Информация

19.1.6: Arabidopsis Thaliana – Моделен организъм – Биология

19.1.6: Arabidopsis Thaliana – Моделен организъм – Биология


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Arabidopsis Thaliana стана за растителна биология какво Drosophila melanogaster и Caenorhabditis elegans са към биологията на животните. Арабидопсис е покритосеменни растения, двудървеца от семейство синап (Brassicaceae). Популярно е като крес от тали или креш от ухо на мишка. Въпреки че няма търговска стойност - всъщност се счита за плевел - той се е доказал като идеален организъм за изучаване развитието на растенията.

Някои от предимствата му като моделен организъм:

  • Той има един от най -малките геноми в растителното царство: 135 x 106 базови двойки ДНК, разпределени в 5 хромозоми (2n = 10) и почти всички от които кодират нейните 27 407 гена.
  • Трансгенните растения могат да бъдат направени лесно с помощта Agrobacterium tumefaciens като вектор за въвеждане на чужди гени.
  • Растението е малко - плоска розетка от листа, от която расте цветна дръжка с височина 6–12 инча.
  • Може лесно да се отглежда в лабораторията на относително малко пространство.
  • Развитието е бързо. От поникването на семената до производството на нова реколта семена са необходими само 5-6 седмици.
  • Той е плодовит производител на семена (до 10 000 на растение), което улеснява генетичните изследвания.
  • Мутациите могат лесно да се генерират (например чрез облъчване на семената или третирането им с мутагенни химикали).
  • Обикновено се самоопрашва, така че рецесивните мутации бързо стават хомозиготни и по този начин се изразяват.

Други членове на семейството му не могат да се самоопрашват. Те имат активна система от самонесъвместимост. Арабидопсис обаче има инактивиращи мутации в гените - SRK и SCR - които предотвратяват самоопрашването при други членове на семейството.

  • Въпреки това, Arabidopsis може лесно да бъде кръстосано опрашен, за да направи генетично картографиране и да произведе щамове с множество мутации.

Много от констатациите за това как работят растенията - описани на тези страници - бяха научени от проучвания с Arabidopsis.


Основен цип от левцин 19

<p>Оценката на анотацията предоставя евристична мярка за съдържанието на анотацията на UniProtKB запис или протеом. Този резултат & ltstrong> не може & lt/strong> да се използва като мярка за точността на анотацията, тъй като не можем да определим „правилната анотация“ за всеки даден протеин. & Ltp> & lta href = '/help/annotation_score' target = '_ top'> Повече ▼. & lt/a> & lt/p> - Експериментални доказателства на ниво транскрипция i & ltp> Това показва вида на доказателствата, които подкрепят съществуването на протеина. Обърнете внимание, че доказателствата за „съществуване на протеин“ не дават информация за точността или коректността на показваните последователности. & Ltp> & lta href = '/help/protein_existence' target = '_ top'> Още. </a></p>

Изберете раздел вляво, за да видите съдържанието.


Материали и методи

Растителен материал и генотипиране

The A. thaliana (Л.) Хейн. SALK и SAIL линии за вмъкване на Т-ДНК в екотип Columbia (Col-0) бяха получени от Salk Institute, Genomic Analysis Laboratory 1 (Alonso et al., 2003) и от колекцията Syngenta на мутанти за вмъкване на T-DNA (Sessions et al ., 2002), съответно. GABI T-DNA мутантите (GK в Col-0) са генерирани в контекста на програмата GABI-Kat (MPI за изследване на селекцията на растения, Кьолн, Германия 2 Rosso et al., 2003). Всички линии бяха предоставени от фондовия център 3 в Нотингам Арабидопсис.

Семената се покълват в почвата, последвано от култивиране при условия на кратък ден (8 h светлина/16 h тъмно) при 18 ଌ. След 1 месец растенията се прехвърлят в условия на дълъг ден (16 h светлина, 22ଌ/8 h тъмно, 21ଌ). Геномна ДНК се изолира от розетни листа и се използва за генотипиране на базата на PCR за идентифициране на хетерозиготни и хомозиготни мутанти на вмъкване на Т-ДНК. PCR праймерите, използвани за генотипиране, са изброени в допълнителна таблица S1 и техните позиции са показани на фигура 1B. Използвана е следната програма за PCR: първоначална денатурация за 5 минути при 95 ଌ, след това 40 цикъла с 15 s денатурация при 95 ଌ, 30 s отгряване при 55 ଌ и 60 s окончателно удължаване при 72 ଌ.

Полимеразната верижна реакция, използваща генно-специфичните праймери, дава ДНК фрагменти от 𢏁 kb, представляващи алелите от див тип. PCR фрагментите, специфични за разрушения алел, дават PCR продукти от 𢏀.5 kb. Позициите на вмъкване на T-DNA бяха потвърдени чрез секвениране на PCR-амплифицираните фрагменти на T-DNA свързване (допълнителна таблица S2).

За да се получат двойни мутанти на вмъкване на Т-ДНК, се извършва кръстосано оплождане.

Brassica rapa Растенията на L. се отглеждат при условия на дълъг ден (16 h светлина, 22ଌ/8 h тъмно, 18ଌ) за получаване на мейоцити за имунолокализация на NSE4A чрез специфични антитела.

In silico Анализ на генни и протеинови структури и изграждане на филогенетично дърво

Генните структури на NSE4A и NSE4B бяха предвидени в mips.helmholtz-muenchen.de (Версия 10 4, 5). Запазените функционални домейни на известни предполагаеми ортолози на NSE4 на висши растения (последователностите в цял ръст са достъпни на www.ncbi.nlm.nih.gov/) бяха идентифицирани с помощта на базата данни за запазени домейни 6. Същите последователности бяха използвани за генериране на филогенетично дърво чрез Bayesian филогенетичен извод в MrBayes 3.2.6 7 . Всички подравнявания бяха извършени от софтуера Clustal Omega 2.1 8 .

Анализ на генната експресия

Общата РНК се изолира от разсад, листа на три и 6 седмици, цветни пъпки и коренови тъкани, като се използва методът Trizol (Thermo Fisher Scientific) съгласно инструкциите на производителя. След това пробите бяха третирани с ДНКаза, като се прилага комплект TM без ДНК TURBO (Thermo Fisher Scientific). Обратната транскрипция (RT) се извършва с помощта на произволен хексамерен RevertAid Reverse Transcriptase Kit (Thermo Fisher Scientific). След 5 минути първоначална денатурация при 95 ଌ, последвана от 60 минути синтез на кДНК при 42 ଌ, реакцията се прекратява при 70 ଌ в продължение на 5 минути.

Количествена PCR в реално време със SYBR Green беше извършена с помощта на гъвкава машина QuantStudio 5 и PCR софтуер в реално време QuantStudio TM (v1.1). Един микролитър сДНК се прилага за всяка реакция с три повторения и три независими биологични повторения за всяка тъкан или етап на развитие. Използвана е следната PCR програма: първоначална денатурация за 5 минути при 95ଌ, след това 40 цикъла с 15 s денатурация при 95ଌ, 30 s отгряване при 60ଌ и 20 s крайно удължаване при 00b#x00&C. PP2A (AT1G13320) и RHIP1 (AT4G26410) служи като стандарт (Czechowski et al., 2005). Изчисленията се основават на делта CT стойностите на референтните гени (Livak and Schmittgen, 2001). Количествените RT-PCR праймери в реално време, използвани за амплифициране на транскрипти, са показани на Фигура 1В и допълнителна таблица S3.

