДНК молекула с които имат нови комбинации от генетичен материал. След това рекомбинантната ДНК се въвежда в организма -гостоприемник. Ако въведената ДНК идва от различен вид, сега организмът гостоприемник се счита за трансгенен.

Един пример за трансгенен микроорганизъм е бактериалният щам, който произвежда човешки инсулин (Фигура 12.2). Инсулиновият ген от хора се вкарва в плазмид. Този рекомбинантен ДНК плазмид след това се вмъква в бактерии. В резултат на това тези трансгенни микроби са в състояние да произвеждат и секретират човешки инсулин. Много прокариоти са в състояние да придобият чужда ДНК и да включат функционални гени в собствения си геном чрез „чифтосване“ с други клетки (конюгация), вирусна инфекция (трансдукция) и поемане на ДНК от околната среда (трансформация). Припомнете си, че тези механизми са примери за хоризонтален трансфер на гени — трансфер на генетичен материал между клетки от едно и също поколение.

Молекулярно клониране

Хърбърт Бойер и Стенли Коен за първи път демонстрират пълния процес на молекулярно клониране през 1973 г., когато успешно клонират гени от африканската нокътна жаба ( Xenopus laevis ) в бактериален плазмид, който след това е въведен в бактериалния гостоприемник Ешерихия коли . Молекулярното клониране е набор от методи, използвани за конструиране на рекомбинантна ДНК и нейното включване в организъм гостоприемник, който използва редица молекулярни инструменти, получени от микроорганизми.

Рестрикционни ензими и лигази

В технологията на рекомбинантна ДНК молекулите на ДНК се манипулират, използвайки естествено срещащи се ензими, получени главно от бактерии и вируси. Създаването на рекомбинантни ДНК молекули е възможно поради използването на естествено срещащи се рестрикционни ендонуклеази (рестрикционни ензими), бактериални ензими, произведени като защитен механизъм за изрязване и унищожаване на чужда цитоплазмена ДНК, която най -често е резултат от инфекция с бактериофаги. Стюарт Лин и Вернер Арбер откриват рестрикционни ензими в своите проучвания за това как E. coli ограничава репликацията на бактериофагите при инфекция. Днес ние използваме широко рестриктазни ензими за рязане на ДНК фрагменти, които след това могат да бъдат снаждани в друга ДНК молекула, за да образуват рекомбинантни молекули. Всеки рестрикционен ензим реже ДНК на характерно място за разпознаване, специфична, обикновено палиндромна, ДНК последователност, обикновено между четири до шест базови двойки по дължина. Палиндромът е поредица от букви, които се четат както напред, така и назад. (Думата "ниво" е пример за палиндром.) Палиндромните ДНК последователности съдържат същите базови последователности в посока 5' до 3' на една верига, както в посока 5' до 3' на комплементарната верига. Рестрикционен ензим разпознава ДНК палиндром и отрязва всеки гръбнак на идентични позиции в палиндрома. Някои рестрикционни ензими се нарязват, за да произведат молекули, които имат допълващи се надвеси (лепкави краища), докато други режат, без да генерират такива надвеси, вместо да произвеждат тъпи краища (Фигура 12.3).

Молекулите с допълващи се лепкави краища могат лесно да отгряват или да образуват водородни връзки между допълващи се основи в техните лепкави краища. Етапът на отгряване позволява хибридизация на едноверижните надвеси. Хибридизацията се отнася до свързването на две комплементарни единични вериги на ДНК. Тъпите краища също могат да се прикрепят заедно, но по -малко ефективно от лепкавите краища поради липсата на допълващи се надвеси, улесняващи процеса. И в двата случая, лигирането чрез ДНК лигаза може след това да се присъедини отново към двата захарно-фосфатни гръбнака на ДНК чрез ковалентно свързване, което прави молекулата непрекъсната двойна верига. През 1972 г. Пол Берг, биохимик от Станфорд, е първият, който произвежда рекомбинантна ДНК молекула, използвайки тази техника, комбинирайки SV40 маймунски вирус с E. coli бактериофаг ламбда за създаване на хибрид.

Плазмиди

След рестрикционно смилане, гените, представляващи интерес, обикновено се вмъкват в плазмиди, малки парченца типично кръгова, двойноверижна ДНК, които се репликират независимо от бактериалната хромозома (вижте Уникални характеристики на прокариотните клетки). В рекомбинантната ДНК технология плазмидите често се използват като вектори, ДНК молекули, които пренасят ДНК фрагменти от един организъм в друг. Плазмидите, използвани като вектори, могат да бъдат генетично инженерирани от изследователи и компании за научни доставки, за да имат специализирани свойства, както е илюстрирано от често използвания плазмиден вектор pUC19 (Фигура 12.4). Някои плазмидни вектори съдържат гени, които придават антибиотична резистентност, тези гени на резистентност позволяват на изследователите лесно да намерят колонии, съдържащи плазмиди, като ги поставят върху среда, съдържаща съответния антибиотик. Антибиотикът убива всички клетки гостоприемници, които не съдържат желания плазмиден вектор, но тези, които съдържат вектора, могат да оцелеят и да растат.

Плазмидни вектори, използвани за клониране, обикновено имат полилинкерно място или място за множествено клониране (MCS). Полилинкерният сайт е кратка последователност, съдържаща множество уникални места за разпознаване на рестрикционен ензим, които се използват за вмъкване на ДНК в плазмида след рестрикционно смилане както на ДНК, така и на плазмида. Наличието на тези множество места за разпознаване на рестрикционни ензими в полилинкерното място прави плазмидния вектор универсален, така че може да се използва за много различни експерименти за клониране, включващи различни рестрикционни ензими.

Този полилинкерен сайт често се намира в репортерния ген, друга генна последователност, изкуствено проектирана в плазмида, който кодира протеин, който позволява визуализиране на вмъкването на ДНК. Репортерният ген позволява на изследователя да разграничи клетки гостоприемници, които съдържат рекомбинантни плазмиди с клонирани ДНК фрагменти от клетки гостоприемници, които съдържат само нерекомбинантния плазмиден вектор. Най -често срещаният репортер ген, използван в плазмидните вектори, е бактериалният lacZ ген, кодиращ бета-галактозидаза, ензим, който естествено разгражда лактозата, но също така може да разгради безцветен синтетичен аналог X-gal, като по този начин произвежда сини колонии върху среда, съдържаща X-gal. The lacZ репортерният ген е деактивиран, когато рекомбинантната ДНК се снареди в плазмида. Тъй като LacZ протеинът не се произвежда, когато генът е деактивиран, X-gal не се разгражда и се произвеждат бели колонии, които след това могат да бъдат изолирани. Този синьо-бял скрининг метод е описан по-късно и показан на фигура 12.5. В допълнение към тези характеристики, някои плазмиди идват предварително усвоени и с ензим, свързан с линеаризирания плазмид, за подпомагане на лигирането след вмъкването на чужди ДНК фрагменти.

Молекулно клониране с помощта на трансформация

Най -често използваният механизъм за въвеждане на конструирани плазмиди в бактериална клетка е трансформацията, процес, при който бактериите поемат свободна ДНК от заобикалящата ги среда. В природата свободната ДНК обикновено идва от други лизирани бактериални клетки в лабораторията, свободната ДНК под формата на рекомбинантни плазмиди се въвежда в околността на клетката.

Някои бактерии, като напр бацил spp., са естествено компетентни, което означава, че са в състояние да поемат чужда ДНК. Въпреки това, не всички бактерии са естествено компетентни. В повечето случаи бактериите трябва да бъдат изкуствено компетентни в лабораторията чрез увеличаване на пропускливостта на клетъчната мембрана. Това може да се постигне чрез химически обработки, които неутрализират зарядите върху клетъчната мембрана или чрез излагане на бактериите на електрическо поле, което създава микроскопични пори в клетъчната мембрана. Тези методи дават съответно химически компетентни или електрокомпетентни бактерии.

Следвайки протокола за трансформация, бактериалните клетки се поставят върху среда, съдържаща антибиотик, за да инхибират растежа на много клетки гостоприемници, които не са трансформирани от плазмида, придаващ антибиотична резистентност. След това се използва техника, наречена синьо-бял скрининг lacZ-кодиращи плазмидни вектори като pUC19. Сините колонии имат функционален бета-галактозидазен ензим, тъй като lacZ генът е непрекъснат, без чужда ДНК, вмъкната в полилинкерното място. Тези колонии обикновено са резултат от усвоения, линеаризиран плазмид, който се религира към себе си. Белите колонии обаче нямат функционален ензим бета-галактозидаза, което показва вмъкването на чужда ДНК в полилинкерното място на плазмидния вектор, като по този начин се нарушава lacZ ген. По този начин белите колонии, получени от този синьо-бял скрининг, съдържат плазмиди с вложка и могат да бъдат допълнително скринирани, за да се характеризира чуждата ДНК. За да сте сигурни, че правилната ДНК е включена в плазмида, след това ДНК инсертът може да бъде секвениран.

Връзка към обучението

Вижте анимация на молекулярно клониране от Центъра за обучение на ДНК.

