Информация

Може ли Taq полимераза да се използва вместо полимераза Vent exo (-)?

Може ли Taq полимераза да се използва вместо полимераза Vent exo (-)?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Вместо да използвам полимераза Vent exo (-), мога ли да отида с обичайното Taq полимераза?

Променят ли се PCR условията (температурата и концентрациите на основната смес) в тези две условия? Променят ли се праймерите (последователността и концентрациите), ако използваме vent exo вместо Taq полимераза и обратно? Ако праймерите са проектирани специално за Vent exo (-), как мога да променя PCR условията, така че да мога да използвам същите праймери (предназначени за vent exo), като използвам Taq полимераза?


Самият аз не съм правил ARMS PCR, така че отговорът ми се основава на теория и може да има други практически фактори, които съм пренебрегнал.

Характерната особеност на Vent exo(-) полимеразата е липсата на екзонуклеазна активност в сравнение с обикновената Vent полимераза. ARMS използва факта, че несъответствието на 3' позиция предотвратява удължаването на грунда. За да работи това, е важно да се използва полимераза без екзонуклеазна активност, тъй като такава полимераза може да "поправи" несъответствието и целият метод няма да работи. Taq полимеразата също няма екзонуклеазна активност, така че на теория би трябвало да можете да я използвате за този експеримент.

Праймерите не трябва да се сменят за различни полимерази, полимеразният буфер обаче е различен и не бих препоръчал използването на грешен.


DUTP, конюгирани с цвитерионни Cy3 или Cy5 флуорофорни аналози, са ефективни субстрати за ДНК амплификация и маркиране с Taq полимераза

Авторите искат да се знае, че според тях първите трима автори трябва да се разглеждат като съвместни първи автори.

Олга А Заседателева, Вадим А Василисков, Сергей А Суржиков, Виктория Е Кузнецова, Валерий Е Шершов, Тимур О Гусейнов, Игор П Смирнов, Роман А Юрасов, Максим А Спицин, Александър V Чудинов, dUTPs, конюгирани с цвитерионен Cy3 или Cy5 аналог флуороп са ефективни субстрати за ДНК амплификация и маркиране с Taq полимераза, Изследване на нуклеинови киселини, том 46, брой 12, 6 юли 2018 г., страница e73, https://doi.org/10.1093/nar/gky247


РЕЗЮМЕ

Ние синтезирахме C5-модифицирани аналози на 2'-дезоксиуридин трифосфат и 2'-деоксицитидин трифосфат и ги изследвахме като субстрати за PCR, използвайки Taq, Tth, отдушник (екзо-), KOD Dash и КОД(екзо-) полимерази и pUC 18 плазмидна ДНК като матрица. Тези анализи бяха извършени върху два различни усилващи области на pUC18 с различно съдържание на T/C, за които се очаква да имат относително високи бариери за включване на модифициран dU или dC. Въз основа на 260 различни анализа (26 модифицирани трифосфати × 5 ДНК полимерази × 2 усилващи области), изглежда, че генерирането на пълноразмерен PCR продукт зависи не само от химичните структури на заместването и естеството на полимеразата, но също така дали заместването е на dU или dC. Освен това, шаблонната последователност силно повлия на генерирането на PCR продукта, в зависимост от комбинацията от ДНК полимераза и модифициран трифосфат. Чрез изследване на реакциите на удължаване на праймера, използвайки праймери и шаблони, съдържащи C5-модифицирани dUs, открихме, че модифициран dU в 3′ края на удължената верига силно влияе върху каталитичната ефективност на ДНК полимеразите, докато модифициран dU срещу мястото на удължаване на шаблона веригата има по-малко влияние върху каталитичната ефективност.


РЕЗУЛТАТИ

Полимеризацията на кратък участък от ДНК (микроген) беше наблюдавана за първи път, когато направихме PCR с праймер KY-794 и KY-795 (фиг. ​ (фиг.1 1 А) при дълги PCR условия (24). Тези праймери образуват осем комплементарни базови двойки в областта 3′ и имат единичен допълнителен нуклеотид в края на 3′-OH (на KY-795), който не се сдвоява с KY-794 (фиг. ​ (фиг. 1 1 А). Тези праймери дават хетерогенен “намазана” ДНК продукт без матрица ДНК след 35 цикъла на PCR с всичките четири dNTP и ензимна смес от Taq и Pwo полимерази (подобен резултат е показан на Фиг. ​ Фиг.2 2 Б). Размерите на тези хетерогенни ДНК продукти варират от � bp до 㸒 kb, а увеличеният брой цикли води до производството на по-голяма популация от ДНК (данните не са показани). Ние се интересувахме от произхода на тези хетерогенни ДНК молекули и определихме нуклеотидните последователности след клонирането им в плазмиден вектор. Показано е, че клонираните продукти включват тандемни повторения на кратък участък от ДНК (фиг. ​ (фиг.1 1 А). Тази 36-bp повтаряща се единица е праймер димерен продукт (25) на KY-794 и KY-795.

Тандем от глава до опашка повтаря образуването в MPR. (А) Праймери, използвани в MPR, праймер димер и схематично представяне на тандемен полимер от глава до опашка от димер на праймер. Несъответстващият нуклеотид в края на 3′-OH е в зелено. (Б) Пример за микрогенен полимер (pYT005). Вмъкнатите нуклеотиди или делеция (Δ) в точките на свързване на микрогенна единица са в червено.