Клониране и трансформация

PCR-базирана амплификация на кДНК (за 35S ::Nse4A:: EYFP) и геномна ДНК (за промоторNse4A :: gNse4A :: GFP) като шаблони бяха извършени с помощта на KOD Xtreme TM Hot Start DNA Polymerase (Merck). PCR продуктите бяха клонирани във вектора pJET 1.2, използвайки CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Fisher Scientific). Вложките, потвърдени от последователността, бяха клонирани в Gateway ® pENTR TM 1A вектор за двойна селекция (Thermo Fisher Scientific). След това вмъкванията бяха повторно клонирани в pGWG (вектор на комплементация без промотор и етикет), pGWB642 (35S промотор с EYFP етикет върху N-термин) и pGWB604 (без промотор, GFP-tag на C-терминус) вектори (вектори на Neyagawa , doi.org/10.1271/bbb.100184 Nakamura et al., 2010), използвайки комплекта BP Clonase II (Gateway ® Technology, Thermo Fisher Scientific). Бинарните вектори бяха прехвърлени в Agrobacterium tumefaciens, и след това се използва за трансформиране A. thaliana Растения от див тип Col-0 чрез флорален метод (Clough and Bent, 1998). Семената от тези растения се размножават върху PPT среда (16 μg/ml). Положително избраните разсад се прехвърлят в почвата и се генотипират за наличието на конструкцията. Хомозиготни F2 растения бяха използвани в допълнителни проучвания. Праймерите, използвани за клонирането, са изброени в допълнителна таблица S4.

Производство на рекомбинантни протеини и антитела

За производството на антитяло частичният пептид NSE4A (от 49 до 289 aa) (допълнителна фигура S1) се експресира в E. coli BL21 pLysS щам, използващ pET23a (Novagen) вектор. Праймерите, използвани за производството на рекомбинантен протеин, са изброени в допълнителна таблица S4. Рекомбинантните протеини, съдържащи 6xHis-тагове, бяха пречистени с помощта на Dynabeads His-Tag (Thermo Fisher Scientific) съгласно инструкциите на производителя. Петстотин микролитра изчистен екстракт се смесва с 500 μl свързващ буфер (50 mM NaP, рН 8.0, 300 mM NaCl, 0.01% Tween-20) и се добавят 50 μl промити Dynabeads. След 10 минути инкубиране на валяк, перлите се промиват 7 × със свързващ буфер и 7 × със свързващ буфер, 5 тМ имидазол. Елуирането се извършва със свързващ буфер, 150 тМ имидазол и концентрацията на протеина (90 ng/μl) се определя с помощта на комплект Bradford (Bio-Rad Laboratories GmbH, Мюнхен) (Bradford, 1976).

Разделянето върху SDS гелове и определянето на размера на протеина чрез Western анализ се извършва, както е описано (Conrad et al., 1997 Допълнителна фигура S2A).

Два зайци бяха имунизирани с 1 mg NSE4A протеин и пълни адюванти на Freund. Четири и пет седмици по -късно бяха проведени бустер имунизации с 0,5 mg NSE4A протеин и непълни адюванти на Freund ’s. Десет дни по-късно се взема кръв, изолира се серумът, утаява се в 40% наситен амониев сулфат, диализира се срещу 1 × PBS и се пречиства афинитетно.

Специфичното поведение на свързване на заешките анти-NSE4 антитела е изследвано чрез конкурентен ELISA съгласно Conrad et al. (2011). Ямките се покриват с 46 ng/100 μl рекомбинантен афинитетно пречистен NSE4A в 1 × PBS и се инкубират за една нощ при стайна температура. След блокиране с 3% w/v BSA в 1 × PBS-0.05% w/v Tween 20 (1 × PBS-T) за 2 h, известните количества афинитетно пречистени анти-NSE4A антитела се смесват с различни концентрации на NSE4A в 1% w/v BSA в 1 × PBS-T, инкубирани в продължение на 30 минути в основна плоча, добавени към ямките, покрити с антиген, и инкубирани за 1 час при 25 ଌ. Антителата, свързани към плаката, се визуализират с алкална фосфатаза против заек-IgG, разредена в 1 × PBS-T/1% BSA. Ензимният субстрат беше pNP фосфат и абсорбцията (405 nm) беше измерена след 30 минути инкубация при 37ଌ (допълнителна фигура S2B).

За по-нататъшно доказване на специфичността на NSE4A антитялото в имунохистологични експерименти бяха проведени експерименти за конкуренция с антиген. NSE4A се добавя към антителата в концентрация 800 nM и се прилага към сортиран поток 8C A. thaliana междуфазни ядра. Намаляването на сигнала в сравнение с контролните ядра без добавяне на антиген ясно потвърди специфичността (допълнителна фигура S2C).

Тест за допълване

За да се потвърди, че фенотиповете на Nse4A мутант GK-768H08 наистина са причинени от тази мутация, ние допълнихме мутанта с геномния див тип Nse4A ген. Геномният интрон-екзон, съдържащ Nse4A ген с 1.7 kbp-дълъг възходящ промоторен регион се амплифицира чрез PCR, използвайки KOD Xtreme TM Hot Start DNA Polymerase (Merck), и след това се секвенира. След това той се клонира във pBWG вектора (Nakamura et al., 2010) и се трансформира в A. tumefaciens. Трансформацията на растенията се извършва чрез бактериално-медииран векторен трансфер чрез флорален метод на потапяне (Clough and Bent, 1998) и след това се размножава при условия на дълъг ден. Събраните семена се отглеждат върху селективна PPT среда (16 μg/ml), а положително подбраните разсад се прехвърлят в почвата и се генотипират за присъствието на конструкцията. Хомозиготни F2 растения бяха използвани в допълнителни проучвания.

Оценка на плодовитостта и оцветяване на Александър

Зрели сухи силици се събират, за да се оценят дължината на силика и семената. Семената бяха класифицирани в нормални и смачкани (Фигура 2). За изчистване, напълно развитите зелени силици се третират в разтвор на етанол: оцетна киселина (9: 1) за една нощ при стайна температура, след това се промиват в 70 и 90% етанол за 5 минути всеки, последвано от съхранение в хлорален хидрат: глицерол: вода (8: 1: 3) разтвор при 4 ଌ.

Нарушен растеж и плодовитост на nse4 мутанти в сравнение с див тип (wt). (А) Намален размер на растението на мутантите GK-768H08 и двойния мутант GK-768H08/SAIL_296_F02. Мутантът SALK_057130 и допълненият мутант GK-768H08 показват навик от див тип. (Б) Намален набор от семена за silique в nse4A и nse4B мутанти. (° С) Сбръчкани семена (стрели) на мутанта GK-768H08. (Д) Намален брой поленови зърна и прекратени поленови зърна в прашник на двойния мутант GK-768H08/SAIL_296_F02.

За оценка на формата на прашеца и жизнеспособността на прашеца е извършено оцветяване на Александър (Alexander, 1969). Неповредените прашници бяха използвани за преброяване на общия прашец (на прашник). След това прашниците бяха смачкани и освободените поленови зърна бяха оценени в два класа: нормални (жизнеспособни, розови кръгли зърна) и прекъснати (сиво/зелена анормална форма).

