Информация

Защо трябва да използвате температура на отгряване около 5 ° C под Tm на вашите грундове?

Защо трябва да използвате температура на отгряване около 5 ° C под Tm на вашите грундове?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Защо трябва да използвате температура на отгряване около 5°C под Tm на вашите грундове?

Според текущите ми изследвания, мисля, че има нещо общо с другите реактиви в PCR, но не съм сигурен.


Искате да имате праймери, които се свързват при условията на реакцията само с вашата последователност, която ви интересува. Ако отидете твърде далеч от оптималната температура на отгряване (5 ° C под Tm наистина е сравнително добър избор според моя опит), това ще повлияе на ефективността на PCR и по този начин на добив на вашата реакция.

Температурата на отгряване, която е твърде ниска, позволява отгряване на вашите грундове на други места, освен предвидената ви цел с частично отгряване или вътрешни несъответствия на основата. Това води до неспецифично усилване и по -ниски добиви.

Ако температурата на отгряване е твърде висока, не може да се случи свързване на праймера и няма да получите PCR продукт. Като алтернатива, частичното свързване също може да доведе до неправилно отпечатани продукти, въпреки че това е много по -малко вероятно, отколкото изобщо да не получите продукт.


Температурата на отгряване на праймера се определя като температурата, при която 50% от нуклеотидите на праймера са свързани с ДНК. 50% съотношение на отгряване няма да даде оптимален PCT продукт. По този начин, чрез понижаване на температурата с около 5oC, делът на свързания грунд се променя на повече от 50% (може би около 70 - 80%), като по този начин се получава по -точен добив.

Ето защо изваждаме 5oC от теоретичната температура на отгряване.


Значението на температурата на топене в приложенията на молекулярната биология

Научете как да предскажете и изберете подходящи температури на топене за етапите на олиго хибридизация, включително PCR.

Температурата на топене на олигонуклеотиден дуплекс или Т.м, е температурата, при която половината от олигонуклеотидните молекули са едноверижни, а половината са двуверижни, т.е. олигонуклеотидът е 50% отгряван до неговия точен комплемент. Tм е критичен параметър, който трябва да се вземе предвид при проектирането и извършването на много експерименти по молекулярна биология, включително PCR и qPCR.

Избор на температура на топене на грунда

Точна прогноза за Tм идентифицира дуплекси, които е вероятно да се образуват при специфични температури, което ви позволява да определите подходящи параметри за термично циклиране. По време на фазата на отгряване на PCR реакционната температура трябва да бъде достатъчно ниска, за да позволи както на предните, така и на обратните праймери да се свържат към шаблона, но не толкова ниска, че да позволи образуването на нежелани, неспецифични дуплекси или вътрешномолекулярни фиби, и двете които намаляват ефективността на реакцията. И двата праймера в PCR трябва да бъдат избрани да имат подобен Tм. IDT препоръчва да се избере температура на отгряване 5 & ndash7 & degC под най -ниския грунд Tм.

Избор на температура на топене на сондата

Проектирането на qPCR анализи с двойно маркирани сонди също изисква внимателна координация на праймера Тм. Когато температурата на реакцията се понижи от денатуриране до отгряване по време на цикъл, сондата трябва първо да отгрее до целта. Ако сондата се свърже с мишената по едно и също време или след свързването на праймерите, полимеразата може да започне репликация на мишената, която не съдържа свързана сонда. В резултат на това нова ДНК ще бъде синтезирана без свързано разграждане на сондата и следователно няма да бъде открита като увеличаване на флуоресценцията. Такава ситуация води до неточни данни. За стандартен qPCR, IDT препоръчва сонда, която има Tм 5 & ​​ndash10 & degC по -високо от Tм на праймерите.

Проверете отново публикувания Tм данни

Важно е да проверите Т.м на всички олигонуклеотидни последователности, използвани в PCR, дори когато преди това успешен набор от праймери и проби е взет директно от публикация. Дизайнът на такива публикувани последователности може да включва Tм подобрители като незначително свързващо вещество или заключени основи на нуклеинова киселина. Тези Тм подобрители не са необходими за анализ на генната експресия. Немодифицираните набори от сонди и праймери, които осигуряват надеждни, точни данни, могат да бъдат проектирани за същите цели без допълнителни разходи за ненужни модификации.

Предсказване на Тм

Кой е най-добрият и лесен начин да се предскаже Tм? Инструментът OligoAnalyzer от IDT, намерен в раздела за приложения на SciTools на нашия уебсайт, е резултат от продължаващи изследвания и иновации. Той взема предвид ефектите от концентрациите на олигонуклеотид, катион, dNTP и сол, олигонуклеотидна последователност и взаимодействия на най-близкия съсед. Отчитането на всички тези фактори позволява точно прогнозиране на олигонуклеотид Тм специфични за вашите реакционни условия [1]. За повече информация относно изчисленията и алгоритъма, използвани от инструмента OligoAnalyzer, вижте техническия доклад IDT, Изчисление на Tм за олигонуклеотидни дуплекси.


Протокол

Настройка на реакцията:

Добавете към стерилна тънкостенна PCR епруветка:

Съставна част 25 & микрона
Реакция
50 и микрона
Реакция
Финал
Концентрация
5X EpiMark & ​​reg Hot Start
Taq Реакционен буфер
5 &микрол 10 & микрона 1X
10 mM dNTPs 0,5 и микрона 1 & микрона 200 & microM
10 & microM преден грунд 0,5 & микрол 1 & микрона 0,2 & microM
(0,05-1 & microM)
10 & microM Обратен грунд 0,5 и микрона 1 & микрона 0,2 & microM
(0,05-1 µM)
EpiMark ® Hot Start Taq
ДНК полимераза
0,125 & микрол 0,25 & микрол 1,25 единици/
50 & микрона PCR
Шаблонна ДНК променлива променлива & lt 1000 ng
Вода без нуклеази до 25 & микрол до 50 & microl

Забележки: Внимателно смесете реакцията. Съберете цялата течност до дъното на епруветката чрез бързо завъртане, ако е необходимо. Покрийте пробата с минерално масло, ако използвате PCR машина без нагрят капак.

Прехвърлете PCR епруветките в цикъл и започнете термоциклирането:

Условия за термоциклиране за рутинна PCR:

Първоначална денатурация:
95°C 30 секунди

35-40 цикъла:
95 & degC 15 & ndash 30 секунди
45 & ndash68 & degC 15 & ndash 60 секунди
68°C 1 минута на kb

Окончателно удължаване:
68 ° С 5 минути


Грундове TM - (24 юни 2007 г.)

здравей
при оптимизиране на продуктите за PCR използвам Температура на отгряване, която е над или под ТМ на грунда, но един от колегите ми каза, че не трябва да използвам отгряване по -високо от TM ! ! ! !
вярно ли е ? и защо ?

Температурата на отгряване трябва да бъде под tm.

Tm е температурата, при която половината от вашите грундове се отгряват към тяхната допълнителна нишка (шаблон). Над tm и получавате по-малко от половината. И колкото по -малко молекули сте отгряли в шаблона, толкова по -ниски ще бъдат вашите PCR добиви.

Вярно е обаче, че понякога получавате още по -добър продукт с отгряване по-висок отколкото грундове Tm по някои причини.
И моят колега ми каза, че някои анализи дори изискват по -високи температури, за да работят оптимално. Но това не е общо ръководство.
Обикновено опитвам класически 4 градуса под Tm (преброени от primer3) като първо попадение и след това допълнително оптимизиране.
Задайте отгряване в диапазон от по-ниски температури до тези, близки до Tm и ако видите спад в количеството или качеството на продукта, просто изберете най-добрата температура. Но ако зададете това и продуктът изглежда все по-добър и по-добър, тогава продължете с по-висока температура, както желаете.
Но като цяло опитайте само тези под Tm.