Ефекти от несъответствието на 3′-OH и 3′𠄵′ екзонуклеазната активност на ДНК полимеразата върху MPR. (А) Четири комплекта праймери, които имат двоен, единичен, единичен и никакъв 3′-OH несъответстващ нуклеотид(и). Несъответстващите нуклеотиди са в зелено. (Б) MPR продукт (10 μl) се фракционира през 1.2% агарозен гел. Lane M, маркер за размер на ДНК (1-Kb ДНК стълбица Life Technologies, Gaithersburg, MD). Размерите на някои фрагменти са посочени вляво (в килобази). Извършени са четиридесет и пет цикъла на MPR и температурата на отгряване е 69ଌ. (° С) Vent (wt) или Vent (exo − ) ДНК полимераза беше използвана вместо Expand Taq полимеразна смес, бяха извършени 45 цикъла на MPR и температурата на отгряване беше 69ଌ. (д) Пример за микрогенен полимер (pYT094), създаден от KY-854 и KY-795 с Vent (exo − ) ДНК полимераза. Изтриванията (Δ) на кръстовища са в червено. Нуклеотидите, произхождащи от несъответствията на 3′-OH, са в зелено.

Повтарящата се единица полимеризира по начин от глава до опашка без изключение, доколкото е изследвано, и е придружена от вмъкване или изтриване на няколко нуклеотида в техните връзки. В един пример (фиг. ​ (фиг.1 1 Б) от седемте кръстовища, четири са имали вмъквания от един или четири нуклеотида, два са имали делеция на един нуклеотид, а една връзка е без вмъкване⿞letion. Въпреки че тетра-нуклеотид CCGG се вмъква често в кръстовища от много клонове, други вмъкнати нуклеотиди включват единичен T или C или тринуклеотидите CGG, GCG и CCA (данните не са показани). Тези инсерционни последователности може да не са произлезли от праймерите, тъй като тетрануклеотидът CCGG (или неговият комплемент GGCC) не се съдържа в последователностите на тези праймери.

Праймерите KY-794 и KY-795 бяха получени на ДНК синтезатор и бяха пречистени чрез HPLC. За да се изключи възможността наблюдаваното образуване на полимер да се дължи на неочаквана модификация на праймерите по време на синтеза на ДНК или HPLC пречистване, друг набор от праймери със същите последователности като KY-794 и KY-795 беше синтезиран с помощта на друг ДНК синтезатор и беше пречистен на колона за гел филтриране NAP-10 (Pharmacia Biotech, Упсала, Швеция). Тези новосинтезирани праймери дават подобни полимери на димер на праймер (данните не са показани), което предполага, че полимеризацията не се дължи на аберантен синтез или неочаквана модификация на праймери KY-794 и KY-795. Полимерите на димера на праймера бяха получени възпроизводимо с тези праймери при описаните условия и ние нарекохме тази реакция реакция на микрогенна полимеризация (MPR).

Фактори, които влияят върху ефективността на полимеризацията при MPR.

За да определим факторите, които дават ефективна полимеризация на праймерните димери в MPR с KY-794 и KY-795, проведохме следните експерименти. Първо, ние се фокусирахме върху единичния допълнителен нуклеотид в 3′-OH края на KY-795, който не се сдвоява с KY-794 (фиг. ​ (фиг.1 1 А). За да оценим приноса на несъответствието в 3′-OH краищата на праймери върху MPR, ние подготвихме четири двойки праймери, които имат двойни, единични и несъответстващи двойки(и) в техните 3′-OH краища (фиг. & #x200B (фиг.2 2 А). След 45 цикъла на MPR със смес от Taq и Pwo полимерази, праймерната двойка с двойни несъответствия (KY-854𯞕) произвежда най-дифузната намазка от ДНК, докато праймерите, които нямат несъответствия в техните 3′-OH краища (KY-803𯞃) не произвеждат при тези условия размазана ДНК (Фиг. ​ (Фиг.2, 2 Б). Тези резултати показват, че несъответстващите базови двойки при краищата на праймер 3′-OH са необходим фактор в MPR. Ефектите от едно несъответствие са зависими от нуклеотидната последователност на праймера. Едно базово несъответствие в 3′-OH края на KY-795 доведе до производството на размазана ДНК, докато несъответствието на KY-854 не произвежда полимер при подобни условия. Факторите, довели до тази разлика, не са известни.