Изображенията от силици, семена и прашници бяха получени с помощта на бинокъл Nikon SMZ1500 и софтуера NIS-Elements AR 3.0.

Лечение с блеомицин

За индуциране на ДНК DSBs чрез приложение на блеомицин A. thaliana див тип и NSE4A мутантни семена се стерилизират 10 минути в 70% етанол, след това 15 минути в 4% Na-хипохлорит + 1 капка Tween-20, последвано от промиване 3 × 5 минути в стерилна вода. Семената се покълват върху мокра филтърна хартия в продължение на 5 дни и след това се поставят в течна среда за покълване (Murashige and Skoog, Duchefa, арт. № M0231.0025 10 g/l захароза, 500 mg/l MES, pH 5,7) без и с блеомицин (блеомицин сулфат от Streptomyces verticillus, Сигма, кат. не. 15361) с нарастваща концентрация. Съответно, във втори експеримент стерилизираните семена се отглеждат върху агарови плочи (среда за покълване + 2% агар-агар Roth, кат. № 2266.2) без и с блеомицин. И двата експеримента бяха повторени два пъти и съдържаха две повторения.

Имунооцветяване и FISH

Фиксирането на цветни пъпки, подготовката на хромозомно слайдове и FISH, последвано от преброяване на хиазма, бяха извършени съгласно Sánchez-Morán et al. (2001). За идентифициране на отделни хромозоми се извършват 5S и 45S rDNA FISH.

Флуоресценция на място хибридизация със специфични за теломери и центромери сонди беше приложена за идентифициране на хромозоми в метафаза I. 180-bp центромерна повторна проба (pAL) (Martinez-Zapater et al., 1986) беше генерирана чрез PCR, както е описано по-горе (Kawabe and Nasuda, 2005). Теломер-специфичната сонда се генерира чрез PCR в отсъствието на матрица ДНК с помощта на праймерите (TAAACCC)7 и (GGGTTTA)7 (Ijdo et al., 1991).

Имунооцветяване на A. thaliana и Б. рапа ЧВК следваха протокола на Армстронг и Осман (2013). Приложени са следните първични антитела: заешко анти-NSE4A (1: 250) и плъхово анти-ZYP1 (1: 1000 любезно предоставено от Крис Франклин). ZYP1 е A. thaliana напречен филаментен протеин на синаптонемалния комплекс (Higgins et al., 2005). Първичните антитела бяха открити съответно като вторични антитела от магарешко анти-заешко-Alexa488 (Dianova, № 711545152) и козе анти-плъхово-DyLight594 (Abcam, no. Ab98383).

8С листните междуфазни ядра бяха поточно сортирани според Weisshart et al. (2016), а също и имуно-маркирани срещу NSE4A, както е описано по-горе.

Микроскопия

За изобразяване на препарати от фиксирани и живи клетки бяха използвани съответно микроскоп Olympus BX61 (Olympus) и конфокален лазерен сканиращ микроскоп LSM 780 (Carl Zeiss GmbH).

За да се анализира ултраструктурата на имуносигналите и хроматина отвъд класическата граница на Abbe/Raleigh при странична разделителна способност � nm (суперрезолюция, постигната с 488 nm лазер), е приложена пространствено структурирана осветителна микроскопия (3D-SIM) с помощта на 63 × 1.4NA Oil Plan-Apochromat обектив на микроскопска система Elyra PS.1 и софтуера ZEN (Carl Zeiss GmbH). Изображенията бяха заснети отделно за всеки флуорохром с помощта на лазерни линии 561, 488 и 405 nm за възбуждане и подходящи емисионни филтри (Weisshart et al., 2016).


Резултати

Две запазени Nse4 Гените присъстват и се експресират в A. thaliana

Според предишни проучвания за предсказване на субединици SMC5/6 (Schubert, 2009) A. thaliana кодира две Nse4 хомолози: Nse4A (AT1G51130) и Nse4B (AT3G20760) (Фигура 1A,B). И двата протеина на NSE4 показват сходни дължини (NSE4A: 403 aa NSE4B: 383 aa) и висока идентичност на аминокиселинната последователност (67,7%) (допълнителна фигура S1). И двете A. thaliana Протеините на NSE4 показват сходни дължини като тези на пъпчивите дрожди (402 aa), мишки (381 aa за NSE4A 375 aa за NSE4B) и човешки NSE4A (385 aa), но са по -дълги от делящите се дрожди NSE4 (300 aa) и човешките NSE4B (333 aa) протеини (NSE4A 9 NSE4B 10 ).

NSE4A показва относително висока аминокиселинна прилика в сравнение с двете Б. рапа предполагаеми протеини на NSE4 (допълнителна фигура S3) и други растителни видове (допълнителна фигура S4A). Нерастителни организми като деляща се мая, Ентамоеба, диктиостелий, мишка и човек показват по -ниско сходство (допълнителна таблица S5).

Филогенетичният анализ на протеиновите последователности с пълна дължина на видовете евдико и едносемеделни предполага също относително висока консервация и на двете A. thaliana Nse4 гени (допълнителна фигура S4B).

Според базите данни на Uniprot 11 и двете A. thaliana NSE4 протеините притежават запазени С-крайни домени, характерни за други растителни NSE4 протеини (Фигура 1С и допълнителни фигури S1, S3). С-терминалният домен се свързва със SMC5 по подобен начин, както другите молекули на клеизин взаимодействат с техните капа-SMC партньори (Palecek et al., 2006 Hassler et al., 2018). Това взаимодействие е от решаващо значение за функцията на SMC5/6. N-терминалният домейн на NSE4 също е запазен и се свързва със SMC6 (Palecek et al., 2006). В NSE4 на гъбички и гръбначни животни, NSE3/MAGE свързващ домен е идентифициран до N-терминалния клеисинов мотив (Guerineau et al., 2012). Въз основа на анализа на Motif Scan 12, SMC6-свързващият домейн може също да бъде предвиден в NSE4 протеините на A. thaliana (Допълнителна фигура S1). Въпреки това, за да се дефинира ясно този идентифициран регион като SMC6-свързващ мотив, трябва да се извършат експерименти за взаимодействие на протеин и протеин, дисекция на домейн и мутагенеза. Освен това, предполагаемите региони на разграждане и местата на SUMOlisation бяха идентифицирани с помощта на еукариотни линейни мотиви 13 ресурси (допълнителна фигура S1), което предполага, че клетъчното количество NSE4 протеини по време на клетъчния цикъл може да се регулира чрез тяхното протеолитично разграждане.

In silico анализът показва подобно поведение на експресия (с пикове в етапите на млада розетка и цъфтеж) по време на развитието на растенията на Nse4A ген и други гени кандидати за субединици SMC5/6, поддържащи синхронизирана активност (допълнителна фигура S5). Въпреки това, не е ясно дали те действат отделно или като комплекси от няколко субединици в различни комбинации от субединици. In silico анализът също така показва висока съвместна експресия на Nse4A, наред с други, с гени, свързани с мейоза и хроматин (допълнителна таблица S6).

