Информация

Намаляване на сигналите при измервания на анализа

Намаляване на сигналите при измервания на анализа


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Работя с анализ на калций, за да проуча ефектите на различни фактори на вирулентност. Анализът работи, но от ден на ден сигналите за клетъчен лизис намаляват. За съжаление не намерих обяснение защо това се случва.

Конкретният анализ, който използвам, измерва клетъчния лизис. Факторите на вирулентност, които използвам, причиняват образуване на пори и водят до приток на калций (от буфера). Естеразните протеини активират флуорофора и се нуждаят от калций. Увеличаването на клетъчния лизис води до увеличаване на сигнала.

Както вече споменах, сигналите ми намаляват (от ден на ден). Но не знам защо.

Имате ли представа какво може да доведе до такива ефекти?

Ето някои фактори, които могат да бъдат включени.

  • Факторите на вирулентност губят своята активност? (Не смятам, че това причинява проблема, защото новите акции също показват намаляване на активността, а също и сигналът от положителната контрола намалява. Бих казал, че намалява в подобно съотношение. Положителната контрола е тритон.
  • Багрилото губи своята активност? Бутилката обикновено се съхранява във фризер. Просто го изваждам за анализ. Преди да го използвам, поставям бутилката върху шейкър за около 30 минути. Просто отварям бутилката за няколко секунди и след това я слагам и след това отново във фризера.
  • Четецът на табели е повреден или протоколът за четене е променен? Вече проверих протокола и всичко е същото като в началото. Колегите получават същите резултати със същия четец на плочи като преди. Така че предполагам, че това не би трябвало да е проблем.
  • Буферът се унищожава от процедурата? Съхранявам го във фризера и го изваждам и слагам във водна баня. След като го използвам го поставям отново във фризера. Правя тази процедура всеки път, може ли това да доведе до негативни ефекти? Средата съдържа калций, може ли да се случи нещо с нея (Калцият играе важна роля в този анализ)? Един колега вече ми каза, че съхранява буфера си в хладилника, а не във фризера и не е получил такива ефекти. Но може би това не е единственото нещо, което прави различно...
  • Променя ли се номерът на клетката? Отрицателната контрола не се променя при експериментите и сигналът от нея все още е по-висок от стойностите от празната проба. Но ще проверя това.
  • Могат ли клетките ми да причинят проблеми? Все още изглеждат добре под микроскоп.

Често се подозира, че циклите на замразяване-размразяване причиняват разграждане на органичните молекули 1,2. Първото ми предположение би било, че вашият флуорофор се разпада поради тези повтарящи се цикли. Като алтернатива, може да получите утаяване на калциево съединение от буфера, който замразявате, но вашият колега не е.

Стандартната лабораторна практика е да се правят аликвоти от замразени разтвори. Преди да размразите разтвора за първи път, поставете предварително маркирани по-малки контейнери (например епруветки Eppendorf) и след това разпределете аликвотна част от количеството, което очаквате да използвате за всеки експеримент. По този начин потенциално чувствителните съединения се размразяват само два пъти.

Препратки:

1: Kozikowski, B. A., Burt, T. M., Tirey, D. A., Williams, L. E., Kuzmak, B. R., Stanton, D. T.,… & Nelson, S. L. (2003). Ефектът от циклите на замразяване/размразяване върху стабилността на съединенията в DMSO. Вестник за биомолекулен скрининг, 8 (2), 210-215.

2: Американската администрация по храните и лекарствата. (2008). Ръководство за индустрията. Насоки за стабилност на лекарствата.


Гледай видеото: Dang dang signal (Декември 2022).