Моето разбиране беше, че зависи от ензима и размера на праймера. Също така има няколко различни начина за изчисляване на Tm. Отивам на уебсайта на грунда, който използвам, и изчислявам грунда Tm по техния метод, след което използвам продуктовата вложка, за да определя температурата на отгряване, която ще използвам.

Всъщност това е малко преувеличение- просто използвам стандартния си цикъл на PCR с температура на отгряване 53 ° C и ако това не работи, тогава започвам да се занимавам с температурата на отгряване

Здравейте, най -лесният начин да намерите оптималната температура на отгряване е да направите градиентна PCR. Понякога оптималната температура на отгряване може да бъде по -висока от Tm. Например, Tm на една двойка мои праймери беше около 55 ° С. Но оптималната температура на отгряване е действително 58.8C, както е показано от градиентния PCR. Така че, аз избрах 58.8 за температура на отгряване и получих много добри резултати.

Когато температури под Tm не работят правилно, аз също правя градиентна PCR, имам предвид. Настроих PCR да повишава температурата на отгряване във всеки цикъл. И в повечето случаи решава проблема.
Но аз също имам въпрос. когато правите това, как да разберете коя е оптималната TM. защото машината увеличава температурата всеки път. Не е ли лесно да разберете за това?

Мисля, че това, което визирате, е тъчдаун PCR, който е различен от градиентния PCR. С градиентен PCR вие настройвате всяка колона от ямки/позиции във вашата PCR машина на определена температура, след което, когато пускате продукти върху гел, за да определите кой от тях е работил, ще запишете каква позиция в машината е била тази тръба- и това е вашата оптимална температура.

може ли да ми кажете как да направя градиентна PCR?
и какъв тип pCR устройство може да го направи?

Използвам PCR цикъл, програмиран на нашия Biorad icycler, създаден от друг член на лабораторията, така че всъщност не знам как да го настроя от нулата. Можете да опитате да се консултирате с ръководството на вашата машина или да говорите с представител на компанията, която го е направила??


Температури на отгряване на грунда - (21 август 2012 г.)

Имам две различни температури на отгряване за моите грундове (59 и 55). При каква температура на отгряване трябва да настроя, когато съм в PCR, когато използвам този комплект праймери?

Използвам този сайт за изчисляване на Tm:
http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx
Наоколо има много алгоритми, водещи до различни резултати. С Tms, определен тук, вземам средната - 5 oC за отгряване, когато използвам Taq полимераза (30-секундна стъпка на отгряване)
Внимавайте, че ако имате надвеси (допълнителни последователности, които искате да добавите към вашата последователност чрез PCR), трябва да изчислите Tm само за съвпадащата част от праймерите. За тази цел използвам Phusion: по-високо Tm на двата праймера (съвпадаща последователност) + 5°C докосване -0,7°C / цикъл 15 сек стъпка на отгряване това за 14 стъпки, последвани от още 6 стъпки, за които имате: по-ниско Tm на двата праймера (изчислете Tm за пълна последователност) (15 сек на стъпка)

Твърде сложно за мен. Отгрявам при 55С.

Започнете с 55, ако продуктът при неспецифично повишаване на температурата на отгряване с 2 градуса наведнъж. това трябва да работи

Стъпка 1: отгряване на 55
Стъпка 2: (по избор) направете градиентно PCR отгряване от 50-68
Стъпка 3: Изхвърлете грундовете, преработете грундове.

Животът е твърде кратък, за да се справяме с незначителни букви.

Обикновено го правя ..
Стъпка 1: отгряване на 60
Стъпка 2: 5% DMSO
Стъпка 3: забравих .. отдавна

защо редизайн грундове? това са идеално добри грундове. Веднъж направих PCR с праймери, единият на 46, а другият на 71 (дълга история, но не можах да ги проектирам по-добре, независимо какво направих, и се борих доста). Работи перфектно. но аз съм с твърде сложна програма за PCR Проектирането на праймери със същата температура на отгряване е толкова старомодно. Това, което PCR циклерите могат да направят днес за вас заедно с това, което знаем за PCR, може лесно да реши проблема с PCR с различни температури на отгряване. И между другото: 4 градуса е нищо.

Аз също съм за градиентното отгряване, предложено от phage434. Не всички лаборатории обаче инвестират в такава функция на PCR машината. (моята сегашна лаборатория със сигурност не инвестира в тази опция, без значение колко пъти плаках за нея) Но ако вашата PCR машина може да прави градиент или тъч-надолу: научете се как да ги използвате, те ще ви спасят живота.

@ascacioc
Бихте ли могли да споделите програмата, която тогава сте използвали, за да накарате грундовете да работят? Никога не съм нарушавал препоръчителната разлика от 2 градуса, дори когато имах някои доста ужасни последователности (но работя върху неекстремни GC% шаблони), така че да видя различен подход би било интересно. Благодаря.

Ще публикувам тук целия протокол на Phusion, който използвам от mastermix до агарозен гел:
1. Поставяне върху лед в епруветка от 0,2 mL mastermix за PCR съгласно таблицата
По-долу. Размразете всички неензимни компоненти при стайна температура, разбъркайте чрез късо завихряне и съберете
чрез кратко центрофугиране.
mastermix:
(75 & muL разделени на 6x 12.5 & muL)
-плазмиден шаблон
(последователност или степен на колона
плазмиден препарат)
x & muL (5 ng / 1 kb плазмиден шаблон)
-MilliQ H2O
(Качество на PCR = автоклавирано в бутилка, която се изплаква няколко пъти с MilliQ, защото никога не знаете кой е направил разтвора на Mn/Mg сол в тази бутилка преди вас, след като имам бутилка, на която мога да се доверя, винаги използвам една и съща бутилка за приготвяне на PCR вода през цялото време)
47,75 &muL - x &muL плазмиден шаблон
-5x HF буфер 15 &muL
(последен 1x)
-X_fwd грунд
(5 &muM)
6 & muL
(крайни 400 nM)
-X_rev грунд
(5 &muM)
6 &muL
(окончателни 400 nM)
-dNTP-микс
(10 mm всеки)
1,5 &muL
(крайни 0,2 тМ всеки нуклеотид)
-Фюзия
(2 U/&muL)
0,75 & muL
(крайни 0,02 U/&muL)

2. Разделете mastermix на 6x 12.5 & muL и пуснете всички проби в PCR цикъл, като използвате
температурен градиент от 10 ° C (използвайте колони 1, 4, 6, 7, 9, 12, използвайте цикъла
меню с опции за изчисляване на съответните температури). (това е за PCR машината Eppendorf тази за 96 проби с включен градиент проверете как работи вашата машина)

PCR програма (' ' означава сек и ' означава мин):
(20 цикъла 105°C (работи и с 99°C) нагряван капак и настроен на ПАУЗА)
ID & ndash първоначална денатурация 30 & rsquo & rsquo 98 & degC
D & ndash денатурация 5 & rsquo & rsquo 98 & degC
A & ndash отгряване 15 & rsquo & rsquo = по -висок Tm на двата праймера + 5 & degC
градиент +/- 5 & degC
докоснете надолу -0,7 & degC / цикъл
(изчислете Tm за съвпадаща последователност)
http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx
E &ndash разширение 15&rsquo&rsquo /1 kb 72°C
върнете се към стъпка 2 и повторете 13 пъти
D &ndash денатурация 5&rsquo&rsquo 98°C
A & ndash отгряване 15 & rsquo & rsquo = по -нисък Tm на двата праймера
(изчислете Tm за пълна последователност)
http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx
E &ndash разширение 15&rsquo&rsquo / 1 kb 72°C
FE &ndash окончателно разширение 3&rsquo 72°C върнете се към стъпка 5 и повторете 5 пъти
S & ndash съхранение 8 & degC
3. Заредете всички проби в 0.8 % SB агарозен гел (7.5 V/cm 40 min) (за мен SB буферът за работа на агарози е идеалният буфер TAE е древен буфер, разработен, защото по онова време те не познаваха по-добре от Tris .Но това е съвсем различна история. Проверете за оптимална температура на отгряване сред вашите 6 проби и повторете PCR с тази температура, ако е необходим още продукт.