The in silico анализ на относителното ниво на експресия на Nse4A и Nse4B в десет анатомични части на A. thaliana разсад показа, че изразяването на Nse4B се ограничава до генеративни тъкани и семена. Сравнително висока експресия е очевидна само в семената (ембрион и особено ендосперм) (допълнителна фигура S6).

Чрез количествен PCR в реално време открихме това Nse4A е силно изразено в цветни пъпки и корени, но преписи има и в разсад, млади и стари листа (допълнителна фигура S7). В съгласие с предишни проучвания (Watanabe et al., 2009), изразяването на Nse4B в тези тъкани не се открива. Очевидно повечето Nse4B транскрипти присъстват във вече добре развити семена, както е посочено и от in silico анализ (допълнителна фигура S6).

За да се установи дали протеините на NSE4 взаимодействат с другите компоненти на комплекса SMC5/6 (Фигура 1) е извършен анализ на взаимодействия протеин-протеин in silico с помощта на програмата STRING 14. Интересно е, че всички SMC5/6 субединици, достъпни чрез програмата STRING, са идентифицирани като взаимодействащи партньори на NSE протеините с много висок резултат Ϡ.95, което предполага, че както NSE4A, така и NSE4B действат също в рамките на SMC5/6 комплекса. В допълнение, кохезин и кондензин субединици бяха открити като части от една и съща мрежа за взаимодействие протеин-протеин при висок резултат от Ϡ.70 (допълнителна фигура S8). Взаимодействие с фактори на клетъчния цикъл не може да бъде идентифицирано при среден резултат Ϡ.5.

Резултатите показват, че и двете A. thaliana Nse4 гените са силно запазени и че съответните протеини могат да действат в комбинация с други SMC5/6 комплексни компоненти, както и кохезин и кондензин. Въз основа на нивото на изразяване, Nse4A изглежда по-важният ген, въпреки че изглежда, че Nse4B е специализиран да действа по време на развитието на семената.

Избор и молекулярна характеристика на A. thaliana nse4 Мутации и тяхното въздействие върху жизнеспособността на растенията, плодовитостта и ремонта на увреждане на ДНК

От A. thaliana Колекциите SALK, Syngenta SAIL и GABI-Kat, хомо- и хетерозиготни мутанти за вмъкване на Т-ДНК бяха избрани за двата гена (Фигура 1В и Таблица 1). Наличието и позициите на съответните T-DNA инсерции бяха потвърдени чрез PCR, използвайки ген-специфични и T-DNA специфични праймери и чрез секвениране на PCR продуктите (допълнителна таблица S2). С изключение на линия GK-175D11 (интронно вмъкване в Nse4B), всички други вмъквания на Т-ДНК са открити в екзони.

Маса 1

Характеризиране на мутанти за вмъкване на Т-ДНК на A. thaliana Nse4 гени.

Символ на генТ-ДНК мутантзиготностнавикПлодородие на цветен прашец (%)Дължина на силикона (mm)Семена на силикаНабръчкани семена на силика% митотични клетки с мостове/фрагменти% мейоцити с мостове/фрагменти
Метафаза IАнафаза IАнафаза II
Col-wtтегл100 (10790)12.8 (28)44.5 (1468)0.71.5 (417)0 (60)1.2 (67)0 (23)
Nse4ASalk_057130ТойПо -малък98.2 (3808)11.3 ∗ ∗ (24)30.3 ∗ ∗ (726)2.7 ∗ ∗ 11.9 ∗ ∗ (242)8.4 ∗ (59)4.2 (47)10.0 (21)
SAIL_71_A08Той
GK-768H08ХоПо -малък50.2 ∗∗ (6396)10.0 ∗ ∗ (25)21.0 ∗∗ (525)7.8 ∗ ∗ 25.7 ∗ ∗ (175)25.2 ∗ ∗ (115)40.4 ∗∗ (114)47.4 ∗ ∗ (19)
GK-768H08 (допълнено)Хоwt-подобен102 (6270)12.3 ∗ (25)31.8 ∗∗ (795)3.4 ∗∗ 2.6 (373)5.0 ∗ ∗ (121)19.1 ∗∗ (131)15.0 ∗ (20)
Nse4BSAIL_296_F02хоwt-подобен97.2 (3770)10.8 ∗ ∗ (30)30.5 ∗ ∗ (916)1.62.1 (278)0 (59)5.9 (85)8.3 (12)
GK-175D11Хоwt-подобен64.3 ∗∗ (3206)11.3 ∗∗ (30)34,8 ∗ ∗ (1080)2.9 ∗ ∗ 1.7 (178)6.2 ∗∗ (113)17.8 ∗ ∗ (106)0 (18)
Nse4A/Nse4BGK-768H08/SAIL_294_F02Хо/хоПо -малък34.8 ∗∗ (4529)10.2 ∗∗ (30)17.9 ∗∗ (536)5.6 ∗ ∗ 28.6 ∗∗ (619)30.6 ∗ ∗ (72)65.0 ∗ ∗ (172)50,0 ∗∗ (34)

За Nse4A линии Salk_057130 и SAIL_71_A08 могат да бъдат избрани само хетерозиготни мутанти и потомството да се раздели на хетерозиготни и диви видове растения. Това показва изискването на Nse4A за жизнеспособност на растенията. Потвърдените пресечени транскрипти надолу по веригата извън запазената област на хомозиготната линия GK-768H08 (Фигура 1 и Допълнителна Фигура S9) очевидно са в състояние да кодират поне частично функционални протеини. За Nse4B Бяха идентифицирани две хомозиготни линии, SAIL_296_F02 и GK-175D11, съдържащи инсерцията на Т-ДНК във втория екзон и четвъртия интрон, съответно.

Избраните мутанти показват навик за растеж от див тип, само с малко намален размер на растението (особено линия GK-768H08) в сравнение с дивия тип (Фигура 2А и Таблица 1). За да комбинирате мутационните ефекти на nse4A и nse4B, бяха пресечени линии GK-768H08 и SAIL_296_F02. Получените хомозиготни двойни мутанти показват допълнителен намален растеж. Комплементацията на мутацията в линия GK-768H08 от геномния див тип Nse4A construct възстанови жизнеспособността на растението.

По този начин същественият характер на Nse4A се потвърждава. Въпреки че излиза от Nse4B не предизвиква очевидни ефекти върху растежа, тази секунда Nse4 хомологът вероятно не е напълно свободен от функция.

Избраните линии за вмъкване на Т-ДНК бяха допълнително анализирани по-подробно, за да се изследва влиянието на протеините NSE4 върху мейозата и фертилитета. В допълнение към намаления размер на растението, в мутантите са наблюдавани намален брой поленови зърна, размер на силикон и набор от семена заедно със смачкани семена (Таблица 1, Фигура 2В – D и Допълнителна фигура S10). Прекъснатите семена могат да представляват сегрегиращото хомозиготно потомство. Допълването на мутацията в линия GK-768H08 от геномната Nse4A конструкция възстановява плодородието на прашеца и настройката на семената.