Второ, тествахме ефекта на различни полимерази върху MPR. Дългият PCR протокол, използван в първоначалните експерименти, съдържаше смес от термостабилни Taq и Pwo ДНК полимерази. Предишният ензим има 5′𠄳′ екзонуклеазна активност в своя N-терминален домен (26), но няма откриваема 3′𠄵′ екзонуклеазна активност (27) докато има екзонуклеазна активност (27) la&la2030203020202020202020 #x02032 екзонуклеазна активност, но се смята, че липсва 5′𠄳′ екзонуклеазна активност (28). Тъй като не е наблюдавана хетерогенна “замазана” ДНК с праймерите, когато Taq полимераза беше използвана при стандартни PCR условия, ние сметнахме, че 3′𠄵′ екзонуклеазната активност на Pwo ДНК полимеразата е от решаващо значение за MPR. Няколко 3′ екзонуклеаза плюс полимерази и техните екзонуклеаза минус производни са търговски достъпни. Вентилационната ДНК полимераза произлиза от хипертермофилната археална бактерия Thermococcus litoralis, и е конструиран неговият 3′ екзонуклеазен дефицитен мутант, Vent exo − (28). След това извършихме MPR, използвайки тези Vent wt и Vent exo − полимерази вместо смес от Taq и Pwo полимерази с праймерни двойки KY-854𯞕 (двойни несъответствия) или KY-803𯞃 (без несъответствие). MPR с тези полимерази дава подобни резултати като MPR със смес от Taq и Pwo полимерази (фиг. ​ (фиг.2 2 ° С). Праймерите без несъответстващи двойки в краищата на 3′-OH (KY-803𯞃) не произвеждат полимери в присъствието или отсъствието на 3′𠄵′ екзонуклеазната активност, потвърждавайки важността на 203&# OH крайната активност несъответствие. Комбинацията от праймери с двойни несъответствия (KY-854𯞕) и Vent (exo +) ДНК полимераза доведе до изобилно производство на хетерогенна ДНК, което показва, че Taq полимераза, която има 5′𠄳′ екзонуклеазна активност, не е непременно необходима за образуването на полимер. Неочакван резултат беше производството на полимери от комбинацията от праймери с двойни несъответствия (KY-854𯞕) и Vent (exo −) ДНК полимераза, въпреки че количеството на продуктите беше много по-малко в сравнение с това с Vent wt полимераза. Тъй като праймерните димери се образуват чрез удължаване от единия праймер, използвайки другия праймер като шаблон (25), несъответстващите 3′ краища на KY-854𯞕 трябва да бъдат отстранени чрез 3′𠄵′ екзонуклеазна активност преди екзонуклеазната активност. Ние се интересувахме от структурата на хетероложни ДНК продукти от MPR с KY-854𯞕 и Vent (exo −) и така определихме нуклеотидните последователности на тях. Полимерите са направени основно от последователности, получени от два праймера (KY-854𯞕), но са налице допълнителни нередности в последователността (един пример е показан на Фиг. ​ Фиг.2 2 д). В тези случаи димерите на праймера не са непременно повтарящи се единици, но вместо това различни по-къси последователности, които са свързани с димера на праймера, се свързват на случаен принцип. В някои случаи в последователността се наблюдават нуклеотидни последователности, които произхождат от 3′ края на два праймера, което показва, че аберантното удължаване на веригата е настъпило в MRP. В някои съединителни кръстовища един праймер изглежда се свързва директно със себе си или с димер на праймер.

От горните резултати заключихме, че факторите, които повишават ефективността на MPR са (и) съществуването на несъответстващи нуклеотиди в 3′-OH краищата на праймерите и (ii) 3′𠄵′ екзонуклеазна активност на ДНК полимераза. Ролята на несъответстващия нуклеотид при 3′-OH завършва на MPR е допълнително обсъдена по-долу.

MPR със смесени грундове увеличава молекулярното разнообразие на полимерите.

Целта на нашето изследване беше да конструираме набор от протеин-кодиращи ДНК с висока степен на молекулярно разнообразие, които могат да служат като отправна точка за инвитро експерименти за еволюция на протеини. Полимеризацията на микрогени, които имат дефицит на терминиращи кодони, е един подход за конструиране на такава библиотека. MPR може да се използва за тази цел, ако праймерите са проектирани така, че димерите на праймера да съответстват на повтаряща се единица без стоп кодон. Случайно вмъкнатите нуклеотиди или делеции в връзките променят рамката на четене на микроген във всяка повтаряща се единица и получените MPR продукти са комбинаторна библиотека, направена от 2 × 3 рамки за четене. В допълнение към това молекулярно разнообразие в резултат на превключване на рамката, ние тествахме възможността разнообразието да бъде допълнително придобито чрез използване на смес от праймери в MPR.

Първо, използвахме пет праймера в MPR вместо два. Те включват първоначалните KY-794 и KY-795 и техните три производни, чиито последователности се различават от техния родителски праймер на три позиции (фиг. ​ (фиг.3 3 А). Анализите на последователността на клонирани полимери от MPR с тези праймери разкриха, че полимерите са направени от смеси на петте праймера (един пример е показан на Фиг. ​ Фиг.3 3 А). По същия начин, праймер, който е изроден в специфични позиции, се използва за увеличаване на молекулярното разнообразие. KY-812, производно на KY-794, има две изродени позиции (фиг. ​ (фиг.3 3 Б). MPR с KY-812 и KY-795 даде полимери с две рандомизирани позиции (един пример е показан на Фиг. ​ Фиг.3 3 Б). Трябва да се отбележи, че първата дегенерирана позиция (третият нуклеотид на KY-794) има предпочитание към C (фиг. ​ (фиг.3 3 Б), докато втората дегенерирана позиция (11-тия нуклеотид на KY-794) не е имала предпочитание в този експеримент. По този начин, използването на смесени праймери или дегенерирани праймери в MPR увеличава молекулярното разнообразие на получените полимери.