Проверете вашето разбиране

Молекулярно клониране с помощта на конюгация или трансдукция

Бактериалният процес на конюгиране (вж. Как асексуалните прокариоти постигат генетично разнообразие) също може да бъде манипулиран за молекулно клониране. F плазмидите, или плазмидите на плодовитостта, се прехвърлят между бактериалните клетки чрез процеса на конюгиране. Рекомбинантна ДНК може да бъде прехвърлена чрез конюгиране, когато бактериални клетки, съдържащи рекомбинантен F плазмид, се смесват със съвместими бактериални клетки, които нямат плазмида. F плазмидите кодират повърхностна структура, наречена F pilus, която улеснява контакта между клетка, съдържаща F плазмид, и клетка без F плазмид. При контакт се образува цитоплазмен мост между двете клетки и клетката, съдържаща F-плазмид, репликира своя плазмид, прехвърляйки копие на рекомбинантния F плазмид в реципиентната клетка. След като получи рекомбинантния F плазмид, клетката реципиент може да произведе свой собствен F pilus и да улесни трансфера на рекомбинантния F плазмид към допълнителна клетка. Използването на конюгиране за прехвърляне на рекомбинантни F плазмиди към клетки-реципиенти е друг ефективен начин за въвеждане на рекомбинантни ДНК молекули в клетките гостоприемници.

Алтернативно, бактериофагите могат да бъдат използвани за въвеждане на рекомбинантна ДНК в бактериални клетки гостоприемници чрез манипулация на процеса на трансдукция (вижте Как асексуалните прокариоти постигат генетично разнообразие). В лабораторията интересните фрагменти от ДНК могат да бъдат конструирани във фагемиди, които са плазмиди, които имат фагови последователности, които им позволяват да бъдат опаковани в бактериофаги. След това бактериалните клетки могат да бъдат инфектирани с тези бактериофаги, така че рекомбинантните фагемиди да могат да бъдат въведени в бактериалните клетки. В зависимост от вида на фага, рекомбинантната ДНК може да бъде интегрирана в генома на гостоприемника (лизогения) или може да съществува като плазмид в цитоплазмата на гостоприемника.

Проверете вашето разбиране

  • Каква е първоначалната функция на рестрикционен ензим?
  • Какви два процеса се използват за получаване на рекомбинантна ДНК в бактериална клетка гостоприемник?
  • Разграничете употребите на ген за резистентност към антибиотици и репортер ген в плазмиден вектор.

Създаване на геномна библиотека

Молекулярното клониране може също да се използва за генериране на геномна библиотека. Библиотеката е пълно (или почти пълно) копие на генома на организма, съдържащ се като рекомбинантни ДНК плазмиди, конструирани в уникални клонове на бактерии. Наличието на такава библиотека позволява на изследователя да създава големи количества от всеки фрагмент, като отглежда бактериалния гостоприемник за този фрагмент. Тези фрагменти могат да се използват за определяне на последователността на ДНК и функцията на всички присъстващи гени.

Един метод за генериране на геномна библиотека е да се лигират отделни рестриктиращи ензими разградени геномни фрагменти в плазмидни вектори, нарязани със същия рестрикционен ензим (Фигура 12.6). След трансформация в бактериален гостоприемник, всяка трансформирана бактериална клетка поема един рекомбинантен плазмид и прераства в колония от клетки. Всички клетки в тази колония са идентични клонове и носят един и същ рекомбинантен плазмид. Получената библиотека представлява колекция от колонии, всяка от които съдържа фрагмент от генома на оригиналния организъм, които са отделни и различни и всяка може да се използва за по -нататъшно проучване. Това дава възможност на изследователите да скринират тези различни клонинги, за да открият този, съдържащ ген от интерес от генома на оригиналния организъм.

За да се изгради геномна библиотека, използваща по -големи фрагменти от геномна ДНК, an E. coli бактериофаг, като ламбда, може да се използва като гостоприемник (Фигура 12.7). Геномната ДНК може да бъде срязана или ензимно разградена и лигирана в предварително усвоен бактериофагов ламбда ДНК вектор. След това тези рекомбинантни фагови ДНК молекули могат да бъдат опаковани във фагови частици и използвани за заразяване E. coli клетки -гостоприемници в чиния. По време на инфекцията във всяка клетка, всеки рекомбинантен фаг ще направи много свои копия и ще лизира E. coli морава, образувайки плака. По този начин всяка плака от фагова библиотека представлява уникален рекомбинантен фаг, съдържащ различен геномен ДНК фрагмент. След това плаките могат да бъдат скринирани допълнително, за да се търсят гени, които представляват интерес. Едно предимство при създаването на библиотека, използваща фаги вместо плазмиди, е, че фаговата частица съдържа много по-голям вмъкване на чужда ДНК в сравнение с плазмиден вектор, като по този начин се изисква много по-малък брой култури, за да се представи напълно целият геном на оригиналния организъм.

За да се съсредоточат върху експресираните гени в организъм или дори тъкан, изследователите конструират библиотеки, използвайки телесна РНК (мРНК) на организма, а не неговата геномна ДНК.Докато всички клетки в един организъм ще имат една и съща геномна ДНК, различните тъкани експресират различни гени, произвеждайки различни комплементи на иРНК. Например, геномната ДНК на всички човешки клетки съдържа гена за инсулин, но само клетките в панкреаса експресират иРНК, насочваща производството на инсулин. Тъй като иРНК не може да бъде клонирана директно, в лабораторията иРНК трябва да се използва като матрица от ретровирусния ензим обратна транскриптаза, за да се направи комплементарна ДНК (кДНК). Пълният комплект от иРНК на клетката може да бъде транскрибиран обратно в молекули сДНК, което може да се използва като матрица за ДНК полимераза, за да се направят двуверижни ДНК копия, тези фрагменти впоследствие могат да бъдат лигирани или в плазмидни вектори, или в бактериофаг, за да се получи сДНК библиотека. Ползата от библиотека сДНК е, че тя съдържа ДНК само от експресираните гени в клетката. Това означава, че интроните, контролните последователности като промотори и ДНК, които не са предназначени да бъдат транслирани в протеини, не са представени в библиотеката. Фокусът върху транслирани последователности означава, че библиотеката не може да се използва за изследване на последователността и структурата на генома в неговата цялост. Конструирането на сДНК геномна библиотека е показано на Фигура 12.8.

Проверете вашето разбиране

Въвеждане на рекомбинантни молекули в еукариотните гостоприемници

Използването на бактериални гостоприемници за генно инженерство поставя основите на технологията на рекомбинантна ДНК, но изследователите също имат голям интерес към генно инженерните еукариотни клетки, особено тези на растения и животни. Въвеждането на рекомбинантни ДНК молекули в еукариотните гостоприемници се нарича трансфекция. Генетично модифицираните растения, наречени трансгенни растения, представляват значителен интерес за селскостопански и фармацевтични цели. Първото трансгенно растение, продавано на пазара, беше доматът Flavr Savr със забавено зреене, който се появи на пазара през 1994 г. Успешно се произвеждат и генетично модифицирани животни, което води до например свине с повишена хранителна стойност 1 и кози, които отделят фармацевтични продукти в млякото им. 2

Електропорация

В сравнение с бактериалните клетки, еукариотните клетки са по-малко податливи като гостоприемници за рекомбинантни ДНК молекули. Тъй като еукариотите обикновено не са компетентни да поемат чужда ДНК, нито са в състояние да поддържат плазмиди, трансфекцията на еукариотни гостоприемници е много по -предизвикателна и изисква по -натрапчиви техники за успех. Един метод, използван за трансфектиране на клетки в клетъчната култура, се нарича електропорация. Кратък електрически импулс предизвиква образуването на преходни пори във фосфолипидните двуслойни клетки, чрез които генът може да бъде въведен. В същото време електрическият импулс генерира краткотраен положителен заряд от едната страна на вътрешността на клетката и отрицателен заряд от противоположната страна, разликата в заряда привлича отрицателно заредени ДНК молекули в клетката (Фигура 12.9).

Микроинжекция

Алтернативен метод за трансфекция се нарича микроинжекция. Тъй като еукариотните клетки обикновено са по -големи от тези на прокариотите, ДНК фрагментите понякога могат да бъдат директно инжектирани в цитоплазмата с помощта на стъклена микропипета, както е показано на Фигура 12.10.

Джинови пистолети

Трансфектирането на растителни клетки може да бъде дори по -трудно от животинските клетки поради техните дебели клетъчни стени. Един подход включва третиране на растителни клетки с ензими, за да се премахнат клетъчните им стени, произвеждайки протопласти. След това се използва генен пистолет за изстрелване на златни или волфрамови частици, покрити с рекомбинантни ДНК молекули, в растителните протопласти с високи скорости. Реципиентните протопластови клетки след това могат да се възстановят и да се използват за генериране на нови трансгенни растения (Фигура 12.11).

Совалки Вектори

Друг метод за трансфектиране на растения включва совалкови вектори, плазмиди, които могат да се движат между бактериални и еукариотни клетки. Тумор-индуциращият (Т.i) плазмиди, произхождащи от бактерията Agrobacterium tumefaciens обикновено се използват като совалкови вектори за включване на гени в растенията (Фигура 12.12). В природата Тi плазмиди на A. tumefaciens причиняват растенията да развият тумори, когато се прехвърлят от бактериални клетки в растителни клетки. Изследователите са успели да манипулират тези естествено срещащи се плазмиди, за да премахнат техните тумор-причиняващи гени и да вмъкнат желаните ДНК фрагменти. Полученият рекомбинантен Ti плазмидите могат да бъдат прехвърлени в генома на растението чрез естествения трансфер на Тi плазмиди от бактерията към растителния гостоприемник. Веднъж вътре в клетката гостоприемник на растението, генът от интерес се рекомбинира в генома на растителната клетка.

Вирусни вектори

Вирусните вектори също могат да се използват за трансфекция на еукариотни клетки. Всъщност този метод често се използва в генната терапия (вижте Генна терапия) за въвеждане на здрави гени в човешки пациенти, страдащи от заболявания, които са резултат от генетични мутации. Вирусните гени могат да бъдат изтрити и заменени с гена, който да бъде доставен на пациента 3, след което вирусът заразява клетката гостоприемник и доставя чуждата ДНК в генома на целевата клетка. Аденовирусите често се използват за тази цел, тъй като те могат да се отглеждат до висок титър и могат да заразят както неделящи, така и делящи се клетки гостоприемници. Въпреки това, използването на вирусни вектори за генна терапия може да представлява някои рискове за пациентите, както е обсъдено в Генна терапия.