КАТО: при повтаряне на PCR никога не използвайте повече от 20 uL на 200 uL епруветка.

Това се нарича Phusion-never fail PCR и е разработено от моя ръководител по време на магистърска теза, д-р Александър Шенк. Насладете се на PCRs

Малка забележка: тъй като в настоящата ми лаборатория нямам градиентна PCR машина, пропускам градиента и той все още работи, просто използвайте средните температури, както е описано в протокола. Все пак моят PCR никога не се проваля :)


Защо трябва да използвате температура на отгряване около 5 ° C под Tm на вашите грундове? - Биология

Дай ми Р! P! Дай ми С! ° С! Дайте ми R! R! Какво получавате? Много и много копия на ДНК! ОБИЧАМ протеините & ndash, затова говоря най -много за тези & ndash, но за да стигнете до протеините, имате нужда от ръководство за инструкции, така че ДНК трябва да предоставите. Всички на борда на ДНК Pol влака, с PCR (полимеразна верижна реакция) ръководство за оцеляване, за да запълни мозъка ви! PCR е друга фундаментална техника, която & rsquos става решаваща за съвременната биохимия (и дори съвременната медицина!) Тя ни позволява да правим много копия на специфични области на ДНК, което ни позволява да погледнем по -отблизо и да отговорим на въпроси като: & ldquohow жаба е свързана с куче? , & rdquo & ldquoи има ли мутация в този ген, причиняващ това заболяване?, & rdquo и & ldquois присъства този вирусен ген, показващ инфекция? & rdquoТова също ни позволява (след като направим много копия на протеинова рецепта) да залепим ДНК в клетките, за да ги накараме да направят протеини, които искаме! И така, как работи? (И как да го накарам да работи, ако не & rsquot иска & hellip)

Инструкциите за създаване на протеини (дълги вериги от аминокиселинни букви, които се сгъват в хладни форми и действат като молекулярни работници) са написани на различен биохимичен език & ndash ДНК. Участъци от ДНК, които съдържат & ldquoprotein рецепти & rdquo, се наричат ​​& ldquogenes & rdquo и тъй като генетичният код е универсален, можете да залепите този ген към & ldquoany & rdquo клетката и тази клетка & rsquos рибозоми (машини за производство на протеини) ще & ldquounderstand & rdquo и ще направи съответния протеин. По подобен начин, ако знаете какви гени има един организъм (включително човек), можете да знаете какви протеини произвеждат, дали имат мутирали версии на някои гени, как се отнасят към други организми.

И така, ДНК & rsquos са наистина важни и донякъде харесват как бихте могли да харесате вашата маса IKEA, но не обичате особено ръководството с инструкции, но имате нужда от него, за да разберете по -добре протеините, често трябва да се справям с техните инструкции за ДНК и да правя това трябва да направя много копия на специфични участъци от ДНК и за щастие PCR предоставя начин! Откриването на PCR се приписва на Кари Мълис (работещ за биотехнологична фирма, наречена Cetus Corporation), който получи първите проблясъци от него през 1983 г. и го публикува като законна техника през 1985 г. (и през 1993 г. спечели Нобелова награда за нея).

Както при почти всички & ldquobreakthrough & rdquo научни открития, той не би могъл да го направи без работата на безброй други учени, работещи преди него. (и не бихме могли да свършим работата, която вършим днес, без работата на него и другите!).

Например сцената беше поставена отчасти от Артър Корнберг, който спечели Нобелова награда за откриване на ензим (ускорител на реакцията отгоре), който може да копира ДНК, използвайки единична верига от букви на ДНК (дезоксинуклеотиди (dNT)) като шаблон за свързване (полимеризиране) на &ldquoпротивоположни&rdquo букви в допълнителна верига (която след това може да се използва като шаблон за пресъздаване на тази оригинална шаблонна последователност благодарение на &ldquoпротивоположността&rdquo 1:1 на ДНК буквите (повече по-долу). Той нарече този ензим ДНК полимераза (DNA Pol ) и той би могъл да го накара да направи единични допълващи се копия на ДНК, но приносът на Mullis & rsquo използва този ДНК Pol за направата на много и много копия.

И все още го правим. Но обикновено използваме супер издръжливи версии на DNA Pol, които могат да издържат на високите температури, през които ги циклираме в процеса, за който ще ви разкажа. И този избор на полимераза е само едно решение, което трябва (искам да кажа) да вземете, когато отидете в машината за копиране на ДНК! Така че се надяваме, че днешната публикация&rsquos ще ви помогне да изгладите рутината си. Ще започна с преглед на това как работи (така че се надявам да не е прекалено жаргонистично), но след това ще вляза в някои подробности за тези, които ги искат. (предварително се извинявам за форматирането &ndash редовен студент, който прави лабораторни работи на пълен работен ден&hellip) Така че нека&rsquos да тръгваме!

ДНК (дезоксирибонуклеинова киселина) е биохимичният език на нашата генетична информация&rsquos, написан на &, азбуката му се състои от 4 дезоксинуклеотидни (dNT) &ldquobuo,&rdquo A, T, C, & G, които имат &ldquogeneric&rdquopharibose част, съставена от захар дезокси ) закачен на & ldquoleft рамото & rdquo (позиция 5 & rsquo) има хидроксилна (-OH) група като & ldquoleft крак & rdquo (позиция 3 & rsquo) & amp, след което различните букви имат различни & ldquon атрогенни бази & rdquo (бази), които изпъкват като & & rdquo частите с едно или две пръстени.

dNTs използват своите общи части, за да се свържат заедно чрез фосфодиестерни връзки, за да образуват дълга едноверижна ДНК (ssDNA) и 2 комплементарни единични вериги &ldquozip заедно&rdquo, използвайки техните уникални базови части (A през T, C през G), за да образуват двуверижна ДНК ( dsDNA). Тази двойна нишка го предпазва от повреда (основите са обърнати навътре) и позволява лесно копиране, тъй като ако го разкопчаете, една нишка може да се използва като шаблон за направата на друга.

Това & ldquounzip и копиране & rdquo е това, което се случва в репликацията & ndash, преди клетката да се раздели, тя трябва да копира цялата си ДНК (целия си геном), така че да може да предаде пълен набор на всяка дъщерна клетка и прави това с помощта на ДНК Pol, който обединява свободно роуминг нуклеотидите, като държи правилните заедно и им помага да се свържат, като същевременно отхвърля грешните (тези, които не се допълват взаимно (напр. Не & rsquot нека A свързва C!)

PCR (полимеразна верижна реакция) е начин да се извърши този процес в (наистина малка) епруветка и копира само малка част от ДНК, която ние определяме с помощта на PRIMERS. Праймерите са къси парчета ДНК (олигонуклеотиди или & ldquooligos & rdquo), които проектираме за & ldquobookend & rdquo нашия регион на интерес (AMPLICON). Така че, за всяка реакция ние проектираме и поръчваме различни грундове (за щастие те са & ескворе евтини!)

Нуждаем се от тези праймери, защото DNA Pol може & rsquot да започне изграждането на веригата от нулата & ndash, тя трябва да започне от кратко двойно разтягане. Това е само едно от неговите ограничения (но понякога ограниченията могат да бъдат добри! Вие не искате клетките да копират ДНК произволно!) Друго негово ограничение е, че може да копира ДНК само в една посока (5&rsquo до 3&rsquo). Преди да стигнем твърде далеч, нека&rsquos се уверим, че&rsquore NSYNC&hellip (момиче от 90-те, съжалявам!)