MPR със смеси от грундове. (А) Пет праймера, използвани в MPR, са показани отгоре. Несъответстващите нуклеотиди са в зелено, а последователностите, които се различават между праймерите, са отделно оцветени. MPR беше извършено с Expand Taq полимеразна смес за 45 цикъла при 69ଌ за удължаване. Пример за микрогенен полимер (pYT037) е показан на дъното. Вмъкнатите нуклеотиди или изтриването (Δ) в връзките са в червено. (Б) В MPR беше използван дегенериран праймер. Ns представляват смес от A, T, G и C. MPR се провежда с Expand Taq полимеразна смес за 65 цикъла при 69ଌ за удължаване. Показан е пример за полимер (pYT020).

Дизайнерски микрогени.

Въпреки че висока степен на молекулярно разнообразие може да бъде генерирана от произволно превключване на рамката в точките на свързване и използването на смеси на праймери в MPR, ние очаквахме, че естеството на получените библиотеки ще бъде силно повлияно от избора на първоначалния микроген. За да покажем, че техниката на MPR е приложима за голямо разнообразие от микрогени, ние проектирахме два микрогена, започвайки от полипептидни последователности, открити в протеини с известна триизмерна структура и конструирани библиотеки чрез MPR. Един микроген има 42 bp и е проектиран от 14-аминокиселинен пептид, който съставлява част от навита спирала α-спирала в серил-tRNA синтетаза (29) (фиг. ​ (фиг.4 4 А). Микрогенът е проектиран така, че една рамка кодира 14-аминокиселинния полипептид, а останалите пет рамки не съдържат никакви терминиращи кодони. Вторият 66-bp микроген е проектиран от един завой на паралелен β-спирален протеин, пектатна лиаза от Erwinia chrysanthemi (32). За този микроген първо е проектирана консенсусна последователност от 22 аминокиселини от повтарящите се единици, всяка от които се състои от три β-вериги (фиг. ​ (фиг.4, 4 Б). Праймерни двойки са проектирани за тези два микрогена, така че (и) праймерните двойки могат да образуват 10 и 9 базови двойки в своите 3′ области (ii) последователностите на праймерните димери могат да пресъздадат микрогенни последователности и (iii) несъответстващи единични допълнителни нуклеотиди (А или Т) бяха добавени в техните 3′-OH краища. MPR с тези праймери и Vent wt ДНК полимераза произвежда хетероложна, размазана ДНК, както се очаква, и анализите на последователността на клонираните продукти разкриват, че микрогените са тандемно полимеризирани с нуклеотидни инсерции или делеции в връзките (Фиг. ​ (Фиг.4, 4). д и З).

Примери за дизайнерски микрогени. (А) Последователност от 14 аминокиселини се екстрахира от антипаралелната навита намотка α-спирална област на N-терминалния домен на Ешерихия коли серил-тРНК синтетаза (30). Структурата на ензима от T. thermophilus е показан (29), а съответният регион в този ензим е представен в синьо [, начертан с Rasmol (31)]. (Б) От екстрахираната последователност, микрогенът е проектиран така, че един от шестте рамки кодира екстрахираната последователност, а останалите не съдържат никакви терминиращи кодони. Шестият остатък (Val) в екстрахираната последователност трябваше да бъде променен на Glu в микрогена, за да се избегне появата на терминиращ кодон в други рамки. (° С) MPR праймерите са проектирани за микрогена. Несъответстващи нуклеотиди бяха добавени в 3′-OH края на двата праймера (в зелено). (д) Пример за микрогенен полимер (pYT071), направен от KY-859 и KY-860. MPR се провежда за 65 цикъла, като се използва Vent (exo +) ДНК полимераза. Температурата на отгряване и разширение е 63ଌ. Вмъкнатите нуклеотиди в връзките са в червено. (ЕЗ) Дизайн на микроген от паралелен β-спирален протеин, Е. хризантеми пектат лиаза Е (32) и пример за микрогенен полимер. Стратегията беше същата като за Ад, с изключение на 22-аминокиселинната последователност е консенсусна последователност, състояща се от три β-вериги.

Полимери, направени от проектирани микрогени, бяха клонирани в експресионен вектор и една рамка за четене беше преведена в E. coli. Експресираните протеини се анализират чрез SDS/PAGE. Показани са примери за 10 клона за всеки микроген (фиг. ​ (фиг.5). 5). Три клона от микрогена α-спирала и шест клона от микрогена β-вериги, чиито размери на полимерни вложки варират от 0,25 до 0,8 kb, произвеждат полипептиди с привидна молекулна маса от 15� kDa, продуктите могат да служат като източник за инвитро експерименти за еволюция на протеини. Сега анализираме физическите характеристики на полипептидите, преведени от микрогенни полимери.

SDS/PAGE на протеини от Е. coli клетки, експресиращи една четяща рамка от микрогенни полимери. (А) α-Helix микроген. (Б) β-верижен микроген. Молекулните маркери се провеждат в лента M и техните размери са показани вляво в килодалтони. Видимите ленти, които се очаква да бъдат продукти, са обозначени със зелени точки. Някои от тях (клонове 3 и 8 от А и 4, 5 и 8 от Б) бяха потвърдени, че са продукти на микроген чрез пречистването им с олигохистидин–tag (данните не са показани).