Проверете вашето разбиране

  • Какви са методите, използвани за въвеждане на рекомбинантни ДНК вектори в животински клетки?
  • Сравнете и контрастирайте совалкови вектори и вирусни вектори.

Бележки под линия

    Liangxue Lai, Jing X. Kang, Rongfeng Li, Jingdong Wang, William T. Witt, Hwan Yul Yong, Yanhong Hao et al. „Поколение на клонирани трансгенни прасета, богати на омега-3 мастни киселини.“ Природна биотехнология 24 не. 4 (2006): 435–436. Raylene Ramos Moura, Luciana Magalhães Melo и Vicente José de Figueirêdo Freitas. "Производство на рекомбинантни протеини в млякото на трансгенни и нетрансгенни кози." Бразилски архиви по биология и технологии 54 не. 5 (2011): 927–938. Уилям С.М. Уолд и Кароли Тот. „Аденовирусни вектори за генна терапия, ваксинация и генна терапия за рак.“ Текуща генна терапия 13 не. 6 (2013): 421.

Като сътрудник на Amazon ние печелим от отговарящи на условията покупки.

Искате ли да цитирате, споделите или промените тази книга? Тази книга е Creative Commons Attribution License 4.0 и трябва да приписвате OpenStax.

    Ако разпространявате цялата или част от тази книга в печатен формат, тогава трябва да включите на всяка физическа страница следното приписване:

  • Използвайте информацията по -долу, за да генерирате цитат. Препоръчваме да използвате инструмент за цитиране като този.
    • Автори: Nina Parker, Mark Schneegurt, Anh-Hue Thi Tu, Philip Lister, Brian M. Forster
    • Издател/уебсайт: OpenStax
    • Заглавие на книгата: Микробиология
    • Дата на публикуване: 1 ноември 2016 г.
    • Местоположение: Хюстън, Тексас
    • URL адрес на книгата: https://openstax.org/books/microbiology/pages/1-introduction
    • URL адрес на секция: https://openstax.org/books/microbiology/pages/12-1-microbes-and-the-tools-of-genetic-engineering

    © 20 август 2020 г. OpenStax. Съдържанието на учебници, произведено от OpenStax, е лицензирано под лиценз Creative Commons Attribution License 4.0. Името на OpenStax, логото на OpenStax, кориците на книгите на OpenStax, името на OpenStax CNX и логото на OpenStax CNX не са предмет на лиценза Creative Commons и не могат да бъдат възпроизвеждани без предварителното и изрично писмено съгласие на Университета Райс.


    Основи на генетиката

    Въпреки откриването на ДНК в края на 1800 г., учените не са правили връзка с наследствеността още много десетилетия. За да направят тази връзка, учените, включително редица микробиолози, извършиха много експерименти върху растения, животни и бактерии.

    Грахови растения на Мендел

    Докато Мишер изолира и открива ДНК през 1860 -те години, австрийският монах и ботаник Йохан Грегор Мендел (1822–1884) експериментира с градински грах, демонстрирайки и документирайки основните модели на наследяване, сега известни като законите на Мендел.

    През 1856 г. Мендел започва своето десетилетно изследване на моделите на наследяване. Той използва диплоидния градински грах, Pisum sativum, като негова основна моделна система, тъй като естествено се самоопложда и е силно инбридирана, произвеждаща линии за градински растения и растения, които винаги произвеждат потомство, което прилича на родителя. Експериментирайки с истински размножаващи се грахови растения, Мендел избягва появата на неочаквани черти в потомството, които биха могли да се появят, ако той използва растения, които не са истински развъдни. Мендел извършва хибридизации, които включват чифтосване на два истински размножаващи се индивида (P поколение), които имат различни черти, и изследва характеристиките на тяхното потомство (първо синово поколение, F1), както и потомството на самооплождането на F1 поколение (второ синовско поколение, F2) (Фигура 1).

    Фигура 1. В един от експериментите си върху моделите на наследяване, Мендел кръстосва растения, които са били истински размножаващи се за виолетов цвят с растения, истински размножаващи се за цвят на бял цвят (поколението P). Получените хибриди във F1 поколение всички имаха виолетови цветя. В F.2 поколение, приблизително три четвърти от растенията са имали виолетови цветя, а една четвърт-бели.

    През 1865 г. Мендел представя резултатите от експериментите си с близо 30 000 грахови растения на местното природонаучно общество. Той показа, че чертите се предават вярно от родителите на потомството независимо от други черти. През 1866 г. той публикува работата си, “Experiments in Plant Hybridization, ” [1] в Известия на Природонаучното дружество в Брюн. Работата на Мендел остава практически незабелязана от научната общност, която вярваше неправилно в теорията за смесване на черти в непрекъснати вариации.

    Той не беше признат за изключителния си научен принос приживе. Всъщност едва през 1900 г. работата му е преоткрита, възпроизведена и съживена от учените на ръба на откриването на хромозомната основа на наследствеността.

    Хромозомната теория на наследяването

    Мендел провежда експериментите си много преди това хромозоми бяха визуализирани под микроскоп. Въпреки това, с подобряването на микроскопските техники в края на 1800 г., клетъчните биолози могат да оцветяват и визуализират субклетъчни структури с багрила и да наблюдават техните действия по време на мейоза. Те успяха да наблюдават възпроизвеждането на хромозоми, кондензиране от аморфна ядрена маса в отделни Х-образни тела и мигриране към отделни клетъчни полюси. Спекулациите, че хромозомите могат да бъдат ключът към разбирането на наследствеността, накараха няколко учени да проучат публикациите на Мендел и да преоценят неговия модел по отношение на поведението на хромозомите по време на митоза и мейоза.

    През 1902 г. Теодор Бовери (1862–1915) наблюдава, че при морските таралежи ядрените компоненти (хромозоми) определят правилното ембрионално развитие. Същата година, Уолтър Сътън (1877–1916) наблюдава разделянето на хромозомите в дъщерни клетки по време на мейоза. Заедно тези наблюдения доведоха до развитието на Хромозомна теория на наследството, който идентифицира хромозомите като генетичен материал, отговорен за наследството на Мендел.

    Въпреки убедителните корелации между поведението на хромозомите по време на мейозата и наблюденията на Мендел, хромозомната теория на наследяването е предложена много преди да има пряко доказателство, че чертите се носят върху хромозомите. Томас Хънт Морган (1866–1945) и неговите колеги прекараха няколко години, извършвайки кръстоски с плодовата муха, Drosophila melanogaster. Те извършиха щателни микроскопски наблюдения на хромозомите на мухата и съпоставиха тези наблюдения с получените характеристики на мухата. Тяхната работа предоставя първите експериментални доказателства в подкрепа на хромозомната теория за наследството в началото на 1900 -те години. През 1915 г. Morgan и неговите “Fly Room ” колеги публикуват Механизмът на менделската наследственост, който идентифицира хромозомите като клетъчни структури, отговорни за наследствеността. За многото си значителни приноси в генетиката, Морган получава Нобелова награда за физиология или медицина през 1933 г.

    В края на 20 -те години Барбара Макклинток (1902–1992) разработи техники за хромозомно оцветяване за визуализиране и разграничаване между различните хромозоми на царевицата (царевица). През 40 -те и 50 -те години на миналия век тя идентифицира събитие на счупване на хромозома 9, което тя нарече локус на дисоциация (Ds). Ds може да промени позицията си в хромозомата. Тя също така идентифицира локус на активатор (Ac). Ds счупването на хромозомата може да бъде активирано от Ac елемент (ензим транспозаза). Отначало констатацията на Макклинток за тях скачащи гени, който сега наричаме транспозони, не беше приет от научната общност. Едва през 60 -те години и по -късно транспозоните са открити в бактериофаги, бактерии и Дрозофила. Днес знаем, че транспозоните са подвижни сегменти от ДНК, които могат да се движат в генома на организма. Те могат да регулират генната експресия, експресията на протеини и вирулентността (способността да причиняват заболяване).

    Микроби и вируси в генетичните изследвания

    Микробиолозите също изиграха решаваща роля в нашето разбиране за генетиката. Експериментални организми като напр Менделградински грах, плодови мушици на Морган и МакклинтокЦаревицата вече беше успешно използвана, за да проправи пътя за разбиране на генетиката. Въпреки това, микробите и вирусите бяха (и все още са) отлични моделни системи за изследване на генетика тъй като за разлика от граха, плодовите мушици и царевицата, те се размножават по-лесно в лабораторията, като нарастват до висока гъстота на населението в малко пространство и за кратко време. Освен това, поради тяхната структурна простота, микробите и вирусите се манипулират по-лесно генетично.

    За щастие, въпреки значителните разлики в размера, структурата, стратегиите за възпроизвеждане и други биологични характеристики, съществува биохимично единство между всички организми, които имат общи за тях едни и същи основни молекули, отговорни за наследственост и използването на генетичен материал, за да даде на клетките техните различни характеристики. По думите на френския учен Жак Monod, “ За какво е вярно E. coli важи и за слона ”, което означава, че биохимията на живота се е поддържала през цялата еволюция и се споделя във всички форми на живот, от прости едноклетъчни организми до големи, сложни организми. Тази биохимична приемственост прави микробите отлични модели за използване за генетични изследвания.