Свързването на буквите е & ldquogeneric & rdquo, защото включва само частите & ldquobackbone & rdquo, които всички букви имат (фосфодиестерните връзки включват сливане на фосфат и хидроксил), така че можете да свържете букви в произволен ред (например ATTACA или CAAATT). Но ципирането на нишката е специфично, защото се случва чрез взаимодействие на уникалните бази. Така че & ldquoopposite & rdquo на ATTACA е TAATGA, което е различно от GTTTAA. Но писането на противоположностите по този начин е малко подвеждащо, защото трябва да четете в обратна посока.

Ако имате ATTACA и залепите допълнителните букви срещу него, получавате следното:

НО & ndash dsDNA е АНТИПАРАЛЕН & ndash това означава, че нишките се движат в противоположни посоки (едната е 5 & rsquo- & gt3 & rsquo, а другата е 3 & rsquo- & gt5 & rsquo с & lsquo произнесено & ldquoprime & rdquo и отнасящо се & rsquo & rsquo от този край&rsquos захарта е безплатна). Така

И обикновено пишем последователности от 5&rsquo до 3&rsquo, така че &ldquoдопълнителната последователност&rdquo до 5&rsquo ATTACA 3&rsquo е 5&rsquo AGTAAT 3&rsquo

Това може да изглежда като обикновена техника, но в действителност е наистина важно! Тъй като DNA Pol може да копира ДНК само в една посока, 5 & rsquo до 3 & rsquo, и винаги трябва да имате предвид по кой начин се движат & ldquotrain следите & rdquo

ЖП линии? Това е друга моя странна аналогия &ndash обичам да мисля за нуклеотидите като влакови коловози и ДНК Pol като влак. Този влак може да се движи само по двуверижен коловоз, така че трябва да положи коловоза пред себе си, докато върви (и той знае каква коловоза да положи, като го направи &ldquomatch&rdquo от другата страна на коловоза (напр. ако следващият коловоз срещу него (от другата нишка) е Т, поставете А) .При PCR праймерите осигуряват началните станции за влака (тъй като ДНК Pol се нуждае от двойна верига, за да стартира, той & rsquoll започва само там, където го правите двуверижен (но по -къса от другата нишка, така че има още неща за копиране. По принцип искате нещо подобно:

PCR се провежда в цикли от 1 ️ ⃣ MELT (нагряване на dsDNA за разкопчаване на нишките) 2 ️ ⃣ ANNEAL (леко се охлажда, за да позволи на праймерите да се свържат и 3 ️ ⃣ EXTEND (започвайки там, където праймерите остават, добавете нуклеотиди, комплементарни на нишката на шаблона, докато стигнете до края на нишката на шаблона). След първия цикъл (където Pol отива, докато изтича пара или изтича времето), този край се определя от друга верига & rsquos праймер, защото ДНК може само да го * копира * не може да &ldquoкомпозира&rdquo, така че&rsquoll ще избяга от пистата, съответстваща на позицията, от която нишката е започнала да се копира в 1-ви кръг. (по-лесно за обяснение на снимки)

Правите това над & над 🔁 (30 или повече пъти), за да получите много копия (всеки път, когато получавате 2 пъти повече копия, защото всяка нова нишка става друга нишка шаблон).

Може да звучи като тон работа & ndash и за молекулите е така! & ndash, но за нас, след като настроим реакцията, най -трудната част е просто да чакаме да приключи! Не за Mullis, обаче & hellip It & rsquos & ldquoeasy & rdquo тези дни, защото имаме машини, наречени термични цикли, които извършват бързото нагряване и охлаждане и отопление и охлаждане и отопление и охлаждане и & hellip

Но тези машини не се появиха на сцената до 1987 г. (и разбира се, не всяка лаборатория можеше да си ги позволи и т.н.), така че в началото учените ще прехвърлят ръчно реакционните тръби от една водна баня в друга отново и отново.

Реакцията за свързване на нуклеотиди заедно (нуклеотидна полимеризация) е една и съща, независимо дали това се случва във вашите клетки или в епруветката. Същото е и за РНК (но използва различен Pol). но тук ще говорим с ДНК термини. Така че реакцията приема 2 дезоксинуклеотидни трифосфати (dNTPs) (имат 3 фосфатни (PO ₄ & sup3 ⁻) групи, свързани заедно) и ги свързват. И когато го направи, изритва 2 от тези фосфати като молекула пирофосфат (PPi)

Така че, същият процес & ldquoin vivo & rdquo (в тялото) и & ldquoin vitro & rdquo (в изкуствена среда като епруветка), НО в клетките има много помощници, докато при PCR процесът е лишен до нуждите си:

🔹 ШАБЛОННА ДНК: dsDNA, съдържаща последователността, която искате да копирате (амплифицирате)

🔹 ПРИМЕРИ: къса ssDNA, допълваща краищата на ампликона (1 да служи като начален сайт за всяка нишка)

🔹dNTPS: нуклеотидни градивни блокове (букви) за добавяне

🔹BUFFER: течна комбинация от соли и усилватели на рН стабилизатори, за да поддържа всичко щастливо

🔹Mg & sup2 ⁺: магнезиев катион (➕ заредена молекула) да действа като & ldquochaperones & rdquo, за да предпази фосфатите & rsquo ➖

Една от най-трудните части при провеждането на биохимична реакция често е обединяването на реагентите и поддържането им заедно достатъчно дълго, за да взаимодействат. Защо & rsquos е толкова трудно? Молекулите обичат да се движат свободно (те искат висока ЕНТРОПИЯ) и те не обичат да бъдат вързани. Ентропията се отнася до това в колко различни &ldquostaty&rdquo може да бъде дадена молекула (това може да се отнася до намиране на различни места или в малко различни форми (напр. връзката, завъртяна малко). Понякога се описва като &ldquorandomness&rdquo или &ldquodisorder&rdquo, защото колкото по-малко начини може да се движи нещо вероятно ще знаете точно къде се намират по всяко време.

Получаването на нуклеотиди за свързване е като да накарате куп деца да тичат наоколо на почивката, за да се свържат, за да образуват наистина дълга раса с три крака. Първо трябва да ги накарате да дойдат, след това трябва да ги накарате да останат неподвижни достатъчно дълго, за да ги убедите да се свържат, а след това, след като те се свържат, трябва да го направите & ldquofun & rdquo за тях, въпреки че вече могат да тичат наоколо защото движението им е ограничено, като са свързани с човека до тях. А на Пол му е още по -трудно, защото трябва да накара децата да се свържат в определен ред!

И така, как един малък протеин може да направи всичко това? Като дават на нуклеотидите нещо, което искат в замяна и ги освобождават от няколко от техните фосфати. Фосфатите се придържат към края 5&rsquo &, те&rsquore всъщност са наистина концентрирани отрицателни заряди, притиснати заедно като пружина. ФОСФАТ (PO ₄ & sup3 ⁻) има централен фосфорен (P) атом, свързан с 4 кислородни (О) атома. Той има & ldquoextra & rdquo електрони (e ⁻), така че & rsquos ➖ е зареден. Както зарядите се отблъскват, така и фосфатите не обичат да са един до друг. Така че са необходими усилия (под формата на енергия (E)), за да се съберат & задържат фосфатите заедно (като компресиране на пружина) &ndash, така че ние наричаме тези връзки &ldquoвисока енергия&rdquo и когато те&rsquo се разпадат, E&rsquos се освобождават, за да бъдат използвани за други неща като плащане разходи за свързване на нуклеотиди заедно.