Абстрактно

Репликационното приплъзване на ДНК полимеразите е потенциален източник на спонтанни генетични пренареждания в прокариотните и еукариотните клетки. Тук показваме, че различните термостабилни ДНК полимерази претърпяват приплъзване на репликация инвитро, по време на еднокръгова репликация на едноверижен ДНК шаблон, носещ структура на фиби. Полимерази с ниска точност, като напр Thermus aquaticus (Taq), полимерази с висока точност, като напр Pyrococcus furiosus (Pfu) и силно термостабилна полимераза от Pyrococcus abyssi (Пира™ exo − ) претърпява приплъзване. Thermococcus litoralis ДНК полимеразата (Vent®) също може да се плъзга, но приплъзването може да бъде инхибирано, когато се индуцира нейната активност на изместване на веригата. Освен това, ДНК полимерази, които имат конститутивна активност на изместване на веригата, като напр Bacillus stearothermophilus ДНК полимераза (Bst), не се подхлъзвайте. Полимеразите, които се изплъзват по време на еднократна репликация, генерират делеции с фиби по време на PCR амплификация, с изключение на Vent® полимераза, тъй като нейната активност на изместване на веригата се индуцира при тези условия. Ние показваме, че тези делеции на фиби, възникващи по време на PCR, се дължат на приплъзване на репликация, а не на по-рано предложен процес, включващ полимеризация в основата на фиби.


Процесивност на полимераза

Значението на коректорската дейност за PCR е широко известно от близо две десетилетия, но друго свойство, процесността, привлече повишено внимание. &ldquoПроцесивност&rdquo е термин, който се отнася до броя на нуклеотидите, включени от полимераза в едно събитие на свързване (преди дисоциация). Taq ДНК полимеразата добавя приблизително 50 нуклеотида на събитие на свързване (8). Защо това има значение? Нископроцесивната или &ldquodistributive&rdquo полимераза разширява популацията от шаблони по забележимо различен начин от процесивната полимераза. Силно разпределената полимераза се свързва с шаблон, добавя няколко нуклеотида и се дисоциира, оставяйки популация от шаблони, които могат да бъдат разширени еднакво с времето. Силно процесивна полимераза свързва шаблон и се разширява с по-дълги събития на свързване.

От това би следвало, че при достатъчно време резултатът от процесна или разпределителна полимеразна реакция ще бъде популация от копирани шаблони. Въпреки това, при определени обстоятелства е възможно процесивната полимераза да има превъзходни характеристики. Е. coli полимераза III &alpha субединица, част от основната репликативна полимераза, има процесивност от 50 kb и 1000 nt/s (9). Терминът &ldquoeffective processivity&rdquo се използва, защото има данни, показващи, че полимеразната субединица може да обменя в реплизома, но реплизомата поддържа бърза, процесна репликация на ДНК (10).

За да се възползват от процесността в PCR, изследователите са сляли ДНК свързващ домен с археална полимераза (11). Този химерен ензим има няколко подобрени свойства, но по-специално той е в състояние да амплифицира ДНК с по-кратки времена на удължаване и да произвежда по-дълги ДНК продукти по-ефективно, като по този начин съкращава общите времена на термоциклиране. Тази идея за сливане е в основата на Q5 High-Fidelity DNA Polymerase и Phusion ® High-Fidelity DNA Polymerase, две полимерази, налични от NEB (Фигура 4).

Фигура 4: Phire Hot Start ДНК полимераза е конструирана чрез сливане на ДНК полимераза (оранжева) и малък dsDNA-свързващ протеин (жълт). Тази технология увеличава процесността на полимеразата и подобрява цялостната й производителност.


Рутинна PCR

40-60% при използване на стандартни условия и реагенти. Рутинната PCR е основен компонент от много работни процеси по молекулярна биология и като цяло е бърза, здрава и възпроизводима.

Рутинната PCR обикновено се извършва с Taq или а Taq-базирана смес от полимерази. което осигурява подобрена производителност. Тези смеси често включват коректорна полимераза, която осигурява подобрена производителност и умерено по-висока прецизност (напр. 2X) от Taq сам. В случаите, когато се изисква истинска висока точност, трябва да се използва здрава полимераза за корекция (т.е. Q5 ® ) вместо Taq смесване.

За най-добри PCR резултати, моля, следвайте препоръките, които идват с всеки ензим, и изчислете температурата на отгряване за всеки набор от праймери с помощта на калкулатора NEB Tm. За повечето рутинни PCR експерименти са необходими ограничени оптимизации за постигане на възпроизводими и стабилни резултати.

Изберете тип:

Характерни статии

Прочетете за връзката между структурата и функцията на полимеразата при копиране на ДНК.


РЕЗУЛТАТИ

Изследвахме способността на ДНК полимеразите от термофилната еубактерия Thermus aquaticus (Taq) и от термофилните археи Pyrococcus furiosus (Pfu) и Pyrococcus woesei (Pwo) за разширяване на праймер върху шаблон, съдържащ единичен дезоксиуридин. Еубактериалната Taq ДНК полимеразата успя да разшири праймера до пълната дължина, определена от шаблона. Обратно, основният продукт за удължаване на праймера, генериран от археалните ДНК полимерази, е значително по-къс (фиг. ​ (фиг.1 1 а). С еквивалентната матрица, в която дезоксиуридинът е заменен с тимидин, всички ДНК полимерази произвеждат продукти с пълна дължина без преждевременно прекъсване. За да се определи позицията, при която удължаването на праймера от археалните ДНК полимерази е спряло върху дезоксиуридиновата матрица, продуктите от реакциите се анализират чрез гел електрофореза, заедно с реакциите на секвениране на същата матрица. Основните продукти, генерирани от археалните ДНК полимерази, съответстват на прекратяване на удължаването на праймера около 4𠄶 нуклеотида преди позицията на урацила в шаблонната верига (Фиг. ​ (Фиг.1 1 б).