    В умен набор от експерименти през 30 -те и 40 -те години на миналия век, немският учен Йоаким Хамерлинг (1901–1980), използвайки едноклетъчно водорасло Ацетабулария като микробен модел, установено, че генетичната информация в еукариотната клетка се помещава в ядро. Ацетабулария spp. са необичайно големи клетки от водорасли, които растат асиметрично, образувайки “foot ”, съдържащ ядрото, което се използва за прикрепване на субстрат към стъбло и шапка, подобна на чадър-структури, които всички могат лесно да се видят с просто око. В ранен набор от експерименти, Hämmerling отстранява или капачката, или стъпалото на клетките и наблюдава дали нови капачки или крачета са регенерирани (Фигура 2). Той откри, че когато стъпалото на тези клетки е отстранено, новите крака не растат, но когато капачките са отстранени от клетките, нови капачки са регенерирани. Това предполага, че наследствената информация се намира в съдържащото ядрото стъпало на всяка клетка.

    Фигура 2. Щракнете за по-голямо изображение. а) Клетките на едноклетъчните водорасли Acetabularia са с размери 2–6 cm и имат клетъчна морфология, която може да се наблюдава с просто око. Всяка клетка има капачка, дръжка и стъпало, което съдържа ядрото. (б) Хамерлинг установява, че ако свали капачката, нова капачка ще се регенерира, но ако махне крака, ново стъпало няма да се регенерира. Той заключи, че генетичната информация, необходима за регенерацията, е открита в ядрото. (кредит а: модификация на творбата от Джеймс Сейнт Джон)

    В друг набор от експерименти, Hämmerling използва два вида Ацетабулария които имат различна морфология на капачката, A. crenulata и A. mediterranea (Фигура 3). Той отряза шапките от двата типа клетки и след това присади дръжката от an A. crenulata върху A. mediterranea крак и обратно. С течение на времето той забелязал, че присадената клетка с A. crenulata крак и A. mediterranea стъбло развил капачка с A. crenulata морфология. Обратно, присадената клетка с A. mediterranea крак и A. crenulata стъбло развил капачка с A. mediterranea морфология. Той микроскопски потвърди наличието на ядра в краката на тези клетки и приписва развитието на тези морфологии на капачката на ядрото на всяка присадена клетка. По този начин той експериментално показа, че ядро е местоположението на генетичен материал, който диктува свойствата на клетката.

    Фигура 3. Щракнете, за да видите по -голямо изображение. Във втори набор от експерименти Хемерлинг използва два морфологично различни вида и присади стъбла от всеки вид към краката на другия. Той откри, че свойствата на регенерираните капачки са продиктувани от вида на стъпалото, съдържащо ядро.

    Друг микробен модел, формата за червен хляб Neurospora crassa, беше използван от Джордж Бийдъл и Едуард Тейтъм, за да демонстрира връзката между гените и протеините, които кодират. Бийдъл бе работил с плодови мухи МорганЛаборатория, но ги намира за твърде сложни, за да извършват определени видове експерименти. N. crassa, от друга страна, е по-прост организъм и има способността да расте на минимална среда, тъй като съдържа ензимни пътища, които му позволяват да използва средата за производство на собствени витамини и аминокиселини.

    Beadle и Tatum облъчена мухъл с рентгенови лъчи, за да предизвика промени в последователност от нуклеинови киселини, т.нар мутации. Те чифтосват облъчените спори на плесен и се опитват да ги отглеждат както на пълна среда, така и на минимална среда. Те търсеха мутанти които растат на пълноценна среда, допълнена с витамини и аминокиселини, но не растат на минималната среда без тези добавки. Такива форми теоретично съдържат мутации в гените, които кодират биосинтетичните пътища. След като открили такива мутанти, те систематично тествали всеки, за да определят кой витамин или аминокиселина не е в състояние да произведе (Фигура 4) и публикували тази работа през 1941 г. [2]

    Фигура 4. Beadle и TatumЕкспериментът на 's включва чифтосване на облъчени и необлъчени спори на плесен.Тези спори се отглеждат както на пълна среда, така и на минимална среда, за да се определи коя аминокиселина или витамин мутантът не може да произведе сам.

    Последващата работа на Beadle, Tatum и колеги показа, че те могат да изолират различни класове мутанти, които изискват определена добавка, като аминокиселината аргинин (Фигура 5). С известни познания за пътя на биосинтеза на аргинин, те идентифицираха три класа аргининови мутанти чрез допълване на минималната среда с междинни продукти (цитрулин или орнитин) в пътя. Трите мутанта се различават по способностите си да растат във всяка от медиите, което кара групата учени да предложат през 1945 г., че всеки тип мутант има дефект в различен ген в пътя на биосинтеза на аргинин. Това доведе до т.нар хипотеза един ген – един ензим, което предполага, че всеки ген кодира един ензим.

    Последващи познания за процесите на транскрипция и превод накара учените да преразгледат това до хипотезата "ген#един -един полипептид"#8221. Въпреки че има някои гени, които не кодират полипептиди (по -скоро кодират за трансферни РНК [tRNAs] или рибозомни РНК [rRNAs], които ще обсъдим по -късно), хипотезата един ген -един ензим е вярна в много случаи, особено при микробите . Откриването на Бийдъл и Тейтъм за връзката между гените и съответните характеристики им спечели Нобелова награда за физиология и медицина през 1958 г. и оттогава се превърна в основа за съвременната молекулярна генетика.

    Фигура 5. Идентифицирани са три класа аргининови мутанти, като всеки се различава по способността си да расте в присъствието на междинни съединения в пътя на биосинтеза на аргинин. От това Beadle и Tatum стигнаха до извода, че всеки мутант е дефектен в различен ген, кодиращ различен ензим в пътя на биосинтеза на аргинин, което води до тяхната хипотеза един ген -един ензим.

    Помисли за това

    • Какъв организъм са използвали Морган и неговите колеги за разработване на хромозомната теория за наследството? Какви черти са проследили?
    • Какво доказа Хамерлинг с експериментите си върху Ацетабулария?

    Въвеждане на рекомбинантни молекули в еукариотните гостоприемници

    Използването на бактериални гостоприемници за генно инженерство поставя основите на технологията на рекомбинантна ДНК, но изследователите също имат голям интерес към генно инженерните еукариотни клетки, особено тези на растения и животни. Нарича се въвеждането на рекомбинантни ДНК молекули в еукариотните гостоприемници трансфекция. Генно инженерни растения, наречени трансгенни растения, представляват значителен интерес за селскостопански и фармацевтични цели. Първото трансгенно растение, продавано на пазара, беше Flavr Savr домати със забавено узряване, който се появи на пазара през 1994 г. Успешно се произвеждат и добитък с генетично модифицирани животни, което води например до свине с повишена хранителна стойност [1] и кози, които отделят фармацевтични продукти в млякото си. [2]

    Електропорация

    В сравнение с бактериалните клетки, еукариотните клетки са по-малко податливи като гостоприемници за рекомбинантни ДНК молекули. Тъй като еукариотите обикновено не са компетентни да поемат чужда ДНК, нито са в състояние да поддържат плазмиди, трансфекцията на еукариотни гостоприемници е много по -предизвикателна и изисква по -натрапчиви техники за успех. Един метод, използван за трансфектиране на клетки в клетъчната култура, се нарича електропорация. Кратък електрически импулс предизвиква образуването на преходни пори във фосфолипидните двуслойни клетки, чрез които генът може да бъде въведен. В същото време електрическият импулс генерира краткотраен положителен заряд от едната страна на вътрешността на клетката и отрицателен заряд от противоположната страна, разликата в заряда привлича отрицателно заредени ДНК молекули в клетката (Фигура 8).

    Фигура 8. Електропорацията е една лабораторна техника, използвана за въвеждане на ДНК в еукариотни клетки.

    Микроинжекция

    Фигура 9. Микроинжекцията е друга техника за въвеждане на ДНК в еукариотни клетки. Игла за микроинжектиране, съдържаща рекомбинантна ДНК, е в състояние да проникне както в клетъчната мембрана, така и в ядрената обвивка.

    Алтернативен метод на трансфекция се нарича микроинжекция. Тъй като еукариотните клетки обикновено са по -големи от тези на прокариотите, ДНК фрагментите понякога могат да бъдат директно инжектирани в цитоплазмата с помощта на стъклена микропипета, както е показано на Фигура 9.

    Джинови пистолети

    Трансфектирането на растителни клетки може да бъде дори по -трудно от животинските клетки поради техните дебели клетъчни стени. Един подход включва третиране на растителни клетки с ензими, за да се премахнат клетъчните им стени, произвеждайки протопласти. Тогава ген пистолет се използва за изстрелване на златни или волфрамови частици, покрити с рекомбинантни ДНК молекули, в растителните протопласти при високи скорости. Реципиентните клетки от протопласт могат след това да се възстановят и да се използват за генериране на нови трансгенни растения (Фигура 10).

    Фигура 10. Тежки метални частици, покрити с рекомбинантна ДНК, се изстрелват в протопласти на растенията с помощта на генна пистолет. Получените трансформирани клетки се оставят да се възстановят и могат да бъдат използвани за генериране на рекомбинантни растения. (а) Схема на генно оръжие. (б) Снимка на генно оръжие. (кредит a, b: модификация на работата от JA O ’Brien, SC Lummis)

    Совалки Вектори

    Друг метод за трансфектиране на растения включва совалкови вектори, плазмиди, които могат да се движат между бактериални и еукариотни клетки. The тумор-индуциращ (Т.i) плазмиди произхождащи от бактерията Agrobacterium tumefaciens обикновено се използват като совалкови вектори за включване на гени в растенията (Фигура 11). В природата Тi плазмиди на A. tumefaciens причиняват растенията да развият тумори, когато се прехвърлят от бактериални клетки в растителни клетки. Изследователите са успели да манипулират тези естествено срещащи се плазмиди, за да премахнат техните тумор-причиняващи гени и да вмъкнат желаните ДНК фрагменти. Полученият рекомбинантен Ti плазмидите могат да бъдат прехвърлени в генома на растението чрез естествения трансфер на Тi плазмиди от бактерията към растителния гостоприемник. Веднъж вътре в клетката гостоприемник на растението, генът от интерес се рекомбинира в генома на растителната клетка.