Така че, въпреки че полимеризацията на нуклеотидите все още е енергийно скъпа, тъй като вие & свързвате свързването на молекулите, ⬇ ️ тяхната свобода (⬇ ️ ентропия), това се компенсира от голямата ⬆ ️ в ентропията, която възниква при PPi е освободен и хидролизиран (разделен от вода), за да ви даде 2 отделни ортофосфата (Pi) (и 2 малки неща, които се движат свободно, имат дори повече свобода от 1 средно-малко нещо (PPi), което&rsquos първоначално освобождава &ndash, така че получавате двойно- тласък

НО, за да получите тази полза, първо трябва да ги накарате да реагират и това често е мястото, където влизат протеини и/или РНК КАТАЛИЗАТОРИ (ускорители на реакцията), наречени ЕНЗИМИ. Те действат като нещо като &ldquomediator&rdquo, обединявайки правилните реагенти , задържайки ги в оптимални позиции за реакция, стабилизирайки междинните продукти на реакцията. & осигуряваща приятелска среда.

Както споменах преди, Артър Корнберг открива някои ензими, които помагат за посредничеството на копирането на ДНК: ДНК ПОЛИМЕРАЗИ (DNA Pols). ДНК Pol помага за задържане на входящ нуклеотид (от сорта трифосфат) близо до нарастващата верига, който трябва да се добави към & amp в правилната позиция. След това 3&rsquo хидроксилната (OH) група се намесва в атака! Той се захваща за 1-ва фосфорна (P) група на входящия нуклеотид ->, че P вече има твърде много връзки, така че изхвърля другите 2 фосфатни групи като неорганична фосфатна молекула ПИРОФОСФАТ (PPi) (енергийно усилване 1). След това ПИРОФОСФАТЪТ се хидролизира (разбива се чрез добавяне на вода) до 2 молекули ОРТОФОСФАТ (Pi) (енергийно повишаване 2).

ДНК Pols имат общия общ механизъм, но различните организми имат малко различни ДНК Pols, които се различават по ЕФЕКТИВНОСТ, ПРОЦЕСИВНОСТ, ВЕРНОСТ и ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛНОСТ

  • ЕФЕКТИВНОСТ: колко бързо може да върви?
  • ПРОЦЕСИВНОСТ: колко нуклеотида може да добави, преди да падне от шаблона?
  • ВЕРНОСТ: колко правописни грешки прави?
  • ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛНОСТ: колко топлина може да поеме?

Можете да получите по-висока FIDELITY (по-малко правописни грешки), ако вашият Pol има & ldquoproofreading & rdquo 3 & prime & rarr 5 & prime exonuclease (ДНК крайно дъвчене) домейн, който може да усети грешки, & ldquobackspace & rdquo да ги премахне, & amp след това поставете правилната буква. Това усъвършенстване е важно, защото грешките ще бъдат копирани & hellip & amp копирани & hellip & amp копирани & hellip НО това забавя процеса, така че да получите по -ниска ЕФЕКТИВНОСТ.

Други части от протеините на ДНК Pol също могат да помогнат. Начин за увеличаване на ЕФЕКТИВНОСТТА е чрез увеличаване на ПРОЦЕСИВНОСТТА & ndash запазване на Pol върху шаблона. Постоянното падане и подскачане със сигурност със сигурност ви забавя! Повишаващи процесивността домейни (&ldquodomain&rdquo е просто протеин &ldquosection&rdquo) или отделни повишаващи процесивността &ldquosubunits&rdquo свързват dsDNA, за да помогнат за заключване на Pol. Но важното е, че те не & rsquot свързват & ldquotoo плътно & rdquo & amp, че могат да свързват всяка последователност & ndash, което позволява на Pol да остане, но да се плъзга

НО, преди да можете да копирате нишките, трябва да ги разархивирате и усилвателят също е енергийно скъп (като отлепване на 2 парчета залепена лента). Трябва да вложите енергия, за да дадете на молекулите на ДНК повече енергия, за да се размърдат повече и усилват нишките.

Във вашите клетки ензимните помощници, наречени HELICASES, им помагат да ги разархивират, използвайки химическа енергия от АТФ, но нашата версия на PCR & ldquobare-bone & rdquo няма тези помощници. Вместо това получаваме необходимата енергия от HEAT. В стъпката MELT ние физически загряваме dsDNA, така че нишките да се разделят. И трябва да го нагреем НАИСТИНА! (

95°C или 200°F). Human DNA Pol would be pretty useless at this temp bc same heat that causes strands of DNA to come apart (yay!) can also cause proteins to unfold (eek!) (just like chains remain chains when you melt DNA (you don&rsquot break up strong covalent bonds), heat denaturation of proteins leaves you w/chains of amino acids)

Thankfully there are organisms called THERMOPHILES that have evolved to live in super hot environments (like near thermal vents in the ocean). They have super-strong proteins that can withstand high temps needed PCR. The &ldquoclassic&rdquo PCR Pol is Taq, which was discovered in 1976 and gets its name because it comes from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. Taq really made PCR possible &ndash before that, scientists trying to copy DNA in the lab were using a DNA Pol from e. coli bacteria. That DNA Pol couldn&rsquot take the heat, so after each heat step, they&rsquod have to add more! In fact, the first thermal cycler, named &ldquoMr. Cycle&rdquo was designed with an open system so you could keep adding more. https://bit.ly/2FoUFkD

So Taq was a major, crucial, discovery. But it&rsquos definitely not &ldquoperfect&rdquo &ndash Taq tends to make a lot of typos (low FIDELITY). Pfu DNA polymerase (from Pyrococcus furiosus) makes fewer errors (so higher FIDELITY). BUT it has relatively low EFFICIENCY. Could we do better?

It&rsquos hard to get all 4, but that hasn&rsquot stopped scientists from trying! Scientists can stitch together parts they like from different Pols to get Pol &ldquochimeras&rdquo w/enhanced functions. Our lab uses a chimera called Phusion Polymerase (not a paid endorsement, just what we use!) It&rsquos based off of a Pfu-like DNA Pol (w/proofreading capability for increased fidelity) fused to a small dsDNA-binding protein called Sso7 (from Sulfolobus sulfactaricus) which serves as a processivity-enhancing domain. It can add 1000 nucleotides (1 kb) in only 15 seconds w/few errors! So we time out the extension step accordingly (e.g. if we want to copy a 4kb segment, we&rsquoll set the extension step for 4×15=60s

So, DNA Pol was one choice we need to make, but there are others too&hellip.

Where what do you want your start & stop sites to be? Design primers to match &ndash but not just any sequence&hellip It&rsquos really important to design the stations (primers) carefully. Like many things in biochemistry, it&rsquos largely a matter of AFFINITY & SPECIFICITY

SPECIFICITY. We want the primers to bind ONLY where we want them to bind. Say you ask some friends to buy you a train ticket for a trip from Kansas City to NYC Is that Kansas City, Kansas? Or Kansas City, Missouri? Some friends might think Kansas, others might think Missouri & you end up with 2 types of train tickets..