Реакции на удължаване на праймера на дълги разстояния върху нормални и единични урацилови шаблони. (а) Денатуриращ полиакриламиден гел, показващ продукти от реакции, при които 31-мерен праймер е удължен срещу 119-нуклеотиден шаблон (вж. Методи) съдържащ или дезоксиуридин (U), или дезокситимидин (T) 23 нуклеотида от 5′ края. Реакциите бяха проведени с ДНК полимерази от Pyrococcus furiosus (Pfu), Pyrococcus woesei (Pwo), и Thermus aquaticus (Taq). И трите полимерази произвеждат продукти с пълна дължина върху T шаблони, но археалните ензими произвеждат по-малки основни продукти върху U шаблони. (б) Полиакриламиден гел, показващ позицията на основния продукт за преждевременно прекратяване от реакцията на удължаване на праймера спрямо U шаблона с Pyrococcus furiosus ДНК полимераза (Pfu exo + ), по отношение на секвенираща стълба на сегмента на pUC19, използван в реакцията на удължаване на праймера на далечни разстояния (вж. Методи). Последователността за шаблонната верига е дадена, като се чете 3′𡤥′ отдолу (по-къси продукти за удължаване на праймера) до върха (продукти за удължаване на по-дълги праймери). Посочена е позицията на дезоксиуридина (U). Майорът Pfu продукти съответстват на прекратяване на полимеразната реакция 4𠄶 бази преди шаблона дезоксиуридин. Позицията на продукта с пълна дължина, получен от удължаване на праймера срещу Т шаблона (не е показан) е в съответствие с терминирането в края на шаблона от 119 бази.

Разстоянието от 4𠄶 нуклеотида между последния нуклеотид, включен в праймера и позицията на урацила в шаблона, подсказва за урацил-сензор, ȁпречиства” полимеразната активност в археалните ензими. За по-нататъшен анализ на значението на това разстояние, ние изградихме серия от дуплекс праймер-шаблон, в който дезоксиуридин беше поставен в шаблона между ʱ и ʷ основи надолу по веригата от дуплексния възел, и ние измерихме способността на Vent , Pfu, Pwo, Так, и Т4 ДНК полимерази за иницииране на реакции на удължаване на праймера върху тези субстрати. С дезоксиуридин, присъстващ в матрицата в първите четири позиции след дуплекса праймер-шаблон, се наблюдава минимална реакция на удължаване на праймера с археалните ДНК полимерази. При разстояния от ʵ, ʶ и ʷ между дуплексната връзка и дезоксиуридина, някои продукти за удължаване на праймера са наблюдавани с археалните ензими, съответстващи на добавяне на 1, 2 и 3 нуклеотида съответно, без практически никакви произведен продукт с пълна дължина (фиг. ​ (фиг.2). 2 ). За разлика, Taq и T4 създадоха основен продукт в цял ръст с всички тези шаблони. Отново тези резултати са в съответствие с археалните ДНК полимерази, които спират синтеза на ДНК 4𠄶 нуклеотиди нагоре по веригата на дезоксиуридин. Спирането на полимераза е много упорито инкубиране на шаблон с дезоксиуридин в позиция ⬐ с Pfu полимераза за до 1 час не доведе до значимо разчитане (фиг. ​ (фиг.3 3 а). Липсата на прекратяване се наблюдава при Taq предполага, че това свойство не присъства универсално в термофилните полимерази. По същия начин, отрицателните резултати с Т4 потвърждават, че дезоксиуридин-насоченото спиране не е общо свойство на семейството на полимераза α [, археалните полимерази и Т4 принадлежат към групата на полимераза α, докато Taq е член на семейството на полимераза I (14, 15)]. Подобен модел на удължаване на грунда се наблюдава при версиите exo + или exo − на вентилационните и Pfu полимерази, които съдържат или липсват 3′-5′ коригираща екзонуклеазна активност. Въпреки това, продукти, по-къси от оригиналния праймер, са наблюдавани с ензимите exo +, а също и с Pwo полимераза, за която е налична само формата exo +. Тези наблюдения предполагат, че за разлика от 5′-3′ полимеразната активност, 3′-5′ екзонуклеазната “rightreading” активност на археалните ензими, присъствието на дезоксиуридин е нечувствително и не е чувствително за откриване на ензими. спиране при шаблон дезоксиуридин.

Удължаване на грунд с къси разстояния. Денатуриращи полиакриламидни гелове, показващи продукти за удължаване на грунд с къси разстояния върху иначе идентични шаблони, съдържащи или без урацил (без dU), или с единична урацилова позиционирана 1𠄷 бази (dU+н) от края на дуплексната област праймер-шаблон. Първата лента (праймер) съдържа само праймерната нишка като маркер. Геловете са за следното: вентилация exo + и exo − (а), Pfu exo + и exo − (б), Pwo exo + (° С), Taq (д), и Т4 (д). Във всички случаи лентата “no dU” показва 44-мерния продукт с максимална дължина. Всички археални ензими не успяват да произведат продукт с пълна дължина върху шаблони, съдържащи урацил, но те са в състояние леко да удължат праймера, когато урацилът е 5 или повече бази отвъд края на дуплексната област. Продукти, по-къси от оригиналния праймер, присъстват в реакции, включващи ензими с функционална 3′𡤥′ екзонуклеазна активност (exo +).