    Фигура 11. Щракнете за по -голямо изображение. Тi плазмид на Agrobacterium tumefaciens е полезен совалков вектор за усвояване на гени, представляващи интерес, в растителните клетки. Интересният ген се клонира в Тi плазмид, който след това се въвежда в растителните клетки. След това интересният ген се рекомбинира в генома на растителната клетка, което позволява производството на трансгенни растения.

    Вирусни вектори

    Вирусните вектори също могат да се използват за трансфекция на еукариотни клетки. Всъщност този метод често се използва в генна терапия (вижте Генна терапия) за въвеждане на здрави гени при хора, страдащи от заболявания, които са резултат от генетични мутации. Вирусните гени могат да бъдат изтрити и заменени с гена, който да бъде доставен на пациента [3] след това вирусът инфектира клетката гостоприемник и доставя чуждата ДНК в генома на целевата клетка. Аденовирусите често се използват за тази цел, тъй като те могат да се отглеждат до висок титър и могат да заразят както неделящи, така и делящи се клетки гостоприемници. Използването на вирусни вектори за генната терапия може да представлява някои рискове за пациентите, както е обсъдено в Генната терапия.

    Помисли за това

    • Какви са методите, използвани за въвеждане на рекомбинантни ДНК вектори в животински клетки?
    • Сравнете и контрастирайте совалкови вектори и вирусни вектори.

    Основни концепции и обобщение

    • Биотехнология е наука за използване на живи системи в полза на човечеството. През последните години способността за директно промяна на генома на организма чрез генетичниинженерство стана възможно благодарение на напредъка в рекомбинантна ДНК технология, което позволява на изследователите да създават рекомбинантни ДНК молекули с нови комбинации от генетичен материал.
    • Молекулярно клониране включва методи, използвани за конструиране на рекомбинантна ДНК и улесняване на тяхната репликация в организмите гостоприемници. Тези методи включват използването на рестрикционни ензими (за изрязване както на чужда ДНК, така и плазмидни вектори), лигиране (за да залепите фрагменти от ДНК заедно) и въвеждането на рекомбинантна ДНК в организъм гостоприемник (често бактерии).
    • Синьо-бял скрининг позволява селекция на бактериални трансформанти, които съдържат рекомбинантни плазмиди, използвайки фенотипа на a репортер ген което е деактивирано чрез вмъкване на ДНК фрагмента.
    • Геномни библиотеки може да се направи чрез клониране на геномни фрагменти от един организъм в плазмидни вектори или в бактериофаг.
    • cDNA библиотеки могат да бъдат генерирани, за да представят тРНК молекулите, експресирани в клетка в дадена точка.
    • Трансфекция на еукариотни гостоприемници могат да бъдат постигнати чрез използване на различни методи електропорация, генни пистолети, микроинжекция, совалкови вектори, и вирусни вектори.

    Множествен избор

    Кое от следните е необходимо за възстановяване на фосфодиестерния гръбнак на ДНК по време на молекулярно клониране?

    [разкриване-отговор q = � ″] Показване на отговор [/разкриване-отговор]
    [скрит отговор a = � ″] Отговор d. ДНК лигазата е необходима за възстановяване на фосфодиестерния гръбнак на ДНК по време на молекулярно клониране.[/hidden-answer]

    Всичко по-долу са процеси, използвани за въвеждане на ДНК молекули в бактериални клетки с изключение:

    [разкриване-отговор q = � ″] Показване на отговор [/разкриване-отговор]
    [скрит отговор a = � ″] Отговор c. Транскрипцията е не използва се за въвеждане на ДНК молекули в бактериални клетки.[/hidden-answer]

    Ензимът, който използва РНК като матрица за производство на ДНК копие, се нарича:

    1. рестрикционен ензим
    2. ДНК лигаза
    3. обратна транскриптаза
    4. ДНК полимераза

    [разкриване-отговор q = � ″] Показване на отговор [/разкриване-отговор]
    [hidden-answer a=�″]Отговор в. Ензимът, който използва РНК като матрица за производство на ДНК копие, се нарича обратна транскриптаза. [/Hidden-answer]

    При синьо-белия скрининг какво представляват сините колонии?

    1. клетки, които не са поели плазмидния вектор
    2. клетки с рекомбинантни плазмиди, съдържащи нова вложка
    3. клетки, съдържащи празни плазмидни вектори
    4. клетки с нефункционални lacZ ген

    [разкриване-отговор q = � ″] Показване на отговор [/разкриване-отговор]
    [скрит отговор a = � ″] Отговор c. Сините колонии представляват клетки, съдържащи празни плазмидни вектори.[/hidden-answer]

    Тi плазмидът се използва за въвеждане на гени в:

    [разкриване-отговор q = � ″] Показване на отговор [/разкриване-отговор]
    [скрит отговор a = � ″] Отговор b. Тi Плазмидът се използва за въвеждане на гени в растителните клетки.[/hidden-answer]

    Вярно невярно

    Рекомбинацията е процес, който обикновено не се наблюдава в природата.

    [reveal-answer q=�″]Показване на отговора[/reveal-answer]
    [hidden-answer a = � ″] False [/hidden-answer]

    По принцип е по -лесно да се въведе рекомбинантна ДНК в прокариотни клетки, отколкото в еукариотни клетки.

    [разкриване-отговор q = � ″] Показване на отговор [/разкриване-отговор]
    [hidden-answer a = � ″] Вярно [/hidden-answer]

    Попълнете празното пространство

    Процесът на въвеждане на ДНК молекули в еукариотните клетки се нарича ________.

    [reveal-answer q=�″]Показване на отговора[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]Процесът на въвеждане на ДНК молекули в еукариотните клетки се нарича трансфекция. [/hidden-answer]

    Помисли за това

    1. Назовете три елемента, включени в плазмиден вектор за ефективно клониране.
    2. Кога учен би искал да генерира библиотека сДНК вместо геномна библиотека?
    3. Какво е едно от предимствата на генерирането на геномна библиотека, използваща фаги вместо плазмиди?
    4. Винаги ли биотехнологиите са свързани с генното инженерство? Обяснете отговора си.
    5. Кое е по-ефективно: клониране с тъп край или клониране с лепкав край? Защо?
    1. Liangxue Lai, Jing X. Kang, Rongfeng Li, Jingdong Wang, William T. Witt, Hwan Yul Yong, Yanhong Hao et al. "Генериране на клонирани трансгенни прасета, богати на Омега-3 мастни киселини." Природна биотехнология 24 не. 4 (2006): 435–436. &crarr
    2. Raylene Ramos Moura, Luciana Magalhães Melo и Vicente José de Figueirêdo Freitas. "Производство на рекомбинантни протеини в мляко на трансгенни и нетрансгенни кози." Бразилски архиви по биология и технологии 54 не. 5 (2011): 927–938. & crarr
    3. Уилям С.М. Уолд и Кароли Тот. "Аденовирусни вектори за генна терапия, ваксинация и генна терапия за рак." Текуща генна терапия 13 не. 6 (2013): 421. &crarr

    Трансдукция

    Бактериофагите могат да заразят бактериални клетки и да преместят къси парчета бактериална хромозомна ДНК от една бактерия в друга в процес, наречен трансдукция. За да се осъществи трансдукция, бактериофаг се прикрепя към бактериална клетка и инжектира своя генетичен материал в клетките и започва литичен цикъл. Бактериалната клетка се разгражда на къси парчета и бактериофагът ще опакова част от парчетата бактериална ДНК във фагови глави. Това води до бактериофаги, които сега съдържат генетичния материал на бактериални клетки. Докато литичният цикъл продължава, клетката се лизира и бактериофагите се освобождават, за да заразят други клетки. Всяко парче хромозомна ДНК може да бъде прехвърлено в нова клетка гостоприемник чрез случайно опаковане на хромозомна ДНК в фагова глава по време на сглобяване на фаг. В резултат на това хостът може да придобие нови свойства.

    Трансдукционните събития могат да доведат до гостоприемник може да получи гени за вирулентност, например патогенни Corynebacterium diphtheriae,причинителят на дифтерия и Clostridium botulinum,причинителят на ботулизма, са вирулентни поради въвеждането на кодиращи токсини гени от бактериофаги, потвърждавайки клиничното значение на трансдукцията.

    Клиничните последици от трансдукцията

    Пол, 23-годишен помощник от Атланта, пътува до Хаити през 2011 г., за да предостави помощ след земетресението през 2010 г. След като работи там няколко седмици, той изведнъж започва да изпитва коремен дистрес, включително тежки спазми, гадене, повръщане и водниста диария. Той също така започна да изпитва интензивни мускулни крампи. В местна клиника лекарят заподозря, че симптомите на Пол са причинени от холера, тъй като след земетресението е имало избухване на холера. Тъй като холерата се предава по фекално-орален път, нарушения в санитарната инфраструктура, каквито често се случват след природни бедствия, могат да предизвикат огнища. Лекарят потвърди предполагаемата диагноза с помощта на тест за измерване на холера. След това той предписва на Пол еднократна доза доксициклин, както и соли за орална рехидратация, като го инструктира да пие значителни количества чиста вода.