Similarly, if your primer can bind at multiple sites on the DNA, you end up copying different stretches of train track giving you a mix of &ldquononspecific products&rdquo which show up as multiple bands on an agarose gel you use to separate the DNA pieces by size & visualize them: http://bit.ly/agarosegelrunning

When you design primers, you want to make sure they match your site of interest & ONLY that site. Like a computer password, the longer the sequence, the more likely it is to be &ldquounique.&rdquo If there are multiple occurrences of sequence you initially choose you might have to lengthen it to include more of the surrounding sequence (like saying &ldquofind a blue house w/a red house on the left & a green house on the right&rdquo instead of just saying &ldquofind a blue house&rdquo) You can use free software programs like NCBI BLAST or Primer3 to help you check for specificity & design good primers

BUT too long a primer and you can face other problems that lead to a &ldquoPCR TLDR&rdquo (too long didn&rsquot read)&hellip

🔹 PRIMER DIMERS: this is where the primer binds to itself instead of to your template. These can be self-dimers (where 2 &ldquostart stations&rdquo or &ldquostop stations&rdquo bind to themselves or cross dimers (a start & a stop)

🔹SECONDARY STRUCTURE: a single primer can fold up into &ldquohairpins&rdquo & bind itself

This leads to less primer available to bind template, so lower yield (less copies made) & DNA Pol can end up using primers as a (really short) template, amplifying primer &ldquoartifacts&rdquo instead of desired amplicon. And the high primer concentrations needed to prevent template-template zipping, make such primer pairing more likely because there are more primer fish & fewer template fish in the sea

Secondary structure in the *template* can also be a problem &ndash some regions of DNA are tightly wound up, making it hard to get to the site to bind (it&rsquos hard to build a train station in the middle of a mountain pass). You also want to avoid repetitive stretches (things like &ldquoAAAAAA&rdquo) because it makes it easier to &ldquoslip&rdquo & misprime

Typical primers are usually

20 nucleotides (nt) long, but it depends on experiment type, etc. There&rsquos free software available (like NCBI Primer-BLAST, Primer3, & AmplifiX) to help you design primers to fit your needs.

AFFINITY: We want the primers to have high affinity (attractiveness & stickiness) for the site we want them to bind so that they&rsquoll bind there stably & not fall off randomly during the annealing or extension steps. BUT we don&rsquot want the affinity to be too high or it won&rsquot come off during the melt steps

Affinity is largely dependent on the primer length (longer primers have more interstrand bonds working together to keep the strands glued shut) & &ldquobase composition,&rdquo When G&rsquos & C&rsquos are across from each other they can form 3 H-bonds. But when A&rsquos & T&rsquos are across from each other they can only form 2 H-bonds, so G-C pairs are stronger than A-T pairs. So a higher &ldquoG-C&rdquo content (typically given as a % of bases) means stronger binding. Ideal is usually

note: this is why origins of replication (ORIs) (where DNA strands come apart to be copied before cells divide) tend to be &ldquoA-T rich&rdquo because it makes it easier to melt them apart

Just like it&rsquos easier to pull off a piece of tape from the end than the middle, it&rsquos easier to pull of primers from the end, so you might want to put a&ldquoG-C&rdquo clamp at the 3&rsquo end (1 C or G) to help latch it on tight

A common measure used to calculate/report this affinity is the Tm (melting temperature). It&rsquos the temperature at which 1/2 the primer is bound &ndash the higher the temp, the more energy the molecules have & the harder it is to get the DNA to &ldquostay still&rdquo & bind. A high Tm means the affinity&rsquos high enough to hold down the wriggling DNA. Sp higher Tm, higher affinity. You typically want

60°C & you want the Tm of the 2 primers to be similar to one another (within

You want to know these Tms because they&rsquoll help you decide what temp to use for your annealing temperature &ndash they temperature you program the thermal cycler to be at during the primer-binding step of each cycle.

How do decide? The higher the temp, the more energy the DNA molecules have so it&rsquos harder for them to be &ldquotied down.&rdquo At higher temps, they have to really like their binding partner in order to sacrifice the freedom to move freely. But at lower temps, they have less energy, so they&rsquore less &ldquopicky&rdquo & more likely to &ldquosettle&rdquo for less-optimal pairing. As a result, if the annealing temp is too low, your primers can &ldquomisprime&rdquo & bind at the wrong sites giving you a mixture of &ldquononspecific&rdquo products.

So you want to choose a Goldilocks ANNEALING TEMPERATURE where the DNA molecules have enough energy to seek out their soulmate, BUT not so much that they can&rsquot &ldquotie the knot&rdquo once they find it. To help you choose, you can use free software to calculate the melting temperature (Tm) of the primers based on their length & sequence (since G&rsquos & C&rsquos bind each other more strongly than As & Ts (thanks to their 3rd H-bond), higher GC content increases the Tm. Common annealing temps are

55-80°C, and you want the Tms for both primers to be similar so that they both get to be Goldilocks-happy at the same time.

How long should the extension step be? Basically, each cycle, you need to give DNA Pol enough time to copy the region between the primers. So the optimal time depends on length of the sequence you want copied (AMPLICON SIZE) & the speed (efficiency) of the DNA Pol. The &ldquoclassic&rdquo Taq polymerase (a DNA Pol that can tolerate the high temps required) can add

360nt/min, but &ldquonewer models&rdquo (either from other organisms &/or mutated) like Pfu Turbo can go faster (

1000nt (1kb)/min)) So, for example, if you&rsquore using Pfu Turbo to copy something 2kb long, you&rsquod want to make sure your extension is a little over 2 minutes. Това е per cycle so with longer times, be prepared to do some waiting (a great time to pour that agarose gel you&rsquoll use to check that it worked!)

Just how long you&rsquoll have to wait depends on how many cycles you choose. And that depends in part on how many copies you want made (each cycle you increase # of copies exponentially (e.g. 2, 4, 8, 16, 32, 64&hellip), so by 35th cycle you&rsquod have 68 billion copies! You might think, the more the better, right? BUT the more copies you make, the more chance for errors to occur (& be copied) Common cycle #s are

25-30 (but even if you have to wait you don&rsquot have to manually move the tube over and over!)⠀


Why should you use an annealing temperature about 5°C below the Tm of your primers? - Биология

Policies For PrimerBank Usage

PrimerBank is a public resource for PCR primers. These primers are designed for gene expression detection or quantification (real-time PCR). There are several ways to search for primers: by GenBank Accession, NCBI protein accession, LocusLink ID, PrimerBank ID or Keyword (gene description). PrimerBank contains about 180,000 primers covering most known human and mouse genes.

Polymerase Chain Reaction Amplification (PCR) is one of the most actively used techniques in molecular biology. In recent years, PCR has been increasingly used for gene expression detection or quantification. It is a more convenient method in gene expression studies comparing to other techniques, such as Northern Blot. One common problem in PCR is the non-specific amplifications of other gene products because cDNAs libraries of thousand of genes are often used as PCR templates. Therefore, we need to carefully design PCR primers that specifically amplify the genes of interest. Unfortunately, most available primer design programs only focus on primer chemical properties, such as melting temperature, GC content, secondary structure, etc. Little emphasis is given to primer mispriming to other genes. In contrast, all primers in PrimerBank were carefully designed to ensure gene specificity.

The primer design algorithm has been extensively tested by real-time PCR experiments for PCR specificity and efficiency. We have tested 26,855 primer pairs that correspond to 27,681 mouse genes by Real Time PCR followed by agarose gel electrophoresis and sequencing of the PCR products. The design success rate is 82.6% (22,187 successful primer pairs) based on agarose gel electrophoresis.

You may search PrimerBank by GenBank Accession, NCBI protein accession, LocusLink ID, NCBI gene symbol or PrimerBank ID.

Search terms are automatically combined if they are separated by space. For example, search "kinase s6" returns all records with both keywords "kinase" AND "s6". AND and OR Boolean operators may also be used. Here are a few examples:

Ключова дума Интерпретация
kinase s6 Searching for both kinase and s6
kinase and s6 Searching for both kinase and s6
Cytochrome or cyp Searching for either Cytochrome or cyp

Currently, only a limited set of keywords (keywords defined in the protein definitions) can be searched. For example, you cannot search by gene symbols. If you did not find your genes, please look up the corresponding gene IDs (DNA accessions, proteins accessions, or LocusLink IDs) and search by IDs.

Because of the sequence redundancy in GenBank, each gene is usually represented by more than one NCBI record. PrimerBank sometimes uses the NCBI LocusLink index file to map multiple sequence records to the same gene locus. As a result, a different accession number other than originally submitted may be retrieved. However, both accessions represent the same gene. If a retrieved record has a different GenBank accession, a LocuLink ID will appear in the gene description field.