Преждевременното спиране, генерирано от присъствието на шаблонна верига урацил, не е 100% и малка част от продукта с пълна дължина понякога се наблюдава с археалните ензими. Увеличаването на реакциите произвежда достатъчно от този продукт с пълна дължина за извършване на секвениране на Maxam–Gilbert, което потвърждава включването на аденин срещу шаблонния урацил, както се очаква от сдвояването на базата на Watson𠄼rick. Освен това анализът на шаблонната нишка след такова третиране разкри, че тя е непроменена. По този начин, в отговор на шаблонен дезоксиуридин, археалните полимерази не прорязват шаблонната верига, хидролизират дезоксиуридиновата гликозидна връзка, за да дадат абазичен сайт, или заменят дезоксиуридина с друга база (данните не са показани).

Обемни лезии като пиримидинови фотодимери (16) и аминофлуоренови адукти (17) или абазични места (18), ще спрат или поне ще спрат синтеза на ДНК от голямо разнообразие от полимерази. Те обаче причиняват спиране на мястото на лезията, вероятно поради лоши взаимодействия на сдвояване на бази, налични за входящия нуклеозид трифосфат. Подобен ефект наблюдаваме и при Pfu, which stalls and misincorporates nucleotides on a template containing a stable abasic site (1′,2′-dideoxyribose) (Fig. ​ (Fig.3 3 б) 10 nucleotide downstream of the primer-template duplex. In marked contrast, the equivalent template with a deoxyuridine at that position results in a shorter product (Fig. ​ (Fig.3 3 б) consistent with arrest 4𠄶 nucleotides upstream of the template strand uracil, and in agreement with the data presented in Figs. ​ Figs.1 1 and ​ and2. 2 . накрая, Pfu polymerase binds tightly and specifically to uracil-DNA, only in a single-stranded context, and not to abasic sites (Fig. ​ (Fig.4). 4 ). Thus the specific arrest of archaeal DNA synthesis elicited by template-strand uracil, characterized by stalling 4𠄶 bases upstream of the uracil and tight binding of single-stranded uracil, is qualitatively different from the nonspecific arrest of DNA polymerases in general at abasic sites. To determine whether upstream stalling was a general response to deaminated bases, a template containing inosine (the deamination product of guanine) in place of uracil was used in similar primer extension reactions it elicited no stalling and produced only full-length product (data not shown).

DNA-binding specificity of Pfu ДНК полимераза. (а) Surface plasmon resonance measurements of Pfu DNA polymerase interactions with DNA. The signal in response units (RU) is proportional to the mass of enzyme bound to the oligonucleotides immobilized on the surface of the Biacore chip. The beginning and end of injection of Pfu DNA polymerase over the chip surface are indicated by the arrows. Interactions were measured with single-stranded 35-mer oligonucleotides containing either a single uracil (ssU), a single abasic site (ssab), or no modification (ssC), and with double-stranded 35-mers containing a single U⋅G mispair (U:G) or a guanine opposite and abasic site (ab:G). Pfu polymerase interacts strongly with ssU but no other oligonucleotides. (б) Dose–response curve for binding of Pfu polymerase to ssU. Experimental data (○) were fit to the equation R = Rмакс° С/(Кд + ° С), където ° С is the protein concentration and Rмакс is the maximal response, giving an estimated Кд = 0.54 μM.


INTRODUCTION TO BACTERIAL ABC PROTEINS

I. BARRY HOLLAND , in ABC Proteins , 2003

STRUCTURE AND FUNCTION OF THE ABC TRANSPORTERS

Notably, some of the most advanced structural studies of ABC transporters have come from bacterial import and, more recently, bacterial export systems. Thus, we now have high-resolution structures for ABC importers, HisP ( Hung et al., 1998) , a MalK from Thermococcus litoralis ( Diederichs et al., 2000) , one ABC in the family of branched-chain amino acid transporters and one of unknown function ( Karpowich et al., 2001 Yuan et al., 2001) . In this laboratory, we have recently obtained the high-resolution structure of the ABC domain of HlyB (Schmitt et al., in preparation), a member of the large DPL family, which includes the mammalian TAP and Pgp (Mdr1) proteins. The implications of all these structural advances will be considered in other chapters. As discussed in Chapter 7 , a very major and exciting advance in the field was made by the presentation of the first structural data at 4.5Å for the intact bacterial exporter MsbA from Е. coli ( Chang and Roth, 2001 ). This provides the first sign of the nature of the membrane domain, and, in particular, that of the membrane-spanning domains. These are finally shown to be helices, settling some previous controversies. Most crucially, of course, this overall structure of MsbA has profound implications for at least a global understanding of how the action of the membrane and ABC domains may be coordinated. Chang and Roth (see also Higgins and Linton, 2001 ) on the basis of this structure have already proposed an exciting solution to a long-standing puzzle – how close are the ABC domains in the transporter? – that most likely they are interfaced at some point in the catalytic cycle (see also Chapter 6 ), but under the influence of the membrane domains they are well separated in the absence of any transport substrate. Unfortunately, mechanistic studies of the nature of the catalytic cycle of ABC proteins in bacteria, and its relationship to the transport function, have lagged relatively far behind those for some of the mammalian proteins. However, recent advances in purifying and reconstituting proteins of the maltose and histidine uptake systems (see Chapter 9 ), combined with the power of microbial genetics, promise much for the future.