За да се изследва реакцията на увреждане на ДНК на nse4 мутанти в сравнение с див тип, ние приложихме блеомицин в различни концентрации в течна среда, за да индуцираме DSBs. Третирането очевидно наруши растежа на разсада както от дивия тип (Col-0), така и от nse4A и nse4B мутанти с увеличаване на концентрацията на блеомицин (допълнителна фигура S11A). За да разберем дали мутациите на nse4 влияят върху способността за възстановяване на растенията, ние проведохме подобен експеримент върху плочи с твърда агарова среда и измерихме дължините на корените на разсад в рамките на 18-дневен растеж (допълнителна фигура S11B). Според двупосочна ANOVA е доказана много значителна разлика между дивия тип и всички мутанти по отношение на развитието на корените без лечение с блеомицин. В допълнение, значително намалени темпове на растеж на корените и при трите мутанта са налице след прилагане на блеомицин при всички концентрации (0,25 0,5 и 1,0 μg/ml) (допълнителна фигура S11C). Тези резултати предполагат участието на NSE4A и NSE4B в възстановяването на индуцирани DSBs и че техните мутации могат да намалят ефективността на възстановяване в сравнение с протеините от див тип.

NSE4 е от съществено значение за правилната мейоза

Намаленият брой на поленовите зърна на nse4 мутанти предполагат мейотични нарушения. Следователно, ние оцветихме мейоцитите чрез DAPI. По време на профаза I не бяха открити видими промени в nse4A мутант GK-768H08 в сравнение с дивия тип. Въпреки това, анафазни мостове, хромозомни фрагменти и микроядра се появяват в по-късни мейотични етапи и съответно в тетрадни клетки (Фигура 3А и допълнителна фигура S12). Микроядрата са възможен продукт на фрагментация на хромозомите. В допълнение към линията GK-768H08, всички разследвани nse4 мутанти показват увеличение на мейотичните дефекти, с ясно повишено ниво в хомозиготните GK-768H08/SAIL_294_F02 двойни мутанти. Допълването на мутацията в линия GK-768H08 от геномната Nse4A конструкт премахна основно натрупването на мейотични аномалии (Таблица 1 и Допълнителна Фигура S13).

Мейотични дефекти в nse4 мутант GK-768H08. (А) Нарушена мейоза (анафазни мостове, фрагменти) в A. thaliana мутант GK-768H08 в сравнение с дивия тип (wt). (Б) Хромозомна фрагментация в GK-768H08 по време на анафаза I. Теломерите и центромерите бяха белязани от FISH с помощта на центромер- и теломер-специфични сонди. (° С) Общ брой субтеломерни, перицентромерни и интерстициални хромозомни фрагменти в 18 мейотични клетки на GK-768H08 мутант. Пръти = 10 μm.

За по -подробно изучаване на мейотичните аномалии бяха проведени FISH експерименти, използващи 5S и 45S rDNA сонди за хромозомна идентификация (допълнителна фигура S14). Анализът на nse4A мутант GK-768H08 предполага, че появата на разтегнати биваленти, вероятно причиняващи хромозомни фрагменти, не е свързана със специфични хромозоми. Това показва, че дефектите могат да бъдат предизвикани чрез нарушаване на общ мейотичен процес.

Теломер- и центромер-специфични FISH сонди бяха приложени за оценка на съотношението на перицентромерни, интерстициални и субтеломерни фрагменти по време на анафаза I. Установено е, че повечето фрагменти са от субтеломерен произход, последвани от интерстициални фрагменти (Фигура 3B,C). Очевидно фрагментите са резултат от нарушена степен на кондензация на хроматин по биваленти на пръчките. Увеличеният брой биваленти на пръчки в мутантите изглежда е следствие от намалена рекомбинация, водеща до по -малко хиазмати. За да се провери тази хипотеза, честотата на хиазма на nse4A мутант GK-768H08 (н = 43) беше оценено и беше установено, че е почти идентично с �.0 хиазми на клетка на диакинеза/метафаза I с тази на дивия тип (Higgins et al., 2004). Следователно отрязването на NSE4A изглежда не влияе върху броя на хиазмите.

Появата на нарушена мейоза предполага участието на NSE4 в мейотичните процеси. Наистина, трансгенни A. thaliana мейоцитите, експресиращи gNse4A :: GFP конструкцията под контрола на ендогенния промотор, показват линейни сигнали при пахитен, характерни за синаптонемалния комплекс (Фигура 4А). В допълнение, чрез прилагане на анти-GFP антитела NSE4A е доказано, че присъства в клетки G2, лептотен, зиготен и пахитен. След основно изчезване от мета- и анафаза I хромозоми, NSE4A се възстановява в профаза II, тетради и млад прашец (Фигура 4В). За да се потвърди наличието на NSE4A в сродни видове, имуномаркиране на Б. рапа мейоцити със NSE4A-специфични антитела и със ZYP1, A. thaliana беше проведен протеин на напречната нишка на синаптонемния комплекс при пахитена. Съвместната локализация на двата протеина показва наличието на NSE4A в синаптонемалния комплекс по време на пахитена (Фигура 4С). Имуномаркирането на ZYP1 в пахитени мейоцити на nse4A мутант GK-768H08 показва, че тази мутация не променя структурата на синаптонемалния комплекс (допълнителна фигура S15).

Локализация на NSE4A по време на мейозата на A. thaliana (А, Б) и близките видове Б. рапа (° С). (А) Линейно подобни NSE4A-GFP сигнали се откриват в нефиксиран мейоцит при пахитен на трансгенен pnse4A :: gNse4A :: GFP A. thaliana растение. (Б) Динамика и локализация на NSE4A-GFP сигнали по време на мейоза на pnse4A::gNse4A::GFP трансгенни A. thaliana растения, открити от анти-GFP. Сигналите на NSE4A-GFP се откриват в клетки G2, лептотен, зиготен и пахитен. Сигналите са слаби или не се виждат съответно в кондензирани хромозоми на метафаза I и анафаза I, но се възстановяват в профаза II, тетради и млад прашец. (° С) Anti-AtNSE4A маркира синаптонемалния комплекс на Б. рапа и се колокализира в ZYP1 по време на пахитена. Сивият цвят показва хроматин, противооцветен с DAPI. Барове = 10 μm.

Ние заключаваме, че и двата NSE4 протеина, но NSE4A отново по -съществено от NSE4B, участват в мейотичните процеси за постигане на нормална фертилитет. Въпреки това, и двата протеина изглежда не влияят върху честотата на хиазмата, въпреки че е доказано, че NSE4A присъства в синаптонемалния комплекс по време на профаза I.

NSE4 присъства в междуфазните ядра на меристемни и диференцирани клетки

Подобно както по време на мейозата, аномалии възникват по време на митоза в ядрата на соматичните цветни пъпки A. thaliana nse4 мутанти. Тези митотични дефекти се срещат предимно в nse4A мутанти и по-малко изявени в Nse4B нокаут мутанти (Фигура 5).

Митотични дефекти (анафазни мостове, изоставащи) в ядра на соматични цветни пъпки на A. thaliana nse4 мутанти (А). Диаграмата (Б) показва честотата (%) на аномалиите в мутантите в сравнение с дивия тип. Процентът на аномалии е ясно увеличен в nse4A мутанти SALK_057130 и GK-768H08, както и в хомозиготен двоен мутант GK-768H08/SAIL_296_F02, представляващ и двете nse4A и nse4B мутации, респ. Допълването на мутацията в GK-768H08 ясно намалява броя на аномалиите, което показва, че те са индуцирани от дисфункцията на гена Nse4A. Броят на анализираните клетки е посочен над диаграмите.