You may use your browser's save function to save the web page in your local computer. Other saving options will be implemented later.

All the primers in PrimerBank were designed using a program called uPrimer. Great care has been given to avoid primer mispriming to other known genes in a genome. Here is a list of criteria for gene specific primer design:

  1. The primer length range: 19 - 23 nt, with the optimal length at 21 nt.
  2. The primer GC percentage range: 35% - 65%.
  3. The delta G value for the five 3&rsquo end-bases is at least -9 kcal/mol.
  4. The primer Tm range: 60 - 63 °C, determined by the Nearest Neighbor Method.
  5. The PCR product length range is 100 - 250 bp. If this requirement cannot be satisfied, alternative ranges will be used.
  6. The default number of primer pairs designed for each sequence is 3.
  7. No primer is designed from low-complexity regions.
  8. A primer does not contain 6 or more contiguous same nucleotides.
  9. A primer does not contain any ambiguous nucleotide.
  10. No repetitive 15-mer from other gene sequences in the genome (for both strands) anywhere in a primer.
  11. No repetitive 13-mer from non-coding RNA sequences (for both strands) anywhere in a primer.
  12. The global BLAST score for any primer is less than 30 (equivalent to 15-mer perfect match).
  13. The maximum Tm for the 3&rsquo end perfect match to other gene sequences does not exceed 46 °C does not exceed 42 °C when compared to non-coding RNA sequences (Tm determined by the Nearest Neighbor Method).
  14. For primer secondary structure (the primer-primer self-annealing)
    1. No repetitive 5-mer is allowed anywhere when a primer sequence is compared to its complementary strand.
    2. The four 3&rsquo-end bases should be unique when compared to the primer&rsquos complementary strand.
    1. No repetitive 9-mer is allowed when a primer sequence is compared to the complementary strand of its cognate sequence.
    2. The BLAST score is less than 18 when a primer sequence is compared to the complementary strand of its cognate sequence.

    All the primers in PrimerBank have melting temperatures (Tm) of 60 - 63 °C. A higher annealing temperature results in more specific priming. Previous studies indicated sufficient priming should occur at primer Tm. Therefore, an annealing temperature of 60 °C is recommended for all PrimerBank primers. Non-specific PCR products are likely to occur at lower annealing temperature. We have tested a few hundred primers under 60 °C annealing temperature and the PCR experiments worked very well.

    The primer Tm values are calculated using the Nearest Neighbor Method with the up-to-date thermodynamic parameters. Tm values are also dependent on primer and salt concentrations. Higher concentrations of primer and salt usually lead to higher Tm. The Tm values included in PrimerBank are for 0.25 uM primer, 1.5 mM Mg2+, 50 mM Na+, and 0.8 mM dNTP, which are typically used in PCR experiments. Other common PCR conditions only affect the Tm slightly.

    To guarantee PCR efficiency, small PCR products are recommended. Most PrimerBank primers lead to amplicons in the size range of 100 - 250 bp. PCR efficiency is close to 100% in this range (supported by real-time PCR experiments). However, PCR efficiency may be reduced for much larger PCR products. Less than 1% of PrimerBank primers lead to >400 bp amplicons. Please be cautious about PCR efficiency when these primers have to be used.

    Sometimes it is desirable to select a primer pair that spans intron. In this way, genomic DNA contamination can be closely monitored. Usually a PrimerBank primer pair spans intron because a typical exon is quite small. The primer intron-spanning information will be included in the next version update. If it is important for you to be sure that a primer pair spans intron, you may simply do a BLAST search of the primer pair sequences, or better the amplicon sequences (listed in the primer detail page) against the genomic sequences.

    Agarose gel electrophoresis or melting curve analysis may not always reliably reflect PCR specificity. From our experience, bimodal melting curves are occasionally observed for long amplicons even when the PCRs are specific. The observed heterogeneity in melting temperature was due to internal sequence inhomogeneity (e.g. independently melting blocks of high and low GC content) rather than amplicon contamination. On the other hand, for short amplicons very weak bands migrating ahead of the major specific bands are occasionally observed on agarose gel. These weak bands are super-structured or single-stranded version of the specific amplicons in equilibrium state. Although gel electrophoresis or melting curve analysis alone may not be 100% reliable, the combination of both can always reveal PCR specificity in our experience.

    Although all PrimerBank primers are designed to be gene-specific, we still need to be very careful about PCR conditions.

    Non-specific primer extension of only a few bases at low temperature by DNA polymerase can easily lead to non-specific PCR amplifications. Therefore, hot-start PCR is STRONGLY recommended. In fact, I only do hot-start PCR in my experiments. I routinely use AmpliTaq Gold polymerase (Applied Biosystems) for hot-start PCR.

    The annealing temperature may affect PCR specificity. To avoid non-specific PCR products, a high annealing temperature (the smaller one of the two Tm values from the primer pair) and a short annealing time are recommended.

    If you still see non-specific bands, it could mean the primer pair in use is the problem. Although great care has been given to design PrimerBank primers, the success rate is not 100%. Less than 1% of the primers may have design problems (see our paper for detailed discussion). In this case, please try a different primer pair for the same gene. Click here if you would like to report primer problems.

    Poor quality of PCR templates, primers, or reagents may lead to PCR failures. First, please include appropriate controls to eliminate these possibilities.

    Some genes are expressed only in certain tissues. Please first read literature to make sure your genes are included in the cDNA templates. In our experience, this is the most likely cause for negative PCR results. If you are sure the genes are expressed, then try lowering the annealing temperature (to Tm - 5 °C) and increasing the annealing time to ensure sufficient primer annealing.

    If you still could not see any PCR band, it could mean the primer pair in use is the problem. Although great care has been given to design PrimerBank primers, the success rate is not 100%. Less than 1% of the primers may have design problems (see our paper for detailed discussion). In this case, please try a different primer pair for the same gene. Click here if you would like to report primer problems.

    The algorithm and initial testing of PrimerBank were generated by Wang and Seed, Xiaowei Wang and Brian Seed (2003) A PCR primer bank for quantitative gene expression analysis. Nucleic Acids Research 31(24): e154 pp.1-8. and further refinement and validation of the entire mouse collection was carried out by Spandidos and coworkers. Athanasia Spandidos, Xiaowei Wang, Huajun Wang, Stefan Dragnev, Tara Thurber and Brian Seed (2008) A comprehensive collection of experimentally validated primers for Polymerase Chain Reaction quantitation of murine transcript abundance. BMC Genomics 2008, 9:633


    Why should you use an annealing temperature about 5°C below the Tm of your primers? - Биология

    The polymerase chain reaction (PCR) is a biomedical technology in molecular biology used to amplify a single copy or a few copies of a piece of DNA across several orders of magnitude, generating thousands to millions of copies of a particular DNA sequence. Developed in 1983 by Kary Mullis, PCR is now a common and often indispensable technique used in medical and biological research labs for a variety of applications. These include DNA cloning for sequencing, DNA-based phylogeny, or functional analysis of genes the diagnosis of hereditary diseases the identification of genetic fingerprints (used in forensic sciences and paternity testing) and the detection and diagnosis of infectious diseases.

    The method relies on thermal cycling, consisting of cycles of repeated heating and cooling of the reaction for DNA melting and enzymatic replication of the DNA. Primers (short DNA fragments) containing sequences complementary to the target region along with a DNA polymerase, after which the method is named, are key components to enable selective and repeated amplification.

    Almost all PCR applications employ a heat-stable DNA polymerase, such as Taq polymerase (an enzyme originally isolated from the bacterium Thermus aquaticus). This DNA polymerase enzymatically assembles a new DNA strand from DNA building-blocks, the nucleotides, by using single-stranded DNA as a template and DNA oligonucleotides (also called DNA primers), which are required for initiation of DNA synthesis.