    Фигура 2. Сканираща електронна микроснимка на Вибрион холера показва характерната си извита форма на пръта.

    Холерата се причинява от грам-отрицателна извита пръчка Вибрион холера (Фигура 2). Неговите симптоми до голяма степен са резултат от производството на холерния токсин (СТ), който в крайна сметка активира хлориден транспортер за изпомпване на хлоридни йони от епителните клетки в лумена на червата. След това водата следва хлоридните йони, причинявайки плодовита водниста диария, характерна за холерата. Генът, кодиращ холерен токсин, е включен в бактериалната хромозома на V. холера чрез инфекция на бактерията с лизогенния нишковиден CTX фаг, който носи CT гена и го въвежда в хромозомата при интегриране на профага. По този начин патогенните щамове на V. холера резултат от хоризонтален генен трансфер чрез специализирана трансдукция.

    • Защо огнища на холера са по-чести в резултат на природно бедствие?
    • Защо мускулните спазми са често срещан симптом на холера? Защо лечението с орални соли за рехидратация е толкова важно за лечението на холера?
    • В области, засегнати от холера, какви са някои стратегии, които хората биха могли да използват, за да предотвратят предаването на болести?

    Молекулярно клониране

    Хърбърт Бойер и Стенли Коен за първи път демонстрира пълното молекулярно клониране процес през 1973 г., когато те успешно клонират гени от африканската жаба с нокти (Xenopus laevis) в бактериален плазмид, който след това е въведен в бактериалния гостоприемник Ешерихия коли. Молекулярното клониране е набор от методи, използвани за конструиране на рекомбинантна ДНК и нейното включване в организъм гостоприемник, който използва редица молекулярни инструменти, получени от микроорганизми.

    Рестрикционни ензими и лигази

    В технологията на рекомбинантна ДНК молекулите на ДНК се манипулират, използвайки естествено срещащи се ензими, получени главно от бактерии и вируси. Създаването на рекомбинантни ДНК молекули е възможно благодарение на използването на естествено срещащи се рестрикционни ендонуклеази (рестрикционни ензими), бактериални ензими, произведени като защитен механизъм за разрязване и унищожаване на чужда цитоплазмена ДНК, която най-често е резултат от инфекция с бактериофаг. Стюарт Лин и Вернер Арбер открили рестрикционни ензими в своите проучвания от 1960 г. как E. coli ограничава репликацията на бактериофагите при инфекция. Днес ние използваме широко рестриктазни ензими за рязане на ДНК фрагменти, които след това могат да бъдат снаждани в друга ДНК молекула, за да образуват рекомбинантни молекули. Всеки рестрикционен ензим отрязва ДНК по характеристика сайт за разпознаване, специфична, обикновено палиндромна, ДНК последователност, обикновено между четири до шест базови двойки с дължина. Палиндромът е поредица от букви, които се четат както напред, така и назад. (Думата “level ” е пример за палиндром.) Палиндромните ДНК последователности съдържат същите базови последователности в посока 5'до 3'на една верига, както в посока 5'до 3'на комплементарната верига. Рестрикционен ензим разпознава ДНК палиндром и отрязва всеки гръбнак на идентични позиции в палиндрома. Някои рестрикционни ензими се изрязват, за да произвеждат молекули, които имат допълнителни надвеси (лепкави краища), докато други режат, без да генерират такива надвеси, вместо да произвеждат тъпи краища (Фигура 2).

    Молекулите с допълващи се лепкави краища могат лесно отгряванеили образуват водородни връзки между комплементарни основи в техните лепкави краища. Стъпката на отгряване позволява хибридизация на едноверижните надвеси. Хибридизацията се отнася до свързването на две комплементарни единични вериги на ДНК. Тъпите краища също могат да се прикрепят заедно, но по -малко ефективно от лепкавите краища поради липсата на допълващи се надвеси, улесняващи процеса. Във всеки случай, лигиране от ДНК лигаза след това могат да се присъединят отново към двата захарно-фосфатни гръбнака на ДНК чрез ковалентно свързване, което прави молекулата непрекъсната двойна верига. През 1972 г. Пол Берг, биохимик от Станфорд, е първият, който произвежда рекомбинантна ДНК молекула, използвайки тази техника, съчетавайки вируса на маймуната SV40 с E. coli бактериофаг ламбда за създаване на хибрид.

    Фигура 2.(а) В това шест-нуклеотидно рестрикционно ензимно място, разпознато от ензима BamHI, забележете, че последователността се чете еднакво в посоката от 5 до 3 on на двете нишки. Това е известно като палиндром. Разрязването на ДНК от рестрикционния ензим на местата (означени с черните стрелки) произвежда ДНК фрагменти с лепкави краища. Друго парче ДНК, нарязано със същия рестрикционен ензим, може да се прикрепи към един от тези лепкави краища, образувайки рекомбинантна ДНК молекула. (b) Това място за разпознаване на четири нуклеотида също показва палиндромна последователност. Разрязването на ДНК от рестрикционния ензим HaeIII на посочените места произвежда ДНК фрагменти с тъпи краища. Всяко друго парче тъпа ДНК може да се прикрепи към един от получените тъпи краища, образувайки рекомбинантна ДНК молекула.

    Плазмиди

    След рестрикционно храносмилане обикновено се вмъкват интересни гени плазмиди, малки парченца типично кръгла, двуверижна ДНК, които се репликират независимо от бактериалната хромозома (вижте Уникални характеристики на прокариотните клетки). В технологията за рекомбинантна ДНК плазмидите често се използват като вектори, ДНК молекули, които пренасят ДНК фрагменти от един организъм в друг. Плазмидите, използвани като вектори, могат да бъдат генетично инженерирани от изследователи и компании за научни доставки, за да имат специализирани свойства, както е илюстрирано от често използвания плазмиден вектор pUC19 (Фигура 3). Някои плазмидни вектори съдържат гени, които дават антибиотична резистентност тези резистентни гени позволяват на изследователите лесно да намират колонии, съдържащи плазмид, като ги поставят върху среда, съдържаща съответния антибиотик. Антибиотикът убива всички клетки гостоприемници, които не съдържат желания плазмиден вектор, но тези, които съдържат вектора, могат да оцелеят и да растат.

    Фигура 3. Изкуствено конструираният плазмиден вектор pUC19 обикновено се използва за клониране на чужда ДНК. Стрелките показват посоките, в които се транскрибират гените. Обърнете внимание на полилинкерния сайт, съдържащ множество уникални сайтове за разпознаване на рестрикционни ензими, намерени в lacZ репортер ген. Обърнете внимание и на ампицилина (усилвател) ген на резистентност, кодиран върху плазмида.

    Плазмидните вектори, използвани за клониране, обикновено имат полилинкер сайт, или сайт за множествено клониране (MCS). Полилинкерният сайт е кратка последователност, съдържаща множество уникални места за разпознаване на рестрикционен ензим, които се използват за вмъкване на ДНК в плазмида след рестрикционно смилане както на ДНК, така и на плазмида. Наличието на тези множество места за разпознаване на рестрикционни ензими в полилинкерното място прави плазмидния вектор универсален, така че може да се използва за много различни експерименти за клониране, включващи различни рестрикционни ензими.

    Този полилинкер сайт често се намира в a репортер ген, друга генна последователност, изкуствено проектирана в плазмида, който кодира протеин, който позволява визуализиране на вмъкването на ДНК. Репортерният ген позволява на изследователя да разграничи клетки гостоприемници, които съдържат рекомбинантни плазмиди с клонирани ДНК фрагменти от клетки гостоприемници, които съдържат само нерекомбинантния плазмиден вектор. Най -често срещаният репортер ген, използван в плазмидните вектори, е бактериалният lacZ ген, кодиращ бета-галактозидаза, ензим, който естествено разгражда лактозата, но може също да разгради безцветен синтетичен аналог X-gal, като по този начин се произвеждат сини колонии върху среда, съдържаща X-gal. The lacZ репортерният ген е деактивиран, когато рекомбинантната ДНК се снареди в плазмида. Тъй като LacZ протеинът не се произвежда, когато генът е деактивиран, X-gal не се разгражда и се произвеждат бели колонии, които след това могат да бъдат изолирани. Това синьо-бял скрининг методът е описан по-късно и е показан на Фигура 4. В допълнение към тези характеристики, някои плазмиди идват предварително усвоени и с ензим, свързан с линеаризирания плазмид, за да подпомогне лигирането след вмъкването на чужди ДНК фрагменти.

    Фигура 4. Щракнете за по-голямо изображение. Стъпките, включени в молекулярното клониране с помощта на бактериална трансформация, са очертани в тази графична блок-схема.

    Молекулно клониране с помощта на трансформация

    Най -често използваният механизъм за въвеждане на конструирани плазмиди в бактериална клетка е трансформация, процес, при който бактериите поемат свободна ДНК от заобикалящата ги среда. В природата свободната ДНК обикновено идва от други лизирани бактериални клетки в лабораторията, свободната ДНК под формата на рекомбинантни плазмиди се въвежда в околността на клетката.

    Някои бактерии, като напр бацил spp., са естествено компетентни, което означава, че са в състояние да поемат чужда ДНК. Въпреки това, не всички бактерии са естествено компетентни. В повечето случаи бактериите трябва да бъдат изкуствено компетентни в лабораторията чрез увеличаване на пропускливостта на клетъчната мембрана. Това може да се постигне чрез химически обработки, които неутрализират зарядите върху клетъчната мембрана или чрез излагане на бактериите на електрическо поле, което създава микроскопични пори в клетъчната мембрана. Тези методи дават съответно химически компетентни или електрокомпетентни бактерии.