За изобразяване на живо gNSE4A::GFP сигналите бяха открити чрез конфокална микроскопия в кореновите меристемни клетки. NSE4A присъства в междуфазните ядра, изчезва главно по време на митоза от хромозомите и се възстановява в телофазата в хроматина. По време на мета- и анафазата остава само леко маркиране на цитоплазмата (Фигура 6А). За да се анализира разпределението на NSE4A на ултраструктурно ниво, фиксираните интерфазни ядра бяха оцветени с анти-GFP и беше извършена микроскопия със супер разделителна способност (3D-SIM). Thereby, it became obvious that NSE4A is distributed within euchromatin, but absent from nucleoli and chromocenters. During meta- and anaphase only few NSE4A signals were present within cytoplasm, confirming the live cell investigations ( Figure 6B ).

The localization of NSE4A in root meristem cells. (А) Global view of a living A. thaliana root meristem expressing a genomic NseA::GFP construct under the control of the endogenous Nse4A промоутер. The cell undergoing mitosis (in the rectangle) shows that the nuclear NSE4A-GFP signals are present in interphase (0 min), disappear from the chromosomes during metaphase (2� min) and are recovered in telophase at chromatin (26 min). During metaphase a slight cytoplasm labeling is visible. (Б) The ultrastructural analysis by super-resolution microscopy (SIM) confirms the presence of NSE4A within euchromatin, and indicates its absence from the nucleolus (n) and heterochromatin (chromocenters, arrows) in root meristem G1 and G2 nuclei. During meta- and anaphase NSE4A mainly disappears from the chromosomes, but stays slightly present within the cytoplasm. In young daughter nuclei (G1 phase) NSA4A becomes recovered. The localization of NSE4A-GFP expressed by pnse4A::gNse4A::GFP transgenic A. thaliana plants was detected by anti-GFP antibodies in fixed roots.

3D-SIM has also been applied to demonstrate the distribution of NSE4A in differentiated nuclei. Similar as in meristematic tissue, somatic flower bud and 8C leaf interphase nuclei display NSE4A exclusively within euchromatin ( Figure 7 ).

The distribution of NSE4A in differentiated somatic flower bud and 8C leaf interphase nuclei analyzed by 3D-SIM. In agreement, both NSE4A antibodies (anti-NSE4A) and NSE4A-EYFP signals detected by anti-GFP antibodies indicate that NSE4A is distributed within euchromatin, but absent from heterochromatin (DAPI-intense chromocenters, arrows). The NSE4A labeling visible in the merged image of the 8C nucleolus (maximum intensity projection) originates from optical sections outside of the nucleolus.

We conclude that, in addition to their meiotic function, NSE4 proteins play also a role in somatic tissue, due to its exclusive presence within the euchromatin of cycling and differentiated interphase nuclei. NSE4A is more prominent than NSE4B also in somatic tissue.


3 Design of Optogenetic Proteins

Protein engineering strategies for optogenetic proteins involve a photosensory domain (e.g., the ones previously discussed) as well as an actuating module. Their covalent connection is usually mediated with protein linkers that need to be optimized in length and structure, depending on the engineering strategy and the requirements for coupling between the modules. [ 101-103 ] The choice of the photosensory domain can be based on structural considerations of the protein itself or unique properties that different photosensory domains contain.

Such structural considerations can involve the homology to sensory domains that are naturally linked to the actuating module, which make protein engineering easier through “domain swapping” of, for example, a small molecule or hormone sensing domain with a photoactivatable domain. In other cases, the actuation module might be incorporated into the structure of a photosensory protein, which sets special structural and sequence requirements. Also, it may be of interest to reduce the size of a photosensory domain, or in other cases, to provoke sterical hindering. Similarly, certain properties of photosensory domains might be crucial for specific applications. For example, if highly dynamic optoproteins are desired, fast кизключен rates or light sensors that have an inactivating wavelength should be considered. However, if light-toxicity or light-delivery is problematic, high light-sensitivity and slow dark-reversion might be preferable. Also dark to light state fold-inductions of different photoregulators can be important for certain applications, although such a comparison might be case-specific and cannot always be taken from other studies in the literature. Availability of the chromophore in the used organism or medium could be another consideration.

Usually, the choice of the actuating module is very case-specific and depends on the application that the optoprotein needs to fulfill and the output it should produce, and will therefore not be further discussed. However, this section will extract general principles from successful previous optoprotein engineering efforts. Another important aspect is the screening of the functionality of optoproteins: As the protein engineering efforts might require large libraries, high-throughput methods [ 104 ] for functional screening, such as selection systems or fluorescence readouts, are preferred.

A general aspect of optogenetic proteins is that light-regulation is always based on conformational changes of the photosensory domain. Different classifications for photoactivatable proteins were previously used (e.g., [ 99, 105-108 ] ), however, we chose to classify light-regulated proteins slightly differently: To control the activity of the protein of interest, two general concepts were applied, which are either proximity- or protein-structure-based, and in some cases combined approaches are needed.

3.1 Proximity-Based Activity Control: Intermolecular Light-Control

The distance between proteins is an ubiquitous regulation factor in biology. [ 109 ] For example, assembly of multiple subcomponents is required to initiate transcription at the location of a promoter, and several factors are required to interact for protein transport or degradation. Both soluble and membrane-bound proteins are mostly symmetrical oligomeric complexes with two or more subunits. This makes complexes more stable due to reduced solvent area, provides a form of error control in protein synthesis and regulation, and allows cooperative function such as allosteric regulation and multivalent binding. [ 110 ] Chemicals and external signals can induce oligomerization of proteins, such as receptors, that subsequently initiate signaling and cellular responses. [ 111 ] The underlying regulation mechanism is based on proximity and distance of specific proteins. [ 109 ] Such proximity-based regulation is also the basis of many natural light-sensing modules in which the interaction, and therefore the distance of the interaction partners, is controlled through light. Due to allosteric changes of the photosensitive proteins upon light-induction, an interaction surface is exposed, which either allows for interaction with other identical photosensors (homodimerization or oligomerization), or for interaction with other proteins (heterodimerization). Both concepts can be utilized for proximity-based control. Therefore, proximity-based light control involves at least two fusion proteins.

Activation: inactive protein domains fused to photoactivatable domains which upon a light-input are assembled into an active protein

Recruitment: protein-recruitment of an active protein to a specific location of action

3.1.1 Activation

For the first case, light regulates assembly or release of domains necessary for the function of the protein. Prominent targets for proximity-based protein activation are signaling kinases. These kinases react to a plethora of environmental and cellular cues and control diverse functions of proteins from changing their expression, activity or localization, through altering their phosphorylation with serine, threonine, and tyrosine as their main targets. Such kinases usually show multidomain structures, containing a sensing domain that reacts to external cues often through induced oligomerization and autoactivation. [ 111 ] Light-controlled homodimerization domains were used instead of the sensing domains to implement optogenetic control usually through homodimerization. [ 112-118 ]

Heterodimerization, however, can be used if two different interaction partners are needed for the function of a protein. This is for example the case for synthetic split proteins which hold great potential for implementation of optogenetic regulation. In split protein approaches, a functional enzyme is artificially fragmented into inactive subunits. These inactive subunits are fused to light-inducible dimerization domains which reconstitute the enzyme to the active protein. [ 108, 119-121 ] An example for this is the light-inducible T7 RNA polymerase, [ 120 ] which consists of two inactive split parts that are reconstituted upon light-induced dimerization of photosensory domains (Фигура 4A left).