Excitingly, as this volume goes to press the high-resolution structure of the bacterial ABC import system for vitamin B12, BtuCD, is reported (Locher et al., Science 296, 1091–1098), providing many new insights into the mechanism of ABC-dependent transport.


Taq and Pfu polymerase give different amplification - (May/04/2006 )

I try to perform get a 500bp-PCR-Product using Pfu-Polymerase. When I do the PCR with Taq-Polymerase everything works out fine. However when I use Pfu under the same condition, no product shows up. I haven't tried out any other polymerase yet.

1. Has anybody had similar problems? Има ли обяснение за това?

2. Can you recommend another polymerase with proofreading-ability?

3. Since the fragment is only 500 bp long I thought about gambling a bit: Just do several batches, use Taq and hope that one resulting fragment is a clean match. What do you think?

4. Why is there only one female in smurf village?

1. I've used severall different polymerases and they all have different optimal conditions dependant on your template and primers. The reason is that they are derived from different bacteria/archaea etc. which have different cytoplasmic concentrations of ions etc, so that's why PCR-buffers for different polymerases as well as optimal cycling conditions will be different.

2. Don't give up yet, you have the Pfu now, try playing around with annealing temp, Mg-concentration etc. Polymerases are too expensive to just throw away after one failure. If it keeps occuring: stratagene has PfuTurbo, PfuUltra and PfuUltraII (optimised versions of Pfu), invitrogen has platinum Pfx, accuprime Pfx and Pfx50, Roche has Pwo and Tgo, Finnzyme has Phusion, NEB has Vent and Deep Vent, there's probably countless others and then you still have all the "high fidelity enzyme mixes" (taq + a proofreading enzyme).

3. That might be a good idea. But, this means you would have to clone them and sequence a lot of colonies which will also be expensie (on the other hand: even if you use a proofreading enzyme: there's no guarantee that no error is incorporated, just the chances of errors are lower, but you would still need to do the cloning and sequencing, but most likely you will get a clean match after a smaller number of attempts). If you would just sequence your PCR product right away: you will very likely see a nice match, because for instance taq incorporates ONE mistake in the first cycle of PCR on just ONE of your template (at a specific position) and you started with for instance 10 template molecules, you will only see this mutation in 10% of your PCR products (assuming that this mistake will not be made a again. ), so on the electropherogram you will most likely not notice this one.

4. Smurf's are a bunch of sexists and only need women for procreation? just my 5 cents.

You can use a polymerase cocktail. I have done 10:1 Taq:Pfu. That way, you get the best of both worlds - good amplification from Taq, proof-reading from Pfu.

also, PFU has exonuclease activity. Are you adding the PFU last, on ice and perhaps doing a hostart. This will minimse degradation of your template.

acutally, origninally there were no girls in the smurf village. Gargamel created the smurfette to infiltrate the village, but she felt bad and switched sides to join the smurfs. Does anyone else think that vanity smuf may have been gay?

1. yes. Pfu is pickey. I overcame it by addng more Magnesium, and dmso. Now, with that, i can pfu to amplify things taq won't touch.

2. There are a few out there. The one's i've tried usually flop. Triplemaster seems to work ok.

3. The error rate for Taq is not that high, especially when you consider that you're product isn't that big. You could use Taw, but remember to sequence a number of colonies, just incase.

4. There are 3 female smurfs:
The first was Smurfette, who was created by a magical potion. Her list of ingredients include: "Sugar and spice but nothing nice. A dram of crocodile tears. A peck of bird brain. The tip of an adder's tongue. Half a pack of lies, white, of course. The slyness of a cat. The vanity of a peacock. The chatter of a magpie. The guile of a vixen and the disposition of a shrew. And of course the hardest stone for her heart. "
The second was Sassette. Sassette actually has the same origins as Smurfette (with a minor difference, she wasn't made by Gargamel). The smurflings (Slouchy, Nat, and Snappy) were pitying Smurfette who felt lonely, being the only girl in the village, so they decided to help her. They learned from Papa Smurf that Smurfette was indeed created magically by Gargamel out of clay. They then went to steal Gargamel's formula and magical recipes for creating Smurfette. They successfully created Sassette, who this time didn't need plastic surgery (though her rude behavior and attitude needed a bit of chemical tweaking). As they introduced Sassette to Smurfette, Smurfette was overjoyed at having a female friend, albeit a bit of a tomboy.
The last was Nanny, an old flame of Grandpa Smurf's, Nanny enters the cartoon series after being trapped inside a cursed castle for centuries. Grandpa and the others rescue her, and she makes her home with them in the village.

Wow, you can see where my interests really are.

Пс. vanity gay? never. he was just sensitive, and very handsome.

Check out your extension time and annealing temperature. Pfu polymerase activity is very slow as compared to Taq polymerase and since Pfu prefers sulphate over chloride, you would end up using probably ammonium sulphate in the buffer so you may have to reduce annealing temperature.

That female smurf history is nothing short of amazing. you should publish a review!

Cheers guys.
I never heard about differences in temperature-specifity but I rechecked annealing-temperature and extension time with a gradient-pcr and it worked.