    Следвайки протокола за трансформация, бактериалните клетки се поставят върху среда, съдържаща антибиотик, за да инхибират растежа на много клетки гостоприемници, които не са трансформирани от плазмида, придаващ антибиотична резистентност. Техника, наречена синьо-бял скрининг след това се използва за lacZ-кодиращи плазмидни вектори като pUC19. Сините колонии имат функционален бета-галактозидазен ензим, тъй като lacZ генът е непрекъснат, без чужда ДНК, вмъкната в полилинкерното място. Тези колонии обикновено са резултат от усвоения, линеаризиран плазмид, който се религира към себе си. Белите колонии обаче нямат функционален ензим бета-галактозидаза, което показва вмъкването на чужда ДНК в полилинкерното място на плазмидния вектор, като по този начин се нарушава lacZ ген. По този начин белите колонии, получени от този синьо-бял скрининг, съдържат плазмиди с вложка и могат да бъдат допълнително скринирани, за да се характеризира чуждата ДНК. За да сте сигурни, че правилната ДНК е включена в плазмида, след това ДНК инсертът може да бъде секвениран.

    Помисли за това

    Молекулярно клониране с помощта на конюгация или трансдукция

    Бактериалният процес на спрежение (вижте Как асексуалните прокариоти постигат генетично разнообразие) също могат да бъдат манипулирани за молекулярно клониране. F плазмидиили плазмиди за плодовитост, се прехвърлят между бактериалните клетки чрез процеса на конюгиране. Рекомбинантна ДНК може да бъде прехвърлена чрез конюгиране, когато бактериални клетки, съдържащи рекомбинантен F плазмид, се смесват със съвместими бактериални клетки, които нямат плазмида. F плазмидите кодират повърхностна структура, наречена an F pilus което улеснява контакта между клетка, съдържаща F плазмид, и такава без F плазмид. При контакт се образува цитоплазмен мост между двете клетки и клетката, съдържаща F-плазмид, репликира своя плазмид, прехвърляйки копие на рекомбинантния F плазмид в реципиентната клетка. След като получи рекомбинантния F плазмид, клетката реципиент може да произведе свой собствен F pilus и да улесни трансфера на рекомбинантния F плазмид към допълнителна клетка. Използването на конюгиране за прехвърляне на рекомбинантни F плазмиди към клетки-реципиенти е друг ефективен начин за въвеждане на рекомбинантни ДНК молекули в клетките гостоприемници.

    Алтернативно, бактериофаги може да се използва за въвеждане на рекомбинантна ДНК в бактериални клетки гостоприемник чрез манипулиране на трансдукция процес (вижте как асексуалните прокариоти постигат генетично разнообразие). В лабораторията могат да бъдат конструирани фрагменти от ДНК, които представляват интерес фагемиди, които са плазмиди, които имат фагови последователности, които им позволяват да бъдат пакетирани в бактериофаги. След това бактериалните клетки могат да бъдат инфектирани с тези бактериофаги, така че рекомбинантните фагемиди да могат да бъдат въведени в бактериалните клетки. В зависимост от вида на фага, рекомбинантната ДНК може да бъде интегрирана в генома на гостоприемника (лизогения) или може да съществува като плазмид в цитоплазмата на гостоприемника.

    Помисли за това

    • Каква е първоначалната функция на рестрикционен ензим?
    • Какви два процеса се използват за получаване на рекомбинантна ДНК в бактериална клетка гостоприемник?
    • Разграничете употребите на ген за резистентност към антибиотици и репортер ген в плазмиден вектор.

    Допълнителни методи за регулиране на бактериите: Затихване и рибопревключватели

    Въпреки че повечето генна експресия се регулира на нивото на иницииране на транскрипция в прокариотите, има също така механизми за контролиране както на завършването на транскрипцията, така и на транслацията едновременно. След тяхното откриване е доказано, че тези механизми контролират завършването на транскрипцията и транслацията на много прокариотни оперони. Тъй като тези механизми свързват директно регулирането на транскрипцията и транслацията, те са специфични за прокариотите, тъй като тези процеси са физически разделени при еукариотите.

    Една такава регулаторна система е затихване, при което вторично стволови бримкови структури образувани в 5 'края на транскрибирана иРНК, определят дали ще настъпи транскрипция за завършване на синтеза на тази тРНК и дали тази тРНК ще се използва за транслация. Отвъд вече обсъдения механизъм за потискане на транскрипцията, затихването също контролира експресията на trp оперон в E. coli (Фигура 7). The trp оперонният регулаторен регион съдържа водеща последователност, наречена trpL между оператора и първия структурен ген, който има четири участъка от РНК, които могат да се сдвояват един с друг в различни комбинации. Когато се образува терминаторен стволов цикъл, транскрипцията завършва, освобождавайки РНК полимераза от иРНК. Въпреки това, когато се образува антитерминаторен стволов цикъл, това предотвратява образуването на терминаторния стволов цикъл, така че РНК полимеразата може да транскрибира структурните гени.

    Фигура 7. Щракнете, за да видите по-голямо изображение. Когато триптофанът е в изобилие, транслацията на късия лидерен пептид, кодиран от trpL продължава, терминаторният цикъл между области 3 и 4 се оформя и транскрипцията завършва. Когато нивата на триптофан са изчерпани, транслацията на късия лидерен пептид спира в регион 1, позволявайки на региони 2 и 3 да образуват антитерминаторна верига, а РНК полимеразата може да транскрибира структурните гени на trp оперон.

    Свързан механизъм на едновременна регулация на транскрипцията и транслацията при прокариотите е използването на a riboswitch, малка област на некодираща РНК, намерена в 5 ’края на някои прокариотни иРНК молекули (Фигура 8). Рибо превключвателят може да се свърже с малка вътреклетъчна молекула, за да стабилизира определени вторични структури на молекулата на иРНК. Свързването на малката молекула определя коя структура на стволовия контур се формира, като по този начин влияе на завършването на синтеза на тРНК и синтеза на протеин.

    Фигура 8. Щракнете за по -голямо изображение. Рибопревключвателите, открити в молекулите на прокариотна иРНК, могат да се свържат с малки вътреклетъчни молекули, стабилизирайки определени РНК структури, повлиявайки или завършването на синтеза на самата молекула на иРНК (вляво), или протеина, направен с помощта на тази иРНК (вдясно).


    Критично мислене

    Винаги ли биотехнологиите са свързани с генното инженерство? Обяснете отговора си.

    Кое е по-ефективно: клониране с тъп край или клониране с лепкав край? Защо?

    Да предположим, че работите в лаборатория по молекулярна биология и изпитвате затруднения при успешното провеждане на PCR. Решавате да проверите повторно PCR протокола, програмиран в термичния цикъл, и откривате, че температурата на отгряване е програмирана да бъде 65 ° C вместо 50 ° C, както сте планирали. Какви ефекти би имала тази грешка върху PCR реакцията? Вижте Фигура 12.20.

    Какво е предимството на анализа на микрочипове пред Northern blot анализа при наблюдение на промените в генната експресия?

    Каква е разликата между PCR с обратна транскриптаза (RT-PCR) и количествената PCR в реално време (qPCR)?

    Какви са някои предимства на клонирането на човешки гени в бактерии за лечение на човешки заболявания, причинени от дефицит на специфични протеини?

    Сравнете етичните въпроси, свързани с използването на генна терапия със соматични клетки и генна терапия с зародишна линия.

    Като сътрудник на Amazon ние печелим от отговарящи на условията покупки.

    Искате ли да цитирате, споделите или промените тази книга? Тази книга е Creative Commons Attribution License 4.0 и трябва да приписвате OpenStax.

      Ако разпространявате цялата или част от тази книга в печатен формат, тогава трябва да включите на всяка физическа страница следното приписване:

    • Използвайте информацията по -долу, за да генерирате цитат. Препоръчваме да използвате инструмент за цитиране като този.
      • Автори: Nina Parker, Mark Schneegurt, Anh-Hue Thi Tu, Philip Lister, Brian M. Forster
      • Издател/уебсайт: OpenStax
      • Заглавие на книгата: Микробиология
      • Дата на публикуване: 1 ноември 2016 г.
      • Местоположение: Хюстън, Тексас
      • URL адрес на книгата: https://openstax.org/books/microbiology/pages/1-introduction
      • URL адрес на секция: https://openstax.org/books/microbiology/pages/12-critical-thinking

      © 20 август 2020 г. OpenStax. Съдържанието на учебници, произведено от OpenStax, е лицензирано под лиценз Creative Commons Attribution License 4.0. Името на OpenStax, логото на OpenStax, кориците на книгите на OpenStax, името на OpenStax CNX и логото на OpenStax CNX не са предмет на лиценза Creative Commons и не могат да бъдат възпроизвеждани без предварителното и изрично писмено съгласие на Университета Райс.


      Други фактори, влияещи върху генната експресия в прокариотите и еукариотите

      Въпреки че фокусът върху нашето обсъждане на транскрипционния контрол използва прокариотни оперони като примери, еукариотният транскрипционен контрол е подобен в много отношения. Както при прокариотите, еукариотната транскрипция може да бъде контролирана чрез свързване на транскрипционни фактори, включително репресори и активатори. Интересното е, че еукариотната транскрипция може да бъде повлияна от свързването на протеини с региони на ДНК, т.нар подобрители, доста далеч от гена, чрез улесняване на цикъла на ДНК между усилвателя и промотора (Фигура 9). Като цяло, регулирането на транскрипцията е високоефективен начин за контрол на генната експресия както при прокариотите, така и при еукариотите. Контролът на генната експресия в еукариотите в отговор на околния и клетъчния стрес може да се осъществи по допълнителни начини без свързването на транскрипционните фактори с регулаторните региони.