3.1.2 Recruitment

In the second case of proximity-based control, light initiates the subcellular localization of a constitutive active protein to a location of action. For example, light-inducible heterodimerization domains were used to recruit transcription activation domains to specific sites of a promoter through promoter-bound DNA-binding proteins to initiate transcription (Figure 4A right). [ 2, 13, 122 ] In a highly similar strategy, DNA and histone modification enzymes such as DNA methyltransferases, histone deacetylases, methyltransferases, and acetyl–transferase inhibitors were used instead of transcription regulators for epigenetic regulation. [ 123, 124 ] Another widely used example is light-induced recruitment of proteins to membranes [ 125 ] where they exhibit their function, such as cAMP-dependent protein kinases which phosphorylate membrane bound substrates. [ 125, 126 ]

In both proximity-based activation and recruitment, the photosensitive domain and the effector domain(s) function independently. Engineering of such regulators mainly requires structural considerations to avoid interfering with the function of the actuator domain and to allow for correct assembly of split proteins [ 120 ] —factors that have to be considered in the choice of the light-inducible domain as well as the type of linker, its length, and its structure. [ 65, 102, 120 ]

3.2 Protein-Conformation-Based-Light Control: Intramolecular Light-Control

While proximity-based light control always involves two separate fusion proteins, allosteric conformation-based approaches only involve one protein which consists of a fusion of the effector domain and the light-inducible domain(s). The transition from the dark- to the light-induced state of photoactivatable proteins initiates a structural rearrangement that is transmitted to the effector domain leading to allosteric protein activity change or steric effects, for example, blocking and release of the active site of the effector domain.

The photoreceptors LOV2 from Avena sativa or from Arabidopsis thaliana are two prominent examples that have been used for such intramolecular light-control. The structural rearrangement upon blue-light stimulation leads to the release of a C-terminal helix (Jα-helix) from the PAS core. [ 127 ] Although this mechanism of LOV2 was also utilized for intermolecular light control, [ 128, 129 ] the dramatic conformational change makes this photosensor attractive for intramolecular light-control approaches.

3.2.1 Allosteric Regulation

Building upon studies that show that domain insertion into enzymes can be used for allosteric regulation, [ 130 ] in a pioneering example, LOV domains were used to implement light-control in a similar manner. [ 131 ] The light-induced conformational change of LOV2 is transmitted to the protein into which it is inserted, changing its activity and/or function. Such an engineering approach requires X-ray or NMR protein structures or homology models and detailed structure–function information to preselect candidate sites for insertion positions, which are usually located in surface exposed flexible loops at not conserved residues of the target protein. [ 132 ] An example are OptoNBs, [ 133 ] in which light-induced conformational changes of photosensory domains are transmitted to nanobodies leading to changes in their binding affinities (Figure 4B left).

3.2.2 Steric Regulation

In contrast to allosteric regulation, steric approaches utilize the light-induced conformational changes of a photosensory domain to change the accessibility of functionally important sites of the regulated protein (e.g., active site, regulator binding, or recognition sites). For example, the Jα-helix of LOV2 was successfully modified to incorporate signal peptides of different functions, which upon light-induction are released from the PAS core and only then fulfil their function, for example, nuclear localization, [ 134 ] protein degradation, [ 135 ] or other functional domains [ 136 ] (Figure 4B right).

Although LOV2 is a prominent example for protein conformation based light control, other photoregulators were also used for this type of control. For example Dronpa mutants were employed for light-inducible steric hindering of active sites. [ 137, 138 ] These mutants are dimeric or tetrameric, monomerize with cyan light and revert by either homodimerizing (Dronpa145K/N) or homotetramerizing (Dronpa145N) with UV light. [ 139 ] N- and C-terminal fusion of Dronpa to a protease was used for steric blockage of interaction sites, which is removed with the light-input and monomerization of the photosensor. [ 139 ]


Арабидопсис Chloroplastic Glutaredoxin C5 as a Model to Explore Molecular Determinants for Iron-Sulfur Cluster Binding into Glutaredoxins*

Unlike thioredoxins, glutaredoxins are involved in iron-sulfur cluster assembly and in reduction of specific disulfides (т.е. protein-glutathione adducts), and thus they are also important redox regulators of chloroplast metabolism. Using GFP fusion, AtGrxC5 isoform, present exclusively in Brassicaceae, was shown to be localized in chloroplasts. A comparison of the biochemical, structural, and spectroscopic properties of Арабидопсис GrxC5 (WCSYC active site) with poplar GrxS12 (WCSYS active site), a chloroplastic paralog, indicated that, contrary to the solely apomonomeric GrxS12 isoform, AtGrxC5 exists as two forms when expressed in Ешерихия коли. The monomeric apoprotein possesses deglutathionylation activity mediating the recycling of plastidial methionine sulfoxide reductase B1 and peroxiredoxin IIE, whereas the dimeric holoprotein incorporates a [2Fe-2S] cluster. Site-directed mutagenesis experiments and resolution of the x-ray crystal structure of AtGrxC5 in its holoform revealed that, although not involved in its ligation, the presence of the second active site cysteine (Cys 32 ) is required for cluster formation. In addition, thiol titrations, fluorescence measurements, and mass spectrometry analyses showed that, despite the presence of a dithiol active site, AtGrxC5 does not form any inter- or intramolecular disulfide bond and that its activity exclusively relies on a monothiol mechanism.

The atomic coordinates and structure factors (codes 3RHB и 3RHC) have been deposited in the Protein Data Bank, Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, Rutgers University, New Brunswick, NJ (http://www.rcsb.org/).

This work was supported, in whole or in part, by National Institutes of Health Grant GM62524 (to M. K. J.). This work was also supported by the Alexander von Humboldt Foundation (to J. P. J.), Agence Nationale de la Recherche Grant JC07_204825 (to J. C. and N. R.), and Deutsche Forschungsgemeinschaft Grant Di346-14 (to K. J. D.).


Признания

I thank Matthew W. Hahn for suggestions on CAFE analysis Tomislav Domazet-Lošo for suggestions on phylostratigraphy analysis Manyuan Long, Yong Zhang, Jie Guo, and anonymous reviewers for comments about this work and Tina Hu for proofreading and improving the manuscript. Especially, I am very grateful to Detlef Weigel and Song Ge for their long-term support and also valuable comments on this work. This work was supported by 100 talents program of Chinese Academy of Sciences and the Max Planck Society.

Таблица S1. GO annotation of 41 rapidly evolved gene families.

Таблица S2. Functional annotation of 41 rapidly evolved gene families.

Таблица S3. Fixation rate of A. thaliana genes or gene families in each phylostratum (genes/duration of interval or gene families/duration of interval).

Таблица S4. The fraction of A. thaliana genes in each phylostratum that can be annotated to GO biological process.

Таблица S5. GO annotation of A. thaliana genes in each phylostratum in terms of proportion of major biological processes (%).

Table S6. Protein sizes of A. thaliana genes in each phylostratum.