    A basic PCR set up requires several components and reagents. These components include:

    • DNA template that contains the DNA region (target) to be amplified.
    • две primers that are complementary to the 3′ (three prime) ends of each of the sense and anti-sense strand of the DNA target. or another DNA polymerase with a temperature optimum at around 70°C.
    • Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs, sometimes called “deoxynucleotide triphosphates” nucleotides containing triphosphate groups), the building-blocks from which the DNA polymerase synthesizes a new DNA strand. , providing a suitable chemical environment for optimum activity and stability of the DNA polymerase. cations, magnesium or manganese ions generally Mg2+is used, but Mn2+ can be utilized for PCR-mediated DNA mutagenesis, as higher Mn2+ concentration increases the error rate during DNA synthesis
    • Monovalent cationкалий

    Процедура

    Typically, PCR consists of a series of 20-40 repeated temperature changes, called cycles, with each cycle commonly consisting of 2-3 discrete temperature steps. The cycling is often preceded by a single temperature step at a high temperature (>90°C).

    Initialization step(Only required for DNA polymerases that require heat activation by hot-start PCR): This step consists of heating the reaction to a temperature of 94–96°C (or 98°C if extremely thermostable polymerases are used), which is held for 1–9 minutes.

    Denaturation step: This step is the first regular cycling event and consists of heating the reaction to 94–98°C for 20–30 seconds. It causes DNA melting of the DNA template by disrupting the hydrogen bonds between complementary bases, yielding single-stranded DNA molecules.

    Annealing step: The reaction temperature is lowered to 50–65°C for 20–40 seconds allowing annealing of the primers to the single-stranded DNA template. This temperature needs to be low enough to allow for hybridization of the primer to the strand, but high enough in order for the hybridization to be specific, i.e. the primer should only bind to a perfectly complementary part of the template. If the temperature is too low, the primer could bind imperfectly. If it is too high, the primer might not bind. Typically the annealing temperature is about 3–5°C below the Tm of the primers used. Stable DNA–DNA hydrogen bonds are only formed when the primer sequence very closely matches the template sequence. The polymerase binds to the primer-template hybrid and begins DNA formation.

    Extension/elongation step: The temperature at this step depends on the DNA polymerase used. Taq polymerase has its optimum activity temperature at 75–80°C, and commonly a temperature of 72°C is used with this enzyme. At this step the DNA polymerase synthesizes a new DNA strand complementary to the DNA template strand by adding dNTPs that are complementary to the template in 5′ to 3′ direction, condensing the 5′-phosphate group of the dNTPs with the 3′-hydroxyl group at the end of the nascent (extending) DNA strand. The extension time depends both on the DNA polymerase used and on the length of the DNA fragment to be amplified.

    Final elongation: This single step is occasionally performed at a temperature of 70–74°C (this is the temperature needed for optimal activity for most polymerases used in PCR) for 5–15 minutes after the last PCR cycle to ensure that any remaining single-stranded DNA is fully extended.

    Final hold: This step at 4–15°C for an indefinite time may be employed for short-term storage of the reaction.


    2.1: Amplify aptamer-encoding DNA

    Back when he was a postdoctoral fellow, Professor Niles screened a random library of RNA aptamers to find one that binds to heme &ndash the iron-containing site in hemoglobin. It is known that heme can bind to certain transcription factors and modulate gene expression (see references Zhang and Hach, 1999 и Ogawa, et al., 2001), and RNA aptamers are one potential tool for learning more about signaling networks involving heme. To select heme-binding aptamers, Professor Niles ran a pool of RNAs with 50 randomized base pairs through a heme affinity column. He then amplified the column-selected pool of aptamers and repeated the process several times. An aptamer called "6-5" survived through the 6th round of screening, but ultimately was found not to bind to heme. An aptamer called "8-12" survived through all 8 rounds of screening, and has a heme binding affinity of 220 nM. Both were described in the Niles, et al., 2006 paper referenced below.

    Today you will be given two archival plasmids containing the 6-5 and 8-12 sequences, respectively. RNA is not very stable compared to DNA thus, RNA aptamers are copied into their associated DNA sequences for long-term storage. Ligating the DNA fragment into a plasmid that can be carried in bacteria provides further amplification and storage capabilities. We will make use of these capabilities more extensively in Module 2.

    Фигура (PageIndex<1>): PCR schematic. Depicted are two complementary strands of DNA, with a desired target fragment shown in green. Primers that can select the target sequence are shown as short arrows, with the dotted lines indicating the extension step of PCR. Note that in the first couple rounds of PCR, products longer than the desired target will be made (dotted lines keep extending). However, these early products themselves become templates that produce the correct product in abundance.

    In order to select and amplify just the short DNA fragment that encodes for the aptamer, you will use the polymerase chain reaction, PCR. PCR comprises three main steps: 1) template DNA containing a desired sequence is melted, 2) primers anneal to specific locations on the now melted (i.e., single-stranded) DNA, and 3) the primers are extended by a polymerase to select and create the desired product. Extension occurs at

    95°C, and annealing at a temperature

    5 °C below the primer melting temperature thus, the repetition of these steps is called thermal cycling. After each cycle, the newly formed products themselves become templates, causing exponential amplification of the selected sequence. (Note that the early rounds of PCR will not produce the desired product - we will see why in today's pre-lab lecture.)

    Once the PCR is running, you will begin to explore some computational tools for RNA analysis. During this module, you will ultimately use three different programs to explore both sequence similarities among RNA candidate aptamers and higher-order structures that arise from the primary sequences. For today, you will look at degrees of sequence similarity among a list of aptamers, some of which bind to heme and some that don't.

    Figure (PageIndex<2>): (Photo by Mark Robert Halper. Courtesy of Kary Mullis. Used with permission.)

    Based on the numerous applications of PCR, it may seem that the technique has been around forever. In fact it is only 25 years old. In 1984, Kary Mullis described this technique for amplifying DNA of known or unknown sequence, realizing immediately the significance of his insight.

    "Dear Thor!," I exclaimed. I had solved the most annoying problems in DNA chemistry in a single lightening bolt. Abundance and distinction. With two oligonucleotides, DNA polymerase, and the four nucleosidetriphosphates I could make as much of a DNA sequence as I wanted and I could make it on a fragment of a specific size that I could distinguish easily. Somehow, I thought, it had to be an illusion. Otherwise it would change DNA chemistry forever. Otherwise it would make me famous. It was too easy. Someone else would have done it and I would surely have heard of it. We would be doing it all the time. What was I failing to see? "Jennifer, wake up. I've thought of something incredible." --Kary Mullis from his Nobel Lecture, December 8, 1983.


    Изводи

    Because the design of perfectly matching universal primers remains an unsolved problem ( Forney и др., 2004), the investigation of PCR parameters that could attenuate the quantitative bias associated with preferential amplification caused by primer mismatch is very important. Newly designed domain-specific primers are usually tested with genomic DNA of strains and environmental samples for PCR amplification efficiency ( Marchesi и др., 1998 Baker и др., 2003), but preferential amplification should also be considered and tests carried out to determine the importance of this phenomenon. PCR optimization strategies for the assessment of environmental communities by ‘universal’ primer sets are directed to increasing the specificity of amplification using relatively high annealing temperature ( Hansen и др., 1998) or ‘touch-down’ PCR protocol ( Simpson и др., 2000). The results presented here suggest the opposite strategy for reducing preferential amplification using specific but low-stringency amplification. (1) PCR amplification should be optimized to reach the lowest annealing temperature, where the reaction is still specific and unspecific products (mispriming) are not observed. The cycle number can be high at this step. (2) PCR amplification should be repeated at the optimal temperature using parallel samples at low cycle numbers (around 25). In the case of low yield, parallel runs can be combined to obtain sufficient quantities for subsequent analyses.