      Фигура 9. При еукариотите усилвателят е ДНК последователност, която насърчава транскрипцията. Всеки подобрител се състои от къси ДНК последователности, наречени дистални контролни елементи. Активаторите, свързани с дисталните контролни елементи, взаимодействат с медиаторни протеини и транскрипционни фактори. Два различни гена могат да имат един и същ промотор, но различни дистални контролни елементи, което позволява диференцирана генна експресия.

      Контрол на нивото на ДНК

      При еукариотите ДНК молекулите или свързаните хистони могат да бъдат химически модифицирани по такъв начин, че да повлияят на транскрипцията, това се нарича епигенетична регулация. Доказано е, че метилирането на определени цитозинови нуклеотиди в ДНК в отговор на фактори на околната среда влияе върху използването на такава ДНК за транскрипция, с ДНК метилиране обикновено корелира с понижените нива на генна експресия. Освен това, в отговор на факторите на околната среда, хистон протеините за опаковане на ДНК също могат да бъдат химически модифицирани по много начини, включително ацетилиране и деацетилиране, влияещо върху състоянието на опаковката на ДНК и по този начин въздействайки върху наличието на свободно намотана ДНК за транскрипция. Тези химически модификации понякога могат да се поддържат чрез множество кръгове на клетъчно делене, което прави поне някои от тези епигенетични промени наследствени.

      Това видео описва как епигенетичната регулация контролира генната експресия.

      Помисли за това

      • Какво спира или позволява транскрипцията да продължи, когато затихването работи?
      • Какво определя състоянието на рибопревключвателя?
      • Опишете функцията на подобрител.
      • Опишете два механизма на епигенетична регулация при еукариотите.

      Клиничен фокус: Травис, резолюция

      Въпреки че Травис оцеля след битката си с некротизиращ фасциит, сега той ще трябва да се подложи на операция по присаждане на кожа, последвана от дългосрочна физиотерапия. Въз основа на количеството мускулна маса, която е загубил, е малко вероятно кракът му да се върне към пълната си сила, но физиотерапевтът му е оптимист, че той ще си възвърне известна употреба на крака.

      Лабораторните изследвания показват, че причинителят на инфекцията на Травис е щам на стрептокок от група А (стрептокок от група А). Както се изисква от закона, случаят на Травис е докладван на държавния здравен департамент и в крайна сметка на Центровете за контрол и превенция на заболяванията (CDC). В CDC щамът на стрептокок от група А, изолиран от Travis, беше анализиран по -задълбочено за резистентност към метицилин.

      Резистентността към метицилин е генетично кодирана и става все по -разпространена в стрептокок от група А чрез хоризонтален трансфер на гени. При некротизиращ фасциит притока на кръв към заразената област обикновено е ограничен поради действието на различни генетично кодирани бактериални токсини. Ето защо обикновено има малко или никакво кървене в резултат на теста за разрез. За съжаление, тези бактериални токсини ограничават ефективността на интравенозните антибиотици за изчистване на инфекцията от кожата и подлежащата тъкан, което означава, че само антибиотичната резистентност не обяснява неефективността на лечението на Травис. Независимо от това, интравенозната антибиотична терапия е оправдана, за да помогне за минимизиране на възможния изход от сепсис, който е често срещан резултат от некротизиращ фасциит. Чрез геномен анализ от CDC на щама, изолиран от Travis, е показано, че няколко от важните гени на вирулентност са кодирани върху профаги, което показва, че трансдукцията е важна при хоризонталния трансфер на гени от тези бактериални клетки в други.

      Основни концепции и обобщение

      • Генната експресия е строго регламентиран процес.
      • Генната експресия в прокариотите е до голяма степен регулирана в точката на транскрипция. Генната експресия в еукариотите се регулира допълнително след транскрипция.
      • Прокариотните структурни гени със сродна функция често са организирани в оперони, всички контролирани чрез транскрипция от един промотор. Регулаторният регион на оперон включва самия промотор и района около промотора, към който транскрипционните фактори могат да се свържат, за да повлияят на транскрипцията.
      • Въпреки че някои оперони са конститутивно изразени, повечето подлежат на регулиране чрез използването на транскрипционни фактори (репресори и активатори). А репресор се свързва с an оператор, ДНК последователност в регулаторния регион между мястото на свързване на РНК полимераза в промотора и първия структурен ген, като по този начин физически блокира транскрипцията на тези оперони. Ан активатор се свързва в рамките на регулаторния регион на оперона, като помага на РНК полимеразата да се свърже с промотора, като по този начин се засилва транскрипцията на този оперон. Ан индуктор влияе върху транскрипцията чрез взаимодействие с репресор или активатор.
      • The trp оперонът е класически пример за a потискащ се оперон. Когато триптофанът се натрупва, триптофанът се свързва с репресор, който след това се свързва с оператора, предотвратявайки по-нататъшната транскрипция.
      • The лак operon е класически пример индуцируем оперон. Когато лактозата присъства в клетката, тя се превръща в алолактоза. Алолактозата действа като индуктор, свързващ се с репресора и предотвратявайки свързването му с оператора. Това позволява транскрипция на структурните гени.
      • The лак оперонът също подлежи на активиране. Когато нивата на глюкозата се изчерпят, някои клетъчни АТФ се превръщат в сАМР, който се свързва с протеин активатор на катаболит (CAP). cAMP-CAP комплексът активира транскрипцията на лак оперон. Когато нивата на глюкозата са високи, нейното присъствие предотвратява транскрипцията на лак оперон и други оперони от потискане на катаболитите.
      • Малки вътреклетъчни молекули, наречени аларми са направени в отговор на различни стресове на околната среда, което позволява на бактериите да контролират транскрипцията на група оперони, наречени регулон.
      • Бактериите имат способността да променят кои σ фактор на РНК полимераза, която те използват в отговор на условията на околната среда, за да променят бързо и глобално кои регулони се транскрибират.
      • Прокариотите имат регулаторни механизми, включително затихване и използването на рибосключове, за да контролира едновременно завършването на транскрипцията и превода от този препис. Тези механизми работят чрез образуването на стволови бримки в 5 ’края на молекулата на иРНК, която се синтезира в момента.
      • Има допълнителни точки за регулиране на генната експресия при прокариоти и еукариоти. При еукариотите, епигенетична регулация чрез химическа модификация на ДНК или хистони и регулиране на обработката на РНК са два метода.

      Множествен избор

      Кой от следните е оперон на гени, кодиращи ензими в биосинтетичен път?

      [reveal-answer q=�″]Показване на отговора[/reveal-answer]
      [hidden-answer a=�″]Отговор б. Оперон от гени, кодиращи ензими в биосинтетичен път, вероятно ще бъде потискан. [/Hidden-answer]

      За оперон, кодиращ гени, които се транскрибират и транслират непрекъснато, за да осигурят на клетката постоянни междинни нива на протеинови продукти, се казва, че кое от следните?

      [разкриване-отговор q = � ″] Показване на отговор [/разкриване-отговор]
      [скрит отговор a = � ″] Отговор c. Този тип оперон се казва конститутивен. [/Hidden-answer]

      Кое от следните условия води до максимално изразяване на лак оперон?

      1. присъства лактоза, липсва глюкоза
      2. налична лактоза, налична глюкоза
      3. липсва лактоза, липсва глюкоза
      4. лактоза отсъства, глюкоза присъства

      [reveal-answer q=�″]Показване на отговора[/reveal-answer]
      [скрит отговор a = � ″] Отговор a. Наличието на лактоза и липсата на глюкоза води до максимална експресия на лак оперон. [/Hidden-answer]

      Кое от изброените е вид регулация на генната експресия, уникална за еукариотите?

      1. затихване
      2. използване на алтернативен σ фактор
      3. химична модификация на хистони
      4. аларми

      [reveal-answer q=�″]Показване на отговора[/reveal-answer]
      [hidden-answer a = � ″] Отговор c. Химическата модификация на хистоните е вид регулация на генната експресия, уникална за еукариотите. [/Hidden-answer]

      Попълнете празното пространство

      ДНК последователността, към която могат да се свържат репресорите, която се намира между промотора и първия структурен ген, се нарича ________.
      [reveal-answer q=�″]Показване на отговора[/reveal-answer]
      [hidden-answer a = � ″] ДНК последователността, към която могат да се свържат репресорите, която се намира между промотора и първия структурен ген, се нарича оператор. [/hidden-answer]

      Предотвратяването на експресията на оперони, кодиращи пътища за използване на субстрати за субстрати, различни от глюкоза, когато присъства глюкоза, се нарича _______.
      [reveal-answer q=�″]Показване на отговора[/reveal-answer]
      [hidden-answer a = � ″] Предотвратяването на експресията на оперони, кодиращи пътища за използване на субстрат за субстрати, различни от глюкоза, когато присъства глюкоза, се нарича катаболитна репресия. [/hidden-answer]

      Помисли за това

      1. Кои са два начина, по които бактериите могат да повлияят на транскрипцията на множество различни оперони едновременно в отговор на определено състояние на околната среда?
      2. Следващата фигура е от оригиналната работа на Monod за диауксичния растеж, показваща растежа на E. coli при едновременно присъствие на ксилоза и глюкоза като единствени източници на въглерод. Обяснете какво се случва в точки A–D по отношение на източника на въглерод, който се използва за растеж, и обяснете дали оперонът за използване на ксилоза се изразява (и защо). Обърнете внимание, че експресията на ензимите, необходими за употребата на ксилоза, се регулира по начин, подобен на експресията на ензимите, необходими за употребата на лактоза.


      Гледай видеото: Программа 227 Биологическое разнообразие (Декември 2022).