Table S7. Изразяване на A. thaliana genes in each phylostratum.

Table S8. Divergences between A. thaliana genes of each phylostratum and their orthologous genes in A. lyrata.

Table S9. Divergence time of each node on the phylogeny of green plants.

Моля, обърнете внимание: Издателят не носи отговорност за съдържанието или функционалността на каквато и да е подкрепяща информация, предоставена от авторите. Всички заявки (различни от липсващото съдържание) трябва да бъдат насочени към съответния автор на статията.


Резюме

AINTEGUMENTA-like (AIL) proteins are members of the APETALA 2/ETHYLENE RESPONSE FACTOR (AP2/ERF) domain family of transcription factors involved in plant growth, development, and abiotic stress responses. However, the biological functions of AIL members in pumpkin (Cucurbita moschata Duch.) remain unknown. In this study, we identified 12 AIL genes in the pumpkin genome encoding proteins predicted to be localized in the nucleus. Phylogenetic analysis showed that the AIL gene family could be classified into six major subfamilies, with each member encoding two AP2/ERF domains separated by a linker region. CmoAIL genes were expressed at varying levels in the examined tissues, and CmoANT genes showed different expression patterns under auxin (IAA), 1-naphthylphthalamic acid (NPA), and abscisic acid (ABA) treatments. Ectopic overexpression of CmoANT1.2 в Арабидопсис increased organ size and promoted growth of grafted plants by accelerating graft union formation. However, there was no significant difference at the graft junction for WT/WT and WT/ANT under IAA or NPA treatments. Taken together, the results of this study provide critical information about CmoAIL genes and their encoded proteins, and suggest future work should investigate the functions of CmoANT1.2 in the grafting process in pumpkin.


Genome-Wide Identification Analysis of the Auxin Response Factors Family in Nicotiana tabacum and the function of NtARF10 in Leaf Size Regulation

Auxin is well recognized for its involvement in several developmental processes like floral and leaf development and shoot elongation. The transcriptional regulation of auxin-responsive genes is mediated via auxin response factors (ARF). In this study, we identified 46 ARF genes in Nicotiana tabacum, performed phylogenetic analysis and investigated their structure, conserved domains, and motifs. Our results demonstrate that some of NtARF genes are regulated by mi-RNAs and expression in multiple tobacco tissues. Additionally, the leaf NtARFs display a diverse expression pattern in vein and shoot apical meristem in response to exogenous auxin stimulus. Трансгенни NtARF10-overexpressing Арабидопсис plants exhibit larger leave areas, cell area, and more numerous cell numbers compared to wild-type plants and include several upregulated genes involved in cell division and expansion, including AtCYCD3, AtTCP1, AtTCP20, AtXTH33, и AtARGOS. This suggests NtARF10 might play a role in the regulation of leaf size. Our study contributes to a better understanding of the characteristics of the ARF family in tobacco and provides a basis for further functional research into NtARFs.

Това е визуализация на абонаментно съдържание, достъп чрез вашата институция.


Признания

We gratefully acknowledge Annette Thelen and the Genomic Technology Support Facility at Michigan State University for valuable assistance with the Affymetrix microarray analysis, Dr Thomas Whittam (Department of Microbiology, Michigan State University) and Dr Arlette Darfeuille-Michaud (Pathogenie Bacterienne Intestinale, Clermont-Ferrand, France) for providing E. coli strains, and Dr Thomas Whittam for providing lab space for work with human pathogenic bacteria. Arabidopsis EST clones used for RNA blot hybridization were obtained from the Arabidopsis Biological Resource Center. This work was supported by research grants from the US Department of Energy (DE-FG02-91ER20021) and National Institutes of Health (1R21AI060761-01) to S.Y.H., a postdoctoral fellowship to R.T. from the US Department of Agriculture, a US Department of Education GAANN Graduate Fellowship and a Michigan State University Plant Science Graduate Fellowship to W.U., and funds from the Center of Microbial Pathogenesis at Michigan State University to S. Y. H. and Thomas Whittam.

Фигура S1. RNA blot analysis of differentially expressed genes identified by microarray analysis.

Фигура S2. RNA blot analysis of the PAMP-responsive gene Flagellin-Induced Receptor Kinase 1 (FRK1).

Фигура S3. In planta multiplication of bacterial flagellin mutants.

Фигура S4. Mapman 'secondary metabolism' and 'photosynthesis' displays created using COR toxin- and TTSS-regulated genes.

Figure S5. Expression profile of genes involved in tryptophan, glucosinolate, and related biosynthetic pathways.

Figure S6. Expression profile of 44 auxin-related genes.

Figure S7. Expression profile of cytokinin-related genes.

Table S1 Non-redundant list of 2800 differentially-regulated Arabidopsis genes identified by microarray analysis

Таблица S2 736 PAMP-regulated Arabidopsis genes

Таблица S3 correlation values for the 1 × 10 8 and 5 × 10 7 bacteria mL -1 comparisons

Таблица S4 Known and predicted kinases induced by PAMP perception

Таблица S5 275 TTSS-induced Arabidopsis genes identified from the Pst COR - vs. Pst COR - hrpS comparison (5 × 10 7 bacteria mL -1 , 10 HPI)

Table S6 COR toxin-regulated Arabidopsis genes

Таблица S7 TTSS-regulated Arabidopsis genes

Please note: Wiley-Blackwell are not responsible for the content or functionality of any supporting materials supplied by the authors. Any queries (other than missing material) should be directed to the corresponding author for the article.

Име на файл Описание
TPJ_2725_sm_FigureS1A.eps107.5 KB Поддържащ информационен елемент
TPJ_2725_sm_FigureS1B.eps104.4 KB Поддържащ информационен елемент
TPJ_2725_sm_FigureS2.eps244.2 KB Поддържащ информационен елемент
TPJ_2725_sm_FigureS3.eps29.4 KB Поддържащ информационен елемент
TPJ_2725_sm_FigureS4.eps171.5 KB Поддържащ информационен елемент
TPJ_2725_sm_FigureS5.eps72.3 KB Поддържащ информационен елемент
TPJ_2725_sm_FigureS6.eps75 KB Поддържащ информационен елемент
TPJ_2725_sm_FigureS7.eps50.1 KB Поддържащ информационен елемент
TPJ_2725_sm_TableS1.xls6.7 MB Поддържащ информационен елемент
TPJ_2725_sm_TableS2.xls186.5 KB Поддържащ информационен елемент
TPJ_2725_sm_TableS3.xls18 KB Поддържащ информационен елемент
TPJ_2725_sm_TableS4.xls26 KB Поддържащ информационен елемент
TPJ_2725_sm_TableS5.xls53.5 KB Поддържащ информационен елемент
TPJ_2725_sm_TableS6.xls205.5 KB Поддържащ информационен елемент
TPJ_2725_sm_TableS7.xls167 KB Поддържащ информационен елемент

Моля, обърнете внимание: Издателят не носи отговорност за съдържанието или функционалността на каквато и да е подкрепяща информация, предоставена от авторите. Всички заявки (различни от липсващото съдържание) трябва да бъдат насочени към съответния автор на статията.


Гледай видеото: Shubhangi Moharekar Arabidopsis Thaliana ABC Model Chunk 3 5 (Февруари